吳 順，馬曉靜，邱 云，孫健鵬，翟 茜，劉 奇

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410018）

0 引言

丹參(Salvia miltiorrhiza)屬唇形科鼠尾草屬，以根入藥，主要有效成分為脂溶性的丹參酮類和水溶性的丹參酚酸類，在臨床上可用于心腦血管疾病、癌癥及各種炎癥的治療[1-4]，被公認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)效益好、藥用價(jià)值高的重要中藥之一[5-6]。由于中藥市場(chǎng)近年來對(duì)丹參的需求量越來越大，但其質(zhì)量卻遠(yuǎn)未達(dá)到市場(chǎng)要求，提高丹參中生物活性成分含量已成為研究的重要目標(biāo)[7-8]。鑒于傳統(tǒng)中藥以水煎服的用藥方式，丹參水溶性成分逐漸成為近年來研究的熱點(diǎn)[9]。

藥材品質(zhì)除與品種、產(chǎn)地等有關(guān)外，其主要有效成分也會(huì)隨其生長(zhǎng)發(fā)育期的變化而發(fā)生變化[10-11]。次生代謝物質(zhì)是植物天然產(chǎn)物的主要組成部分，也是輕化產(chǎn)品、醫(yī)藥生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。然而，次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生是在初級(jí)代謝中間產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列酶催化后才會(huì)形成?，F(xiàn)有研究表明，丹參酚酸類化合物是在苯丙烷和酪氨酸2條代謝途徑共同作用下進(jìn)行生物合成的，其中，產(chǎn)生的迷迭香酸是丹酚酸B的核心前體[12]，而酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(TAT)作用催化酪氨酸生成4-羥基苯乳酸是合成迷迭香酸的重要步驟，因而被稱為迷迭香酸合成途徑中的限速酶。苯丙氨酸裂解酶(PAL)作為苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶，可催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，進(jìn)而由肉桂酸-4-羥化酶(C4H)催化形成4-香豆酸[13-18]。因此，探討這些關(guān)鍵酶活性的變化對(duì)于丹參酚酸含量的調(diào)控具有重要參考價(jià)值。

丹參作為一年生開花植物，在花序發(fā)育過程中代謝活動(dòng)會(huì)發(fā)生明顯變化，需要消耗大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使葉片加速衰老，進(jìn)而引起相關(guān)酶活性變化。目前，對(duì)丹參花期生理特性的研究鮮見報(bào)道。筆者比較丹參多倍體開花前后丹參酚酸關(guān)鍵酶活性的變化，旨在探討有效成分中間物質(zhì)與開花的關(guān)系，為進(jìn)一步調(diào)控丹參開花提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

試驗(yàn)于2019年2月在中南林業(yè)科技大學(xué)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

前期采用秋水仙堿誘導(dǎo)獲得紫花丹參四倍體，由于同源多倍化后誘發(fā)丹參基因組結(jié)構(gòu)變異（相關(guān)結(jié)果待發(fā)表），經(jīng)篩選得到了一系列變異突變體（分別標(biāo)記為2～7號(hào)，1為紫花丹參二倍體）種植于中南林業(yè)科技大學(xué)試驗(yàn)基地，分別在不同時(shí)期采集相同部位的健康葉片。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料采集 在丹參出現(xiàn)花蕾但還未露出花瓣（花蕾期）、開花盛期（盛花期）、花完全凋謝后（衰敗期）分別從丹參帶花蕾莖上部采集健康葉片若干，備用。

1.3.2 可溶性蛋白含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 酶活性的測(cè)定 材料用蒸餾水沖洗3次，擦干水分，按試驗(yàn)需要稱重后用液氮處理，并保存于-80℃冰箱。TAT和PAL酶活性參照文獻(xiàn)[20]，C4H酶活性采用肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)檢測(cè)試劑盒（比色法）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所獲得數(shù)據(jù)利用Excel 2016軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白質(zhì)含量

丹參開花前后葉片中可溶性蛋白含量如圖1所示。隨著花期的進(jìn)行，其可溶性蛋白含量先升后降，在盛花期達(dá)到峰值，這可能與丹參開花過程中表達(dá)大量開花相關(guān)蛋白有關(guān)。就不同丹參多倍體來看，5號(hào)丹參不同時(shí)期葉片內(nèi)可溶性蛋白含量都較其他高，前期研究[21]發(fā)現(xiàn)其根內(nèi)丹酚酸B含量也較其他丹參高，這可能暗示5號(hào)丹參葉片內(nèi)合成的丹參酚酸前體能較多地運(yùn)往其根內(nèi)，并轉(zhuǎn)變?yōu)樽罱K產(chǎn)物。

