楊小貝，陳二永，李成偉

(1.河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001)

葉片是農(nóng)作物的重要器官，在光合產(chǎn)物的積累、氣體交換、養(yǎng)分分配和水分運(yùn)輸中起著重要的作用[1]。葉片形狀會顯著影響植物的冠層蒸發(fā)散熱、日光和化學(xué)農(nóng)藥的滲透、害蟲的喜好以及作物的最終產(chǎn)量和質(zhì)量[2]。葉形的多樣性反映了自然選擇對葉片功能的篩選作用，不同葉形是了解其生態(tài)學(xué)、進(jìn)化驅(qū)動力及其功能意義的寶貴資源[3]。通過改變作物葉形而創(chuàng)制出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的作物新品種是農(nóng)作物育種需要關(guān)注的一個重要方向[4]。

棉花是世界上重要的纖維作物和油料作物，棉纖維大量應(yīng)用于紡織工業(yè)。我國作為棉花生產(chǎn)大國，棉花及其紡織產(chǎn)品在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有較大比例。棉花是喜光作物，在光照充足的條件下長勢較好，光照也是影響棉花植株生長發(fā)育和纖維品質(zhì)優(yōu)劣的重要條件之一[5]。葉片作為重要的光合器官，葉片形態(tài)在棉花品種之間存在顯著的表型差異，自然界的棉花擁有如鋸齒形、淺裂形、雞腳形、楓葉形等不同葉形。棉花葉形是影響其冠層結(jié)構(gòu)、產(chǎn)量、耐逆性和其他生產(chǎn)相關(guān)屬性的重要農(nóng)藝性狀[6]。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，一些基因在葉形發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。SlLAX1可以平衡葉片近軸和遠(yuǎn)軸細(xì)胞的生長，其突變可引起葉片卷曲表型[7]。ELI-A調(diào)控大麥葉舌的發(fā)育，ELI-A突變會引起葉鞘邊緣發(fā)育異常，產(chǎn)生無葉舌的葉片[8]。在擬南芥中過表達(dá)BRH1基因可改變?nèi)~型，降低葉片的長寬比[9]。AfLFY在煙草中過表達(dá)可以調(diào)控葉片發(fā)育，使其由圓形轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形[10]。除了基因可調(diào)控葉片發(fā)育外，miRNA對葉片發(fā)育也有顯著影響，如miRNA160單突變體擬南芥在14 d時(shí)葉片為鋸齒狀，同樣大小的miRNA165/166突變體葉片為圓形[11]。KNOX1(Class IKNOTTED1-LIKEHOMEOBOX)調(diào)控著莖頂端分生組織 (SAM)的形成和維持。KNOX1功能的維持通過其在單葉植物和復(fù)葉植物的SAM及葉原基的表達(dá)模式差異實(shí)現(xiàn)[12]。另一個KNOX1基因SHOOTMERISTEMLESS對葉開裂的形成是十分必要的，在擬南芥中缺失該基因會形成不開裂葉片[13]。杯狀子葉基因CUC1、CUC2和CUC3參與胚胎頂端分生組織的形成和子葉邊界的特化[14]。CUC2對鋸齒狀葉的發(fā)育起始是必要的，而CUC3參與葉片鋸齒狀的維持[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中MIR164A與CUC2協(xié)同調(diào)控葉緣的鋸齒狀表型[16]。LMI1(LATEMERISTEMIDENTITY1)基因是擬南芥中形成簡單鋸齒狀葉片所必需的基因，而LMI1基因的缺失導(dǎo)致了苞片的形成[17]。在十字花科中有3種LMI1-like基因，它們的過表達(dá)可以改變擬南芥的葉形和產(chǎn)生深裂葉片[18]。BnA10.LMI1正向調(diào)控甘藍(lán)型油菜裂片葉的發(fā)育[19]。在棉花中，利用基因定位獲得一個LMI1同源基因，該基因同樣編碼一個HD-Zip轉(zhuǎn)錄因子，被命名為GhLMI1-D1b，其是棉花葉片形狀變化的主要決定因素，將該基因沉默后可誘導(dǎo)葉片從雞腳葉向淺裂葉的轉(zhuǎn)變[20]。LMI1基因在種子植物中是保守的[21]，其在葉形發(fā)育中的功能研究非常值得被關(guān)注，這些研究為培育理想葉形的農(nóng)作物新品種提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

