張晉玉，徐新娟，晁毛妮，張曉紅，吳向遠(yuǎn)，高際濤，黃中文

(河南科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

高溫、低溫、干旱、鹽漬等非生物脅迫危害植物生長(zhǎng)發(fā)育整個(gè)過(guò)程，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)[1]。由于其固著生長(zhǎng)的習(xí)性，植物已經(jīng)在生理生化和分子水平上適應(yīng)了這些脅迫，使自身在多變的環(huán)境條件下得以存活[2]。在脅迫環(huán)境下，植物通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活或抑制轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合順式作用元件調(diào)控下游抗逆基因?qū)崿F(xiàn)時(shí)空差異表達(dá)，從而抵抗不良環(huán)境。迄今為止，植物中已鑒定多個(gè)抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，包括NAC、bZIP、WRKY、AP2/ERF、MYC、bHLH和鋅指蛋白等[3-5]。

大豆作為重要的糧食和油料作物，不利的外界環(huán)境如干旱和高鹽等，對(duì)大豆生長(zhǎng)發(fā)育及高產(chǎn)具有很大威脅。因此，有必要研究大豆應(yīng)對(duì)非生物脅迫的分子機(jī)制，提高其抗逆性。本研究克隆了大豆GmZAT12基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)GmZAT12基因在大豆不同組織以及高溫、低溫、NaCl和ABA處理后的表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步研究大豆GmZAT12基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用的大豆材料為商豆1201。將大豆種植于大田，在盛花期取根、莖、葉片和花，在鼓粒期取剝?nèi)デv皮的大豆種子，用于后續(xù)RNA提取、基因克隆和組織表達(dá)分析。

1.2GmZAT12基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

采用植物總RNA提取試劑盒提取大豆RNA(Tiangen，DP432)并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴(kuò)增模板為大豆根的cDNA，上下游引物為，F(xiàn)：5′-GCTCTAGAATGAAGAGAGGCAGAGAAGAGG-3′，R：5′-CGCGGATCCAATGAAACAATTGAGGACGG-3′(下劃線(xiàn)分別代表酶切位點(diǎn)XbaⅠ和BamH Ⅰ)。采用高保真酶Phanta@ Max Super-Fidelity DNA Polymerase(諾唯贊生物科技有限公司，P505)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min。PCR膠回收產(chǎn)物和植物表達(dá)載體pCambia1305-GFP分別用XbaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，連接轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性菌液，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切并測(cè)序。

1.3GmZAT12的生物信息學(xué)分析

GmZAT12基因序列信息由Phytozome網(wǎng)站獲得，氨基酸理化性質(zhì)和潛在磷酸化位點(diǎn)使用ProtParam和NetPhos-3.1進(jìn)行預(yù)測(cè)，SOPMA網(wǎng)站分析GmZAT12蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)利用MEGA X軟件對(duì)氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.4 GmZAT12的亞細(xì)胞定位分析

在快代謝組46例中，有2例換用替格瑞洛，沒(méi)有發(fā)生心血管缺血事件；在44例繼續(xù)口服氯吡格雷的患者中，17例再發(fā)心絞痛，其中2例再次靶血管重建。

將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，之后注射煙草葉片，暗培養(yǎng)48 h；使用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM780)觀(guān)察GFP熒光在煙草葉片表皮細(xì)胞中的分布情況，以pCambia1305-GFP載體為對(duì)照。

1.5 非生物脅迫處理

取商豆1201種子種在蛭石中，人工氣候室培養(yǎng)條件為光照(28 ℃、16 h)/黑暗(24 ℃、8 h)，濕度70%，待大豆生長(zhǎng)至第一對(duì)真葉完全展開(kāi)時(shí)進(jìn)行非生物脅迫處理。將大豆苗分別轉(zhuǎn)移至40 ℃ (高溫脅迫)和8 ℃ (低溫脅迫)光照培養(yǎng)箱中，在0，2，4，8 h取大豆葉片；NaCl(300 mmol/L)和ABA(100 μmol/L)處理時(shí)間為0，2，4，8，24，48 h，取大豆根于凍存管中。液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 qRT-PCR分析