圖1 丹參開花前后可溶性蛋白含量的變化

2.2 TAT活性

丹參開花前后葉片中TAT活性如圖2所示。不同丹參在花蕾期TAT酶活性都比開花后高，尤其是在盛花期時(shí)酶活性明顯降低，表明開花前期的生長(zhǎng)可能有利于丹參根內(nèi)丹參酚酸類物質(zhì)前體的合成，而開花后相關(guān)前體合成減少，不利于丹參酚酸類物質(zhì)的積累。不同丹參多倍體TAT酶活性也表現(xiàn)不同。其中，5號(hào)在開花前后TAT酶活性均較高，推測(cè)其在整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間能合成較多的迷迭香酸前體，進(jìn)而合成更多的丹酚酸B。

圖2 丹參開花前后TAT酶活性的變化

2.3 PAL活性

丹參開花前后葉片中PAL活性如圖3所示。所有丹參多倍體葉片中PAL酶活性基本呈逐漸上升趨勢(shì)，但5號(hào)丹參葉片中PAL酶活性在各時(shí)期都比其他丹參多倍體高，這也可能是5號(hào)丹參根內(nèi)丹參酚酸含量較其他丹參高的原因之一。

圖3 丹參開花前后PAL活性的變化

2.4 C4H活性

丹參開花前后葉片中C4H活性如圖4所示。不同丹參多倍體葉片中C4H酶活性變化隨著花期的進(jìn)行先降低后升高，盛花期C4H酶活性降低可能與過多蛋白參與開花過程有關(guān)，同時(shí)由于大量酶底物被消耗也會(huì)降低酶活性。當(dāng)然，不同丹參多倍體的C4H酶活性在同一時(shí)期也表現(xiàn)不同，其中5號(hào)丹參在花期C4H活性較其他丹參高且變化幅度也較其他丹參小，這可能也與它能穩(wěn)定地向根內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)前體，從而較多合成丹參酚酸類物質(zhì)有關(guān)。

圖4 丹參開花前后C4H活性的變化

3 結(jié)論

葉片光合產(chǎn)物是丹參初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物中間體的主要來源。從研究結(jié)果看，不同丹參多倍體葉片內(nèi)可溶性蛋白含量與其根內(nèi)丹酚酸含量在一定程度上具有較大相關(guān)性，表明根內(nèi)酚酸類物質(zhì)的合成可能與葉內(nèi)合成的相關(guān)前體運(yùn)輸有關(guān)。

丹參開花前后葉片內(nèi)相關(guān)酶活性會(huì)發(fā)生明顯變化。就丹酚酸合成相關(guān)酶TAT、PAL、C4H來看，基本都表現(xiàn)出開花前酶活性較高，盛花期下降，而花后又逐漸上升的趨勢(shì)，表明開花對(duì)丹參次生代謝物質(zhì)的形成具有較大影響。就不同丹參多倍體來看，根內(nèi)丹酚酸含量的高低，與其葉內(nèi)相關(guān)酶活性高有關(guān)。這些研究結(jié)果的獲得，為今后進(jìn)一步對(duì)丹參花期進(jìn)行調(diào)控提供了理論依據(jù)。

4 討論

丹參是一年生開花植物，其生長(zhǎng)發(fā)育過程可分為開花前的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和開花后的生殖生長(zhǎng)，前期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的物質(zhì)積累是后期花器官形成和開花的基礎(chǔ)，然而開花也需要消耗大量營(yíng)養(yǎng)，反過來又會(huì)影響丹參的生長(zhǎng)過程，進(jìn)而影響相關(guān)酶活性及其物質(zhì)積累過程[22-23]。

丹酚酸類物質(zhì)是丹參中主要次生代謝產(chǎn)物之一，其含量是在大量初級(jí)代謝中間產(chǎn)物積累基礎(chǔ)上通過相關(guān)生物合成酶類作用下形成的[24-25]。丹酚酸類物質(zhì)含量除受環(huán)境因素影響外，還與本身所處的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期密切相關(guān)，尤其是生殖生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)物質(zhì)積累影響更為明顯。在丹參開花前，丹參生長(zhǎng)速度較快，代謝活動(dòng)旺盛，酶活性較高，次生代謝的中間產(chǎn)物不斷增加，有利于丹酚酸類物質(zhì)的積累。而進(jìn)入開花后，代謝活動(dòng)減弱，體內(nèi)貯存物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，用于次生代謝物質(zhì)的合成底物減少，酶活性降低。

根據(jù)丹參花的不同，目前有紫花丹參、白花丹參和無花丹參，相較于其他2種丹參，無花丹參中有效成分是最高的[26]，可能開花對(duì)丹參中有效成分的積累具有較大影響。因此，在丹參生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)盡量延緩花期或控制其開花具有提升有效成分積累的可能。本研究發(fā)現(xiàn)，5號(hào)多倍體丹參丹酚酸含量較高且整個(gè)花期相關(guān)酶活性也保持較高活性，表明其遺傳上相較于其他多倍體發(fā)生改變，因此，需要從遺傳和生理特性上對(duì)丹參進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步通過調(diào)控其代謝途徑提高有效成分含量和選育丹參優(yōu)良品種提供重要依據(jù)。