LMI1基因是控制葉形發(fā)育的關(guān)鍵基因，但是其同源基因是否均具有調(diào)節(jié)葉形的功能，以及該基因及其同源基因如何被調(diào)控而造成自然界葉形多樣性的，目前依然知之甚少。植物形態(tài)多樣性通常是由發(fā)育基因的順式調(diào)節(jié)差異和相應(yīng)的時(shí)空表達(dá)來調(diào)控的[22-23]。順式調(diào)節(jié)的差異主要展現(xiàn)在啟動子的差異上，因此，研究LMI1同源基因的功能及分析LMI1同源基因的啟動子活性對理解LMI1同源基因調(diào)控植物葉形的機(jī)理具有十分重要的意義。

本研究以具有雞腳葉表型的亞洲棉石溪亞1號為試驗(yàn)材料，通過特異性引物克隆獲得GaLMI1-like基因序列和其啟動子序列，構(gòu)建GaLMI1-like基因過表達(dá)載體p6MYC-GaLMI1-like并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，以驗(yàn)證GaLMI1-like是否具有調(diào)控葉形發(fā)育的功能。同時(shí)，對GaLMI1-like基因啟動子序列進(jìn)行順式作用元件分析，構(gòu)建GaLMI1-like啟動子GUS表達(dá)載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like并轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，經(jīng)GUS染色分析GaLMI1-like啟動子驅(qū)動基因表達(dá)的模式，為理解GaLMI1-like基因及其啟動子在調(diào)控棉花葉形方面的功能機(jī)制和培育理想株型的棉花提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試材料亞洲棉(Gossypiumarboretum)石溪亞1號、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)哥倫比亞型 (Columbia-0，Col-0)均由河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.2 菌株與載體 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α和農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌株購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；克隆載體質(zhì)粒pMDTM19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；過表達(dá)載體質(zhì)粒p6MYC與啟動子GUS表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1391均為河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.3 酶和化學(xué)試劑 限制性內(nèi)切酶 QuickCutTMKpnⅠ、QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ、高保真酶PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase均購自寶生物工程(大連)有限公司；BM2000、BM2000+與BM5000+DNA Marker購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量抽提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；GUS染色試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司；引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 棉花和擬南芥DNA的提取 取亞洲棉石溪亞1號三葉期葉片或者移栽后20 d左右的Col-0擬南芥葉片，放置于研缽中并經(jīng)液氮冷凍后用研磨棒磨成粉末，依據(jù)說明書使用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(百泰克生物技術(shù)有限公司，DP3112)進(jìn)行DNA提取，用于后續(xù)GaLMI1-like基因啟動子(簡稱pGaLMI1-like)的擴(kuò)增或轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的鑒定。

1.2.2 棉花和擬南芥RNA的提取及cDNA的合成 取亞洲棉石溪亞1號三葉期葉片或生長21 d的Col-0與GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片，液氮冷凍后研磨成粉末，使用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP441)提取上述組織的總RNA。RNA提取完成后立即使用PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，RR047A)合成cDNA，用于GaLMI1-like基因的克隆或者檢測GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥是否為陽性植株。

