趙俊雄，和祎

怒江傈僳族自治州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 瀘水 673199

中國(guó)云南滇西少數(shù)民族地區(qū)有著比較悠久的少數(shù)民族醫(yī)藥文化及傳承歷史，巖鹿乳康膠囊是基于彝族醫(yī)藥理論研究形成的經(jīng)典名方，并具有民間用藥經(jīng)驗(yàn)及臨床驗(yàn)證支持，在治療胸脅、腹脹痛及婦女乳癖方面有較為顯著的療效而被滇西少數(shù)民族廣泛使用。彝族醫(yī)藥是我國(guó)民族醫(yī)藥重要組成部分，彝族醫(yī)藥理論認(rèn)為，巖鹿乳康膠囊功效為“補(bǔ)知?jiǎng)P扎諾，且凱色土”，可益腎，活血，軟堅(jiān)散結(jié)，主要用于治療腎陽不足、氣滯血瘀等導(dǎo)致的乳腺增生癥［1］。該藥是由巖陀、鹿銜草、鹿角霜組成的一種中藥膠囊劑，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)WS-10306（ZD-0306）-2002-2011Z 僅對(duì)處方中的巖陀有效成分巖白素的含量進(jìn)行了定量控制，但未對(duì)鹿銜草有效成分進(jìn)行定量控制［2］。鹿銜草具有活血調(diào)經(jīng)、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)虛益腎等功效，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、止血、止咳的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、腎虛腰痛、腰膝無力、月經(jīng)過多、久咳勞嗽等［3］，是該藥處方中的重要組成部分，為更全面有效地控制巖鹿乳康膠囊的質(zhì)量，保證該品種用藥安全有效，本研究采用HPLC 法測(cè)定巖鹿乳康膠囊中鹿銜草的主要有效成分水晶蘭苷的含量。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器，AgilentChemStation 色譜工作站）；分析天平（梅特勒托利多電子天平XS205DU，十萬分之一）；分析天平（梅特勒托利多電子天平AE240，萬分之一）。試藥:巖鹿乳康膠囊(批號(hào)：20200602、20201203、20210201)樣品生產(chǎn)企業(yè)為云南海灃藥業(yè)有限公司；對(duì)照品為水晶蘭苷（批號(hào)：111870-202004，供含量測(cè)定用，含量以96.5%計(jì)，來源為中國(guó)食品藥品檢定研究院）。自制陰性樣品；甲醇(色譜純，德國(guó)默克)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；其他使用的試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent EclipseXDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95），流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm，進(jìn)樣量10 μL，在當(dāng)前色譜條件下理論塔板數(shù)為8 619。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性樣品溶液

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取樣品內(nèi)容物（《中國(guó)藥典》四部通則中裝量差異項(xiàng)下），先研細(xì)并充分混勻，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入純水50 mL，稱定重量，在80 ℃水浴鍋中回流提取1 h，先放冷，再稱定重量，然后用水補(bǔ)足所減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 mL，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，往殘?jiān)屑舆m量水使充分溶解，溶解后完全轉(zhuǎn)移至5 mL 容量瓶中，定容，搖勻，過濾，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取水晶蘭苷對(duì)照品10.48 mg，置100 mL 容量瓶中，加水溶解后并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 中含水晶蘭苷101.13 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL置25 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度即得每1 mL 中含水晶蘭苷4.045 2 μg 的對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 精密稱取按處方工藝不含鹿銜草的陰性樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系的考察

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下的水晶蘭苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、2.5、3、4、6 mL，分別置于25 mL 量瓶中，加水定容制成濃度分別為4.045 2、8.090 4、10.113 0、12.135 6、16.180 8、24.271 2 ug/mL 的系列對(duì)照品溶液，分別吸取上述各濃度對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下相關(guān)條件分析，記錄峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出水晶蘭苷回歸方程Y=13.975X-2.576 7（r=0.999 7，n=6）,結(jié)果表明水晶蘭苷的進(jìn)樣量在40.452～242.712 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取巖鹿乳康膠囊，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，每份分別取0.4 g，精密稱定，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果測(cè)得每粒巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的平均含量為0.12 mg，RSD=1.2%。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積，結(jié)果水晶蘭苷峰面積的RSD 值為1.37%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述色譜條件取“2.2.1”項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別在0，2，4，18，24 和30 h 分別進(jìn)樣10 μL 并測(cè)定峰面積，結(jié)果水晶蘭苷峰面積的RSD值為0.96%，說明供試品溶液室溫放置在30 h 內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批（批號(hào)：20210201）樣品6份，各約0.4 g，精密稱定，分別置于6個(gè)錐形瓶中，精密量取并加入上述錐形瓶中質(zhì)量濃度為101.13 μg/mL 的水晶蘭苷對(duì)照品溶液各1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備所需供試品溶液，分別測(cè)定供試品溶液中待測(cè)物的含量，計(jì)算并得出水晶蘭苷的平均回收率為98.78%，RSD 為 0.61%（n=6），結(jié)果詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 含量測(cè)定