根據(jù)GmZAT12基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，RT-F：5′-AGGCAGAGAAGAGGGTGAGT-3′，RT-R：5′-CGTGATGCCACGACGAAAGA-3′；以Tubulin基因作為內(nèi)參，Tubulin-F：5′-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3′，Tubulin-R：5′-CACTTACGCATCACATAGC-3′。按照SYBR Green Master Mix(諾唯贊生物科技有限公司，Q111)說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmZAT12基因的克隆

用GmZAT12基因ID號(hào)(Glyma.13G333400)檢索大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，得到其CDS序列。以根的cDNA為模板，采用F和R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約500 bp的片段(圖1)。將PCR產(chǎn)物連接至植物表達(dá)載體pCambia1305-GFP，測(cè)序結(jié)果與大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)參考序列進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明，擴(kuò)增片段與大豆基因組參考序列一致，GmZAT12基因克隆成功。

M.Marker DL2000；1.GmZAT12。

2.2GmZAT12的生物信息學(xué)分析

利用ProtParam對(duì)GmZAT12蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，GmZAT12基因全長(zhǎng)516 bp，共編碼171個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為19.264 28 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為9.02，不穩(wěn)定系數(shù)為37.00；經(jīng)NetPhos-3.1預(yù)測(cè)，GmZAT12蛋白存在12個(gè)絲氨酸(Serine)、7個(gè)蘇氨酸(Threonine)和1個(gè)酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點(diǎn)(圖2)；通過(guò)在線(xiàn)工具SOPMA對(duì)GmZAT12蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，GmZAT12蛋白由β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和延伸鏈組成(圖3)，分別占總蛋白質(zhì)的1.75%，62.57%，21.64%和14.04%。

圖2 GmZAT12蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction for phosphorylation sites of GmZAT12 protein

圖3 GmZAT12蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.3 Secondary structure analysis of GmZAT12

將GmZAT12與其他植物物種的ZAT蛋白進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)含有2個(gè)保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域(圖4)，即GmZAT12的40—64 aa和90—113 aa。從進(jìn)化樹(shù)可以看出(圖5)，GmZAT12與GmZF1聚為一支；與玉米、水稻、高粱、苜蓿和向日葵相比，大豆和擬南芥的ZAT蛋白親緣關(guān)系更近。

GmZAT12的同源蛋白如下：大豆GmZF1(Glyma.15G040700)、GmZF2(Glyma.12G065800)和GmZAT8(Glyma.11G142500.1)；水稻OsZAT12(XP_015638278.1)和OsZFP16(AAP74357.1)；玉米ZmZAT12(XP_008654280.1)和ZmZAT8(XP_008660288.1)；擬南芥AtZAT11(AT2G37430)、AtZAT18(AT3G53600)、AtZAT12(AT5G59820)和AtZF1(At2G28710)；向日葵HaZAT11(XP_021973789.1)；番茄SlZAT11(XP_004239776.1)；苜蓿MtZAT11(XP_003621801.1)。圖5同。

圖5 GmZAT12和其他植物ZAT蛋白的進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of GmZAT12 and other plant ZAT proteins

2.3GmZAT12的組織表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)GmZAT12在大豆不同組織的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，在大豆各個(gè)組織中均能夠檢測(cè)到GmZAT12基因表達(dá)，其中，根中表達(dá)量最高，其次依次是葉片和種子，在花和莖中表達(dá)量較低(圖6)。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8—9同。Different lowercase letters indicate significant difference.The same as Fig.8—9.

2.4GmZAT12蛋白的亞細(xì)胞定位分析

將植物表達(dá)載體pCambia1305-GmZAT12-GFP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后注射煙草葉片，空載體pCambia1305-GFP為陽(yáng)性對(duì)照。激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察GFP分布情況，結(jié)果顯示，細(xì)胞核中可以檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖7)，說(shuō)明GmZAT12定位于細(xì)胞核。

1.暗場(chǎng)；2.明場(chǎng)；3.融合。1.Dark field；2.Bright field；3.Merge.