1.2.3GaLMI1-like基因及GaLMI1-like啟動子的擴(kuò)增 以擬南芥LMI1蛋白序列為參考，在棉花基因組網(wǎng)站COTTONGEN(https：//www.cottongen.org/)中利用BlastP同源搜索其在亞洲棉中的同源基因，將與LMI1相似性最大的基因命名為GaLMI1-like。分別以在棉花基因組中檢索到的GaLMI1-like基因及GaLMI1-like啟動子序列為參考，利用 Primer Premier 6 軟件設(shè)計(jì)以下引物。GaLMI1-like基因過表達(dá)擴(kuò)增引物為GaLMI1-like-F：5′-GGTACCTATGGATTGGAATGGCACCATT-3′，下劃線為酶切位點(diǎn)KpnⅠ；GaLMI1-like-R：5′-ACTAGTTTAGGGATAAGAAGGGAGTTG-3′，下劃線為酶切位點(diǎn)SpeⅠ。GaLMI1-like啟動子擴(kuò)增引物序列為pGaLMI1-like-F：5′-AAGCTTACACTCTGCAATCTGCATGAA-3′，下劃線表示酶切位點(diǎn)Hind Ⅲ；pGaLMI1-like-R：5′-GGATCCTTTTCTTTGAATAAAGAAAGCGA-3′，下劃線表示酶切位點(diǎn)BamH Ⅰ。以從石溪亞1號棉花提取RNA后反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板PCR擴(kuò)增GaLMI1-like基因，同時(shí)，以棉花石溪亞1號DNA為模板PCR擴(kuò)增GaLMI1-like啟動子序列。擴(kuò)增反應(yīng)體系(20 μL體系)：PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 0.2 μL；5×PrimeSTAR GXL Buffer 4 μL；cDNA/DNA 1 μL；GaLMI1-like-F/pGaLMI1-like-F(10 μmol/L)0.5 μL；GaLMI1-like-R/pGaLMI1-like-R(10 μmol/L)0.5 μL；2.5 mmol/L dNTPs 2 μL；ddH2O 11.8 μL。PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后將上述2種PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入新制的1.5%瓊脂糖凝膠中。使用電壓120 V、電流150 A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，運(yùn)行時(shí)長15 min；然后置于瓊脂糖凝膠成像儀中進(jìn)行觀測，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的條帶進(jìn)行切膠處理，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，得到的目的片段進(jìn)行加A反應(yīng)后連接到測序載體pMDTM19-T上，構(gòu)建pMDTM19-T-GaLMI1-like和pMDTM19-T-pGaLMI1-like，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α并涂布含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB平板，待長出菌斑后挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測含有正確目的條帶的單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，之后將菌液送至武漢金開瑞公司進(jìn)行測序。

1.2.4GaLMI1-like過表達(dá)載體及GaLMI1-like啟動子GUS表達(dá)載體的構(gòu)建 使用QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ酶切pMDTM19-T-GaLMI1-like重組載體，利用QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ酶切pMDTM19-T-pGaLMI1-like重組載體，瓊脂糖凝膠分離并分別回收GaLMI1-like基因和GaLMI1-like啟動子片段。將GaLMI1-like基因與經(jīng)QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ酶切線性化的p6MYC進(jìn)行連接反應(yīng)，GaLMI1-like啟動子片段與經(jīng)QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ線性化的pCAMBIA1391載體進(jìn)行連接重組，之后分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，然后進(jìn)行菌落PCR鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的陽性菌落進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒，再次用限制性內(nèi)切酶QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMHind Ⅲ和QuickCutTMBamH Ⅰ分別酶切鑒定重組載體p6MYC-GaLMI1-like和pCAMBIA1391-pGaLMI1-like，瓊脂糖凝膠電泳檢測出現(xiàn)大小正確的GaLMI1-like基因和GaLMI1-like啟動子片段后可確認(rèn)成功得到GaLMI1-like過表達(dá)載體p6MYC-GaLMI1-like與GaLMI1-like啟動子GUS載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like。

