張 赫，萬 璐，閆佳佳，尤夢瑤，曾偉民，鄭春英

（1黑龍江大學/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

異嗪皮啶為7-羥基-6,8-二甲氧基苯并吡喃-2-酮[1]，具有抗腫瘤[2]、鎮(zhèn)靜催眠[3]、抗炎[4]、抗氧化[5]、冠脈保護[6]等作用，且無毒、口服易吸收[7]，是重要的醫(yī)藥原料中間體[8]。異嗪皮啶最先從刺五加等植物中分離得到[9]，但得率較低。隨著對異嗪皮啶研究的深入開展，采用化學合成制備異嗪皮啶的方法[10]陸續(xù)出現(xiàn)，但化學合成過程中，中間產(chǎn)物控制條件嚴格，使合成的成本和難度增大。因此，如何提高異嗪皮啶產(chǎn)率的問題一直是研究的熱點。

微生物發(fā)酵法可以大幅提高刺五加中異嗪皮啶的產(chǎn)率[11]，筆者在前期工作的基礎上[12]，選取內(nèi)生真菌AJ14為發(fā)酵菌株，該菌株分離自野生刺五加根部的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，赭曲霉可產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物[14]，并具有抗菌[15]、抗腫瘤活性[16]，是備受關(guān)注的菌株。植物內(nèi)生菌與宿主植物之間和諧共生，內(nèi)生菌會調(diào)節(jié)或誘導宿主植物已知和未知的生物合成途徑，導致宿主植物代謝發(fā)生改變[17]；反之，宿主亦會選擇內(nèi)生菌并調(diào)控其代謝[18]以適應環(huán)境。因此，采用內(nèi)生菌發(fā)酵宿主植物，會導致其次生代謝產(chǎn)物發(fā)生改變。

本研究以異嗪皮啶含量為指標，采用單因素實驗及響應面法對內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加的工藝條件進行優(yōu)選，選擇發(fā)酵時間、初始pH、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速、菌懸液加入量、底物質(zhì)量濃度為發(fā)酵因素進行探究，以期獲得內(nèi)生真菌AJ14發(fā)酵刺五加的最佳工藝參數(shù)，從而提高異嗪皮啶的利用率，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)異嗪皮啶原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生健康刺五加樣品（3年生，于黑龍江省帽兒山地區(qū)采集）；刺五加內(nèi)生真菌AJ14(Aspergillus ochraceus)由黑龍江大學生命科學學院生物制藥專業(yè)實驗室分離得到；試劑均為分析純。

PDA、PDB培養(yǎng)基配制方法參閱文獻[19]；異嗪皮啶（供含量測定用，中國藥品生物制品檢定院）。

1.2 主要儀器

FL2200型高效液相色譜儀（浙江溫嶺福立分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備 參閱文獻[20]制備1×107CFU/mL內(nèi)生真菌AJ14菌懸液。

1.3.2 異嗪皮啶含量的測定 測定采用HPLC法，條件參閱文獻[21]。

1.3.3 單因素實驗

（1）發(fā)酵時間對異嗪皮啶含量的影響。取刺五加粉（過40目篩），精密量取20 mL水，置于100 mL三角燒瓶中，按一定的比例制成0.3 g/mL的底物，pH自然，密封，滅菌(121℃，30 min)，取出，放冷，作為底物；然后加入4 mL 1.3.1項菌懸液，置于搖床(28℃，120 r/min)，分別發(fā)酵3、7、11、15、19、23、27、31天，取出，凍干(n=3)，按1.3.2項測定異嗪皮啶的含量，考察發(fā)酵時間對刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量的影響。

（2）初始pH對異嗪皮啶含量的影響。在1.3.3（1）條件基礎上，調(diào)節(jié)發(fā)酵初始pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9，搖床發(fā)酵培養(yǎng)19天，考察初始pH對刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量的影響。

（3）發(fā)酵溫度對異嗪皮啶含量的影響。在1.3.3（1）條件基礎上，設定發(fā)酵溫度分別為20、24、28、32、36℃，搖床發(fā)酵培養(yǎng)19天，考察發(fā)酵溫度對刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量的影響。

（4）搖床轉(zhuǎn)數(shù)對異嗪皮啶含量的影響。在1.3.3（1）條件基礎上，設定搖床轉(zhuǎn)速分別為100、120、140、160、180 r/min，搖床發(fā)酵培養(yǎng)19天，考察搖床轉(zhuǎn)數(shù)對刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量的影響。