按上述色譜條件，依法測(cè)定3 批樣品中水晶蘭苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 化學(xué)成分的確定

經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)得出［4-7］，黃酮類物質(zhì)是鹿銜草中的主要成分，提取純化工藝基本為醇提，但由于醇提黃酮類物質(zhì)的工藝成本較高，導(dǎo)致在工業(yè)化生產(chǎn)中不太適用。故本試驗(yàn)采用以水為溶劑提取鹿銜草中化學(xué)成分，通過方法學(xué)驗(yàn)證，其有效成分水晶蘭苷能被有效提取并分離，能達(dá)到《中國(guó)藥典》規(guī)定的鹿銜草中水晶蘭苷最低下限值［8］，所以本研究確定水晶蘭苷為指標(biāo)用于測(cè)定巖鹿乳康膠囊中鹿銜草的含量。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

為了保證水晶蘭苷的測(cè)定能有較好的靈敏度，根據(jù)高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器上測(cè)得的紫外吸收光譜圖以選擇水晶蘭苷的檢測(cè)波長(zhǎng)。以甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）為溶劑制備對(duì)照品溶液，經(jīng)檢測(cè)該溶液在235 nm 處有最大吸收，所以選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm。

3.3 流動(dòng)相的確定

水晶蘭苷是一種偏酸性化合物，經(jīng)考察在磷酸緩沖溶液條件下才能得到理想的分離效果［9］。故在流動(dòng)相的選擇與確定方面，首先采用了乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果待測(cè)成分存在分離不好的情況。當(dāng)流動(dòng)相以甲醇-0.4%磷酸水溶液（15∶85）、甲醇-0.1%磷酸水溶液（5∶95）兩種不同濃度及比例的磷酸水溶液流動(dòng)相分別進(jìn)行考察時(shí)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種流動(dòng)相的檢測(cè)結(jié)果顯示水晶蘭苷的分離效果較好，含量測(cè)定結(jié)果重復(fù)性好，基線比較平穩(wěn)，色譜峰形狀對(duì)稱，能達(dá)到《中國(guó)藥典》規(guī)定要求，然而隨著磷酸濃度的不斷增大,分離效果卻未能有明顯的改善，需充分考慮分離效果及色譜柱的PH 耐受范圍，故確定甲醇-0.1%磷酸溶液（5∶95）作為流動(dòng)相。

3.4 樣品的提取方法確定

提取溶劑選擇方面，分別考察了40%甲醇、70%甲醇、90%甲醇和水等多種溶劑，結(jié)果表明采用水作為提取溶劑時(shí)有效成分水晶蘭苷的提取效果較好且能被較好分離，故采用水為該方法的提取溶劑。最佳提取方式選擇方面，本研究曾分別考察回流提取、超聲提取兩種提取方式，有效成分水晶蘭苷的提取結(jié)果表明采用回流提取效果最佳；在回流提取溫度和時(shí)間的選擇和確定方面，經(jīng)考察多種回流溫度及時(shí)長(zhǎng),結(jié)果表明在80 ℃回流提取1 h的條件下效果最佳。

4 結(jié)論

鹿銜草含量測(cè)定項(xiàng)目在巖鹿乳康膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的缺失，導(dǎo)致該藥品的質(zhì)量不能進(jìn)行較好地控制。為使處方中鹿銜草中有效成分含量測(cè)定方法與《中國(guó)藥典》2020 年版一部中鹿銜草中水晶蘭苷的質(zhì)量控制一致，最終確定采用HPLC 法測(cè)定巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的含量，并通過了方法學(xué)驗(yàn)證，該研究方法學(xué)驗(yàn)證下的各項(xiàng)指標(biāo)都能達(dá)到定量測(cè)定的相關(guān)要求。

綜上所述，該研究方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果穩(wěn)定且可靠。因此，本方法可用于巖鹿乳康膠囊中水晶蘭苷的含量測(cè)定，以此來進(jìn)一步控制巖鹿乳康膠囊的質(zhì)量。