1.2.5GaLMI1-like啟動子序列分析 運(yùn)用數(shù)據(jù)庫New PLACE(https：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/？action=newplace)和PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對GaLMI1-like啟動子序列中包含的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.2.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定 p6MYC-GaLMI1-like和pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥T0植株的獲得采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘸花法[24]。收取轉(zhuǎn)基因擬南芥T0種子，經(jīng)表面滅菌消毒后均勻地播種在含有潮霉素和頭孢霉素的MS篩選培養(yǎng)基上，大約12 d后將篩選獲得的根系較長且長出2片真葉的T1幼苗移栽至營養(yǎng)土中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為了驗(yàn)證p6MYC-GaLMI1-like是否成功轉(zhuǎn)化擬南芥Col-0，提取生長21 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片RNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用半定量PCR法檢測GaLMI1-like基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中有無上調(diào)表達(dá)。半定量PCR使用的內(nèi)參基因?yàn)锳tUBQ10(At4g05320)，引物序列為AtUBQ10-F：5′-CAGAACTTTGGCCGACTAC-3′，AtUBQ10-R：5′-ATGGTCTTTCCGGTGAGAG-3′。同時(shí)，為了檢測是否獲得pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株，待轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在培養(yǎng)箱中生長30 d后，取葉片提取DNA，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株。PCR鑒定所使用的引物同載體構(gòu)建引物，即pGaLMI1-like-F與pGaLMI1-like-R。對PCR鑒定陽性的T1植株進(jìn)行收種，之后將T1種子點(diǎn)播到含有潮霉素的MS培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選以獲得T2幼苗，培養(yǎng)方式同T1，直至收獲T2種子。擬南芥培養(yǎng)條件設(shè)置為光周期16 h光照/8 h黑暗、溫度22 ℃(光照)/19 ℃(黑暗)、光照強(qiáng)度12 000 lx、濕度55%[25]。

1.2.7 GUS染色分析 取pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥種子、剛萌發(fā)的種子、萌發(fā)3 d和12 d的幼苗、生長30 d的莖生葉、花和角果等組織，依照說明書使用華越洋公司的GUS染色劑進(jìn)行組織化學(xué)染色。脫色后的組織材料使用體視顯微鏡 (AXIO Zoom.V16，Zeiss)進(jìn)行觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 GaLMI1-like蛋白結(jié)構(gòu)域及進(jìn)化分析

以擬南芥LMI1蛋白序列為參考，利用BlastP在棉花數(shù)據(jù)庫COTTONGEN(https：//www.cottongen.org/)中同源搜索其在亞洲棉中的同源基因，將與LMI1同源性最大的同源基因(Cotton_A_00507_BGI-A2_v1.0)命名為GaLMI1-like。利用SMART網(wǎng)站預(yù)測GaLMI1-like蛋白的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)其含有一個homeobox(HOX)結(jié)構(gòu)域(圖1-A)。含有HOX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)多為DNA結(jié)合因子，這類蛋白質(zhì)主要參與關(guān)鍵發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這預(yù)示著GaLMI1-like蛋白在棉花生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。利用GaLMI1-like蛋白序列在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索其同源基因，獲得其在棉花和其他物種的12種同源基因，進(jìn)一步利用MEGA 6軟件分析GaLMI1-like蛋白與其同源蛋白的進(jìn)化關(guān)系(圖1-B)，結(jié)果表明，GaLMI1-like與同物種陸地棉(Gossypiumhirsutum)中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)聚在一起，暗示陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)基因起源于亞洲棉的GaLMI1-like基因。同時(shí)結(jié)果顯示，GaLMI1-like蛋白與異源物種木槿中登錄號為XP 039051516.1的蛋白質(zhì)進(jìn)化關(guān)系較近，說明GaLMI1-like蛋白與登錄號為XP 039051516.1的蛋白質(zhì)具有相似的功能。

A.GaLMI1-like蛋白結(jié)構(gòu)域分析；B.GaLMI1-like及其同源蛋白進(jìn)化樹分析。A.The domain analysis of GaLMI1-like；B.Phylogenetic tree analysis of GaLMI1-like and its homologous proteins.

2.2GaLMI1-like基因的克隆

以從棉花基因組數(shù)據(jù)庫COTTONGEN(https://www.cottongen.org/)中獲取的GaLMI1-like基因序列為參考，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增其編碼區(qū)的特異性引物，以從亞洲棉石溪亞1號提取RNA轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增GaLMI1-like基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在681 bp左右有一條明亮條帶，與已知GaLMI1-like基因序列大小一致(圖2)。對瓊脂糖凝膠電泳顯示的明亮條帶進(jìn)行膠回收，與pMDTM19-T載體連接獲得pMDTM19-T-GaLMI1-like重組載體，測序后與GaLMI1-like基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，其與GaLMI1-like基因序列一致，說明成功克隆了GaLMI1-like基因。

M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like基因片段。M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like gene fragment.