（5）菌懸液加入量對異嗪皮啶含量的影響。在1.3.3（1）條件基礎上，分別加入1.3.1項菌懸液3、4、5、6、7 mL，搖床發(fā)酵培養(yǎng)19天，考察菌懸液加入量刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量的影響。

（6）底物質(zhì)量濃度對異嗪皮啶含量的影響。依次在不同的100 mL三角燒瓶中，制備底物的質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/mL，搖床發(fā)酵培養(yǎng)19天，其他條件同1.3.3（1），考察底物質(zhì)量濃度對刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量的影響。

1.3.4 響應面法實驗 在單因素實驗分析基礎上，選取pH、菌懸液加入量和發(fā)酵溫度3個因素，以異嗪皮啶含量為響應值，設計Box-Behnken因素、水平（表1）。

表1 Box-Behnken實驗設計

1.3.5 驗證實驗 根據(jù)響應面法優(yōu)選的刺五加的最佳發(fā)酵工藝條件進行3次驗證實驗，采用1.3.2法測定最佳發(fā)酵工藝中異嗪皮啶含量，建立高產(chǎn)、穩(wěn)定、可控的刺五加發(fā)酵工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對異嗪皮啶含量的影響 從圖1可知，隨著刺五加發(fā)酵時間的增長，異嗪皮啶的含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當發(fā)酵時間為3～19天時，異嗪皮啶的含量逐漸增高，并在19天時達到最大值；自此以后，異嗪皮啶的含量呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是底物中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗所致。上述結(jié)果表明，最適發(fā)酵時間為19天。

圖1 發(fā)酵時間對異嗪皮啶含量的影響

2.1.2 初始pH對異嗪皮啶含量的影響 從圖2可以看出，pH 4～9的變化范圍內(nèi)，刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶的含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當pH 7時，異嗪皮啶的含量達到最大。由此可見，酸性或堿性過強都不利于發(fā)酵刺五加中異嗪皮啶的產(chǎn)生，最適為pH 7。

圖2 初始pH對異嗪皮啶含量的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對異嗪皮啶含量的影響 由圖3可以看出，當發(fā)酵溫度在20～36℃范圍變化時，刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶的含量先隨著溫度的升高而增高，并在發(fā)酵溫度為28℃時，其異嗪皮啶含量達到最大值，此后則呈現(xiàn)下降趨勢，說明溫度增高并不適合刺五加發(fā)酵后異嗪皮啶的生物合成，故最適發(fā)酵溫度為28℃。

圖3 發(fā)酵溫度對異嗪皮啶含量的影響

2.1.4 搖床轉(zhuǎn)速對異嗪皮啶含量的影響 由圖4可見，當搖床轉(zhuǎn)速在100～180 r/min范圍時，刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶的含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當轉(zhuǎn)速為140 r/min時，異嗪皮啶的含量達到最大值，說明該條件下空氣中的氧氣與培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)能被發(fā)酵菌株充分利用。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對異嗪皮啶含量的影響

2.1.5 菌懸液加入量對異嗪皮啶含量的影響 從圖5可知，當發(fā)酵菌株菌懸液為1×107CFU/mL時，隨著菌懸液加入量的增加，刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當1×107CFU/mL菌懸液加入量為5 mL時，異嗪皮啶的含量達到最大值。說明菌懸液加入量過低或過高均不適合發(fā)酵刺五加中異嗪皮啶的生物轉(zhuǎn)化。因此，最適發(fā)酵菌株菌懸液(1×107CFU/mL)加入量為5 mL。

圖5 菌懸液加入量對異嗪皮啶含量的影響

2.1.6 底物質(zhì)量濃度對異嗪皮啶含量的影響 從圖6可以看出，底物質(zhì)量濃度為0.1～0.5 g/mL時，刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶的含量表現(xiàn)為先增高后降低，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度為0.2 g/mL時，異嗪皮啶的含量達到了最大值，說明底物質(zhì)量濃度過高或過低均不適合異嗪皮啶的產(chǎn)生，因此最適底物質(zhì)量濃度為0.2 g/mL。

圖6 底物質(zhì)量濃度對異嗪皮啶含量的影響

2.2 響應面法實驗結(jié)果

2.2.1 響應面法實驗結(jié)果與分析 在單因素實驗結(jié)果優(yōu)選的基礎上，選擇發(fā)酵菌株菌懸液(1×107CFU/mL)的加入量、初始pH、發(fā)酵溫度3個因素，以刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶的含量為響應值，進行3因素3水平的響應面優(yōu)化實驗，結(jié)果如表2所示，方差分析結(jié)果見表3。