2.5GmZAT12在非生物脅迫條件下的表達(dá)分析

為了探究GmZAT12如何響應(yīng)非生物脅迫，利用qRT-PCR技術(shù)研究溫度、NaCl和ABA處理后該基因的表達(dá)變化。從圖8-A可以看出，低溫處理2 h和4 h后基因上調(diào)表達(dá)，在處理8 h后基因表達(dá)降低；與低溫脅迫不同，高溫處理2 h后基因表達(dá)微弱上調(diào)，而在處理4 h后基因的表達(dá)量最高，然后下降(圖8-B)。

圖8 不同溫度脅迫處理下GmZAT12的表達(dá)分析Fig.8 Express analysis of GmZAT12 under different temperature stress treatments

從圖9-A可以看出，NaCl處理GmZAT12基因表達(dá)量整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，處理2 h和4 h后基因表達(dá)量升高，并在處理8 h后表達(dá)量達(dá)到最高，隨后表達(dá)量降低；ABA處理后基因表達(dá)較復(fù)雜，處理后2，8，48 h后表達(dá)量相對(duì)較高，而在處理后4，24 h基因的表達(dá)量相對(duì)較低(圖9-B)。

圖9 NaCl和ABA處理后GmZAT12的表達(dá)分析Fig.9 Expression analysis of GmZAT12 under NaCl and ABA treatments

3 結(jié)論與討論

鋅指蛋白廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[6]。本研究從大豆中克隆了一個(gè)C2H2型鋅指蛋白基因GmZAT12，該基因全長(zhǎng)516 bp，編碼171個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為19.264 28 ku，pI為9.02。對(duì)該基因編碼蛋白和其他植物ZAT蛋白進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GmZAT12含有2個(gè)保守的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，GmZAT12與擬南芥AtZF1和AtZAT12親緣關(guān)系更近，推測(cè)它們可能具有相似的功能。亞細(xì)胞定位分析顯示，GmZAT12蛋白定位在細(xì)胞核，與同源蛋白AtZAT12[13]、GmZF1[14]、OsZAT12[15]定位結(jié)果一致，而GmZAT12是否具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能、下游靶基因及表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

GmZAT12在根中表達(dá)量最高，其次依次是葉片和種子，而在花和莖中表達(dá)量較低，預(yù)示該基因可能主要在根和葉片中發(fā)揮作用。C2H2型鋅指蛋白基因主要參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及多種逆境脅迫的應(yīng)答[16-17]。如大豆鋅指蛋白基因GmZFP3能夠負(fù)向調(diào)節(jié)干旱響應(yīng)[18]，野生大豆鋅指蛋白基因GsGIS3的過(guò)量表達(dá)提高了擬南芥的鋁耐受性[19]。為了探究GmZAT12對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，本研究分析了該基因在不同處理下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)GmZAT12受到高溫、低溫和NaCl誘導(dǎo)表達(dá)。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtZAT12在4 ℃以及38 ℃、NaCl處理后均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)[20]，GmZAT12呈現(xiàn)相似變化趨勢(shì)，棉花GhZAT12在NaCl處理后表達(dá)量增加[21]，推測(cè)ZAT12在不同物種中對(duì)NaCl脅迫具有相似的響應(yīng)模式。

ABA在低溫、干旱、滲透等脅迫信號(hào)途徑中具有重要的調(diào)控作用，并且誘導(dǎo)一系列非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)[22-23]，如擬南芥鋅指蛋白AZF2在ABA、干旱、NaCl處理后呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)[24-25]。然而，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，有些C2H2鋅指蛋白受到脫水、冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，但是并不響應(yīng)外源ABA[26-27]，暗示植物響應(yīng)非生物脅迫可能存在2種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，即ABA依賴(lài)途徑和ABA非依賴(lài)途徑。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高溫、低溫、NaCl處理后上調(diào)表達(dá)不同，GmZAT12在ABA處理后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)較復(fù)雜，呈現(xiàn)上升—下降—上升—下降—上升的趨勢(shì)。前人研究報(bào)道，GmZF1在ABA處理3 h和5 h表達(dá)量上升，而在處理12 h表達(dá)量下降，處理24 h后表達(dá)量再次上升[14]。因此，推測(cè)GmZAT12可能與GmZF1相似，依賴(lài)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑響應(yīng)非生物脅迫。