2.3 p6MYC-GaLMI1-like載體的構(gòu)建

為了研究GaLMI1-like基因的功能，設(shè)計(jì)構(gòu)建GaLMI1-like的過表達(dá)載體。搖菌、提取質(zhì)粒后利用QuickCutTMKpnⅠ和QuickCutTMSpeⅠ對p6MYC-GaLMI1-like重組載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組載體被切割為一條680 bp左右的條帶和一條大于5 000 bp的條帶(圖3)，與預(yù)期的GaLMI1-like基因條帶和p6MYC載體條帶大小一致，說明已成功構(gòu)建GaLMI1-like基因的過表達(dá)載體p6MYC-GaLMI1-like，重組載體的結(jié)構(gòu)如圖4所示。通過凍融法將p6MYC-GaLMI1-like載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，選取鑒定正確的陽性菌株進(jìn)行搖培，甘油保種放置于-80 ℃冰箱，以備轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0使用。

M.DNA Marker；1—3.p6MYC-GaLMI1-like表達(dá)載體。M.DNA Marker；1—3.p6MYC-GaLMI1-like expression vector.

圖4 植物表達(dá)載體p6MYC-GaLMI1-like的構(gòu)建示意圖Fig.4 The construction diagram of plant expression vector p6MYC-GaLMI1-like

2.4GaLMI1-like基因功能分析

為了驗(yàn)證GaLMI1-like基因在植物生長發(fā)育中的功能，利用YEP液體搖培轉(zhuǎn)化有p6MYC-GaLMI1-like重組載體的農(nóng)桿菌GV3101，采用蘸花法轉(zhuǎn)化盛花期的擬南芥Col-0，收取轉(zhuǎn)基因T0種子，干燥7 d后將其播種于含有潮霉素和頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選獲得T1幼苗，12 d后將其移栽于營養(yǎng)土中并置于光照培養(yǎng)箱中生長。為了驗(yàn)證所篩選幼苗為陽性植株，提取21 d的擬南芥RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，半定量PCR法檢測GaLMI1-like基因在擬南芥中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5-A所示。在轉(zhuǎn)基因株系和野生型Col-0植株中內(nèi)參基因(AtUBQ10)表達(dá)量相對一致的情況下，野生型Col-0植株中并未檢測到GaLMI1-like基因的表達(dá)條帶，而3個轉(zhuǎn)基因植株均能檢測到GaLMI1-like基因的表達(dá)條帶，說明GaLMI1-like基因已經(jīng)在擬南芥中成功過表達(dá)。待生長30 d后，對3個GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株進(jìn)行表型觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片出現(xiàn)多種不同的表型。如圖5-B所示，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片表現(xiàn)出單一凹陷缺刻表型和不對稱發(fā)育表型；圖5-C顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥顯現(xiàn)出弱的對稱缺刻表型；而圖5-D中轉(zhuǎn)基因擬南芥顯現(xiàn)出強(qiáng)的對稱缺刻表型。這些結(jié)果說明，GaLMI1-like在葉片發(fā)育尤其是葉片的缺刻表型形成中具有重要作用。

A.半定量鑒定GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株；B—D.GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株表型觀察。A.Identification of GaLMI1-like transgenic Arabidopsis by semi-quantitative PCR；B—D.The phenotypic analysis of GaLMI1-like transgenic Arabidopsis.

2.5GaLMI1-like啟動子片段的克隆

用已知的GaLMI1-like基因序列檢索棉花基因組，獲取該基因起始密碼子(ATG)上游1 439 bp的序列，設(shè)計(jì)該序列特異性引物，以亞洲棉石溪亞1號基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在1 500 bp左右出現(xiàn)一條清晰明亮的條帶，大小與預(yù)期一致(圖6)。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，連接到pMDTM19-T載體獲得重組質(zhì)粒pMDTM19-T-pGaLMI1-like，之后進(jìn)行測序和序列比對，結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得的DNA序列與從棉花基因組檢索得到的序列完全一致，表明已經(jīng)成功克隆出GaLMI1-like的啟動子序列。

M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like啟動子片段。M.DNA Marker；1，2.GaLMI1-like promoter fragment.