對表2實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到異嗪皮啶(Y)對菌懸液加入量(A)、pH(B)和發(fā)酵溫度(C)3個因素的二次多項式回歸模型如式(1)。

表2 Box-Behnken實驗設計與結(jié)果

從表3可以看出，該模型F值為15.52，P值遠遠小于0.01，說明該模型極顯著，與實際實驗擬合較好。失擬項的F=4.09、P＝0.0743，即失擬不顯著，說明該方程擬合度良好，與實際情況具有相關(guān)性。由F值的大小推斷，對刺五加發(fā)酵后其異嗪皮啶含量影響效果的順序為C＞A＞B，即發(fā)酵溫度＞菌懸液加入量＞初始pH。

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 響應曲面及等高線圖 由圖7～9可以看出，3個響應曲面均為開口向下，說明響應值（異嗪皮啶含量）存在極高值，等高線形狀均接近于橢圓形，說明菌懸液加入量與pH、pH與發(fā)酵溫度、菌懸液加入量與發(fā)酵溫度的交互作用均顯著。

圖7 菌懸液加入量與pH交互作用的響應面及等高線圖

2.3 驗證實驗

通過回歸模型預測刺五加發(fā)酵高產(chǎn)異嗪皮啶的最佳條件為菌懸液(1×107CFU/mL)加入量6 mL、pH 7.5、發(fā)酵溫度27℃，在此條件下，異嗪皮啶含量理論值為0.6669 mg/g。采取上述工藝進行3次重復實驗，測得異嗪皮啶含量為(0.6629±0.0007)mg/g，比理論值接近，表明該工藝是可行的。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎上，采用響應面法對影響刺五加發(fā)酵過程中異嗪皮啶產(chǎn)率的3個重要因素（初始pH、發(fā)酵溫度、菌懸液加入量）進行了篩選。結(jié)果表明，發(fā)酵菌株AJ14菌懸液加入量、初始pH和發(fā)酵溫度對刺五加發(fā)酵過程中異嗪皮啶產(chǎn)率影響極顯著，各因素兩兩間的交互效應對異嗪皮啶含量亦有極顯著影響。本研究得到的最佳發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵菌株AJ14菌懸液(1×107CFU/mL)加入量6 mL、pH 7.5、發(fā)酵溫度27℃。上述方法穩(wěn)定性好，成本較低，可為今后采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)異嗪皮啶及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

圖8 菌懸液加入量與發(fā)酵溫度交互作用的響應面及等高線圖

圖9 pH與發(fā)酵溫度交互作用的響應面及等高線圖

4 討論

關(guān)于刺五加的發(fā)酵，大多集中在采用微生物發(fā)酵法提高刺五加中黃酮[22]、多糖[23]及刺五加苷[24]等成分含量，但作為刺五加膏的指標性成分異嗪皮啶[25]，雖有報道采用微生物發(fā)酵法提高其含量，但并未對其進行發(fā)酵工藝的優(yōu)選，而提高發(fā)酵產(chǎn)物得率的重要方法是對其發(fā)酵工藝進行優(yōu)化[26]，雖然采用單因素實驗結(jié)合正交實驗法可以對發(fā)酵工藝中的影響因子進行優(yōu)化，但正交實驗結(jié)果往往不能超過其所設計的范圍，不能進一步指明最佳發(fā)酵工藝的走向，具有一定的局限性；而微生物發(fā)酵是一種非結(jié)構(gòu)化、曲線的復雜過程[27]，響應面法通過Box-Behnken實驗設計，采用回歸方程和直觀圖形分析，合理預測響應值的最優(yōu)值[28]，在一定程度上滿足了各種工業(yè)生產(chǎn)對工藝參數(shù)的需求，現(xiàn)已成為時下研究的應用熱點，并被廣泛應用于食品[29]、醫(yī)藥[30]、化工[31]、生態(tài)學[32]等領(lǐng)域。

筆者采用單因素實驗結(jié)合響應面法對刺五加發(fā)酵工藝中重要工藝參數(shù)進行優(yōu)選，并對所篩選的工藝進行實驗驗證，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝能顯著提高發(fā)酵刺五加中異嗪皮啶的含量，在該工藝條件下，異嗪皮啶含量可達(0.6629±0.0007)mg/g，是已有工藝[12]的3倍。