2.6GaLMI1-like啟動子順式作用元件分析

通過啟動子在線分析工具New PLACE和PlantCARE對GaLMI1-like啟動子序列所包含的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)，該啟動子除包含基本啟動子元件CAAT-box和TATA-box[26]外，還包含光調(diào)節(jié)和光響應(yīng)元件INRNTPSADB、 G-Box、GT1-motif、部分光響應(yīng)模塊Box 4[27]、MYB結(jié)合位點(diǎn)參與光響應(yīng)元件MRE、晝夜節(jié)律控制元件Circadian、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)元件MSA-like、細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件ARR1AT以及葉肉特異表達(dá)相關(guān)原件CACTFTPPCA1、莖特異表達(dá)相關(guān)元件NODCON和根特異表達(dá)相關(guān)元件ROOTMOTIFTAPOX1。這些結(jié)果說明，該啟動子可能調(diào)控下游基因GaLMI1-like對光和晝夜節(jié)律的響應(yīng)，調(diào)控其參與細(xì)胞周期和對細(xì)胞分裂素的響應(yīng)，以及調(diào)控其在葉肉細(xì)胞、莖和根細(xì)胞中的特異表達(dá)。

表1 棉花GaLMI1-like啟動子順式作用元件分析Tab.1 Analysis of cis-acting elements of GaLMI1-like promoter in cotton

2.7 pCAMBIA1391-pGaLMI1-like載體的構(gòu)建

經(jīng)菌落PCR鑒定后，搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)一步利用QuickCutTMBamH Ⅰ和QuickCutTMHind Ⅲ對pCAMBIA1391-pGaLMI1-like重組載體進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果顯示，重組載體能夠切割出2個片段(圖7)，一條1 439 bp的條帶為pGaLMI1-like片段，另一條較大的條帶為pCAMBIA1391載體片段，與預(yù)期結(jié)果一致，說明GaLMI1-like的啟動子GUS載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like已被成功構(gòu)建，重組載體結(jié)構(gòu)如圖8所示。通過凍融法將pCAMBIA1391-pGaLMI1-like載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR 鑒定，選取鑒定正確的陽性菌株進(jìn)行搖培，甘油保種放置于-80 ℃冰箱，以備轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0使用。

M.DNA Marker；1—3.pCAMBIA1391-pGaLMI1-like表達(dá)載體。M.DNA Marker；1—3.pCAMBIA1391-pGaLMI1-like expression vector.

圖8 植物表達(dá)載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like的構(gòu)建示意圖Fig.8 The construction diagram of plant expression vector pCAMBIA1391-pGaLMI1-like

2.8 pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定

為了獲得利用GaLMI1-like啟動子驅(qū)動GUS的過表達(dá)擬南芥植株，利用蘸花法將pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)化盛花期的野生型擬南芥Col-0，成熟后收取T0種子。用含有潮霉素和頭孢霉素的MS培養(yǎng)基對T0種子進(jìn)行篩選，對篩選獲得的根系較長且長出真葉的T1幼苗進(jìn)行移栽培養(yǎng)，30 d后取T1幼苗的葉片進(jìn)行DNA提取并進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如圖9所示，轉(zhuǎn)基因陽性植株均能擴(kuò)增出1 439 bp大小的條帶，而野生型對照Col-0未擴(kuò)增出該目標(biāo)條帶。將T1陽性植株繼續(xù)培養(yǎng)并收獲T1種子；利用含有潮霉素的MS培養(yǎng)基對T1種子繼續(xù)篩選，獲得T2幼苗并培養(yǎng)收獲T2種子，為后續(xù)GUS染色分析提供試驗(yàn)材料。

M.DNA Marker；Col-0.野生型擬南芥(陰性對照)；1—5.轉(zhuǎn)基因擬南芥。M.DNA Marker；Col-0.Wild Arabidopsis (Negative control)；1—5.Transgenic Arabidopsis.

2.9GaLMI1-like啟動子功能分析

為了分析GaLMI1-like基因的啟動子功能，對pCAMBIA1391-pGaLMI1-like轉(zhuǎn)基因陽性擬南芥T2種子、剛萌發(fā)的種子、3 d的幼苗、12 d的幼苗、莖生葉、花和角果等器官采用GUS染色劑進(jìn)行組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示，GUS主要在子葉、真葉(蓮座葉)、莖生葉、莖和根的中柱中表達(dá)，而在花、角果和成熟種子中未見表達(dá)(圖10)。這說明GaLMI1-like基因的啟動子可驅(qū)動下游基因在子葉、真葉、莖生葉、莖和根的中柱中表達(dá)，其中主要在葉片中表達(dá)。

A.種子；B.剛萌發(fā)的種子；C.3 d的幼苗；D.12 d的幼苗；E、F.莖生葉；G.花；H.角果。A.Seed；B.Budding seed；C.Three days old seedling；D.Twelve days old seedling；E，F(xiàn).Stem leaf；G.Flower；H.Silique.

3 討論與結(jié)論

在植物界，葉片的類型具有廣泛的多態(tài)性，這引起了科研人員的濃厚興趣和對其背后調(diào)控機(jī)制的廣泛研究。在分子水平上，已發(fā)現(xiàn)諸多基因參與葉片的生長發(fā)育[12-14，16-17]，其中LMI1及其同源基因在葉形中的功能不容忽視[17-20]。在棉花中，通過定位發(fā)現(xiàn)，GhLMI1-D1b主要調(diào)控陸地棉中雞腳葉的形成，而陸地棉作為四倍體植物(2n=4x=52，AADD)是由二倍體A基因組棉花(2n=2x=26，AA)和二倍體D基因組棉花(2n=2x=26，DD)進(jìn)化而來的[28-29]。為解析陸地棉中來自D基因組的GhLMI1-D1b控制雞腳葉形成的原因，及陸地棉中A基因組上的GhLMI1-A能否調(diào)控雞腳葉的發(fā)育，用擬南芥LMI1序列同源比對亞洲棉基因組，將與其相似性最大的基因命名為GaLMI1-like，之后進(jìn)行功能分析。GaLMI1-like蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其含有homeobox(HOX)結(jié)構(gòu)域，這與對GhLMI1-D1b蛋白結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果是一致的。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，GaLMI1-like與陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)聚集在一起，而與D基因組棉花雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)中登錄號為XP012469169.1的蛋白質(zhì)并未完全聚集在一起。說明陸地棉中登錄號為KAG4215939.1的蛋白質(zhì)起源于A基因組亞洲棉的GaLMI1-like，同時(shí)A基因組的GaLMI1-like與D基因組的同源蛋白(登錄號為XP012469169.1)在功能上應(yīng)該具有差異性。本試驗(yàn)為了研究GaLMI1-like是否具有調(diào)控葉形發(fā)育的功能，以具有雞腳葉表型的A基因組棉花亞洲棉石溪亞1號為材料，克隆了GaLMI1-like基因，并構(gòu)建了GaLMI1-like基因的過表達(dá)載體p6MYC-GaLMI1-like，通過蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，然后通過篩選獲得陽性植株，表型觀察發(fā)現(xiàn)，與對照Col-0相比，GaLMI1-like轉(zhuǎn)基因過表達(dá)擬南芥葉片具有不對稱發(fā)育表型、凹陷單一缺刻表型和對稱缺刻表型，這些結(jié)果說明，A基因組棉花中的GaLMI1-like基因可以調(diào)控棉花葉片發(fā)育及缺刻表型的產(chǎn)生。但是，在四倍體陸地棉中雞腳葉表型主要是由D基因組的GhLMI1-D1b調(diào)控[20]，這有可能是A基因組起源的GaLMI1-like基因被抑制了表達(dá)，其中的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，BnA10.LMI1上游啟動子調(diào)控區(qū)域的變異造成其表達(dá)量的上升，進(jìn)而引起甘藍(lán)型油菜淺裂葉片的形成[19]。RCO(REDUCEDCOMPLEXITY)也是一個LMI1的同源基因，其增強(qiáng)子序列的改變引起了RCO基因表達(dá)的差異，從而調(diào)控植物產(chǎn)生不同的葉形[21]。在棉花中，GhLMI1-D1b啟動子中增加的一個串聯(lián)重復(fù)序列引起該基因表達(dá)量的上調(diào)，這也是形成雞腳葉表型的重要原因[20]。綜上所述，啟動子及其他調(diào)控序列所調(diào)控的基因表達(dá)差異是控制葉形的關(guān)鍵因素。因此，本研究以亞洲棉石溪亞1號為材料，克隆了棉花中LMI1同源基因GaLMI1-like的啟動子序列，通過分析發(fā)現(xiàn)，該啟動子序列具有多個TATA-box和CAAT-box等啟動子核心元件，說明其具有典型啟動子的特征。GaLMI1-like啟動子序列除具有典型的啟動子核心元件外，還包含許多與基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件，其中有光響應(yīng)元件G-Box、GT1-motif、INRNTPSADB，晝夜節(jié)律調(diào)控元件Circadian，莖特異表達(dá)元件NODCON，根特異表達(dá)元件ROOTMOTIFTAPOX1，部分光響應(yīng)模塊Box 4[27]，MYB結(jié)合位點(diǎn)參與光響應(yīng)元件MRE。LMI1及其同源基因的主要功能是調(diào)控葉片發(fā)育形成不同葉形[17-20]，本研究也在GaLMI1-like啟動子序列中發(fā)現(xiàn)許多發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)元件，如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)元件MSA-like、細(xì)胞分裂素響應(yīng)元件ARR1AT、葉肉特異表達(dá)元件CACTFTPPCA1，這些結(jié)果暗示，GaLMI1-like啟動子調(diào)控GaLMI1-like的時(shí)空表達(dá)進(jìn)而調(diào)控棉花的葉形。進(jìn)一步將GaLMI1-like啟動子連接到GUS報(bào)告基因載體pCAMBIA1391獲得重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-pGaLMI1-like，轉(zhuǎn)化擬南芥并篩選獲得T2材料。組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，GaLMI1-like啟動子主要驅(qū)動GUS報(bào)告基因在子葉、真葉(蓮座葉)、莖生葉、莖和根的中柱中表達(dá)，而在花、角果和成熟種子中未見表達(dá)。這些結(jié)果與對GaLMI1-like啟動子基因功能相關(guān)的調(diào)節(jié)元件分析結(jié)果是一致的。在組織化學(xué)染色結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，子葉、真葉(蓮座葉)和莖生葉中GUS染色較深，其他能夠染色的部位較淺，這與之前報(bào)道LMI1及其同源基因主要控制葉形發(fā)育的研究結(jié)果[17-20]是一致的。LMI1主要在葉片的邊緣表達(dá)，尤其是在鋸齒狀部位表達(dá)量較高[17]；LMI1的同源基因RCO主要在碎米芥的2個小葉之間的凹陷處表達(dá)[21]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的GaLMI1-like啟動子驅(qū)動GUS基因幾乎在整片葉子中表達(dá)不同。說明同源基因在表達(dá)模式上存在種屬差異性，所以需要對具體物種中LMI1基因的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行有針對性的研究。

綜上所述，利用PCR技術(shù)克隆了A基因組棉花亞洲棉石溪亞1號的GaLMI1-like基因及其啟動子序列，分析了GaLMI1-like蛋白的結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化關(guān)系，并構(gòu)建了GaLMI1-like基因的過表達(dá)載體p6MYC-GaLMI1-like，通過轉(zhuǎn)化擬南芥證實(shí)了GaLMI1-like基因具有調(diào)控葉片缺刻表型發(fā)育的功能。同時(shí)，通過在線軟件分析了該基因啟動子的順式作用元件，構(gòu)建了GaLMI1-like啟動子與GUS報(bào)告基因融合的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了模式植物擬南芥，通過GUS染色分析了GaLMI1-like基因的組織表達(dá)模式，結(jié)果顯示，GaLMI1-like啟動子可驅(qū)動下游基因在根、莖、葉中表達(dá)，且主要在葉中表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示GaLMI1-like調(diào)控棉花葉形發(fā)育的機(jī)理和利用GaLMI1-like培育理想葉型的棉花新品系奠定了基礎(chǔ)。