繆冬冬，崔芳芳，張傳紅 (南京市浦口區(qū)中醫(yī)院,江蘇 南京 211800)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)好發(fā)于老年人群，主要原因為當(dāng)身體各項功能開始下降，尤其是免疫功能使得病原感染嚴重，在這種情況下極易導(dǎo)致出現(xiàn)呼吸道感染類疾病[1-2]。而COPD作為一種較典型的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其主要癥狀表現(xiàn)為較長時間的咳嗽、咳痰以及氣促等，極大影響著患者的生活水平[3-4]。相關(guān)統(tǒng)計顯示，造成患者死亡的原因，COPD在全球排名中進入前3名[5-6]。由于COPD的病理表現(xiàn)不同，臨床上將COPD分為穩(wěn)定期與急性加重期，其中大部分患者處在穩(wěn)定期。該時期臨床表現(xiàn)較輕，各項指標(biāo)較為穩(wěn)定，而COPD急性加重期由穩(wěn)定期突然加重造成，肺功能進行性降低，具有反復(fù)性，嚴重情況下容易導(dǎo)致肺心病及呼吸衰竭，嚴重更會威脅生命[7]。因此，通過指標(biāo)觀察COPD病情發(fā)展情況有著重要意義。本研究探討COPD急性加重患者的淀粉樣蛋白A(SAA)、髓系分化因子88(MYD88)及纖維蛋白原(Fbg)相關(guān)性，旨在為COPD進展診斷中提供應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2018年11月～2019年11月于我院收治的COPD患者104例為研究對象，其中COPD穩(wěn)定期(穩(wěn)定組)患者54例、COPD急性加重期(急性加重組)患者50例，年齡24～36歲，平均年齡(29.5±5.8)歲。另隨機選取同期于本院接受體檢的健康志愿者60例為健康對照組，年齡23～34歲，平均年齡(28.5±4.4)歲。各組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

納入標(biāo)準：符合中華醫(yī)學(xué)會對COPD的診斷標(biāo)準[8]。排除標(biāo)準：①患有精神類疾病，無法配合本研究；②患有血液類疾??；③患有心血管疾病以及惡性腫瘤、高血壓、糖尿病等；④患有肝腎功能障礙等。

1.2方法

1.2.1采集血液：清晨空腹抽取5 ml靜脈血，對各組蛋白及分離淋巴細胞。使用乙二胺四乙酸二鈉鹽采取抗凝靜脈血2 ml，之后放入淋巴細胞分離液，以1 500 r/min離心進行5 min處理，采集上層淋巴細胞，使用氯化氨溶液冰浴對紅細胞破壞，然后錐蟲藍染色判定細胞活力，用含有10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)至1×106/ml。置入終濃度100 μg/ml植物血凝素，在37℃、5%CO2卵箱中進行培養(yǎng)24 h，采集上清液，-20℃環(huán)境下凍存待測。

1.2.2SAA、Fbg檢測:使用酶聯(lián)免疫吸附試驗對SAA、Fbg進行檢測，在聚苯乙烯的反應(yīng)孔內(nèi)加入使用50 mm碳酸鹽包緩沖液稀釋后抗原，進行加蓋處理之后存放24 h在4℃冰箱內(nèi)，第2天進行3次洗滌，然后拋干；將稀釋液(pH值為7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液)稀釋的待測標(biāo)本0.1 ml放入每個孔中，同時放入陽性和陰性對照標(biāo)本，存放在42℃環(huán)境中60 min，移除液體后進行3次洗滌并拋干；在每個孔中放入SAA、Fbg蛋白抗體0.1 ml，存放60 min，移除液體后進行3次洗滌并拋干；在每個孔中放入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸櫞酸)，混勻之后放入0.1 ml鄰苯二胺，進行20 min遮光，再一次放入2 mol/L H2SO40.05 ml放置在每個孔內(nèi)，終止反應(yīng)。最后使用酶標(biāo)儀檢測A450值檢測SAA、Fbg表達。

1.2.3MYD88檢測:使用Western印跡法檢測MYD88表達情況。將磷酸鹽緩沖液(PBS)對標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗60 min后清洗、顯色，對MYD88表達進行檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS21.0軟件進行方差分析及t檢驗。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性進行分析。

2 結(jié)果

2.13組間SAA表達比較:COPD穩(wěn)定組、COPD急性加重組SAA表達顯著高于健康對照組，且COPD急性加重組SAA表達高于COPD穩(wěn)定組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組間SAA表達比較

2.23組間MYD88表達比較:COPD穩(wěn)定組、COPD急性加重組MYD88表達高于健康對照組，且COPD急性加重組高于COPD穩(wěn)定組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組間MYD88表達比較

2.33組間Fbg表達比較:COPD穩(wěn)定組、COPD急性加重組Fbg表達高于健康對照組，且COPD急性加重組Fbg表達高于COPD穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組間Fbg表達比較

2.4COPD急性加重患者的SAA、MYD88、Fbg相關(guān)性:如圖1所示，在COPD急性加重患者中SAA、MYD88表達呈正相關(guān)(r=0.288,P=0.042)；COPD急性加重患者中SAA、Fbg表達呈正相關(guān)(r=0.362,P=0.001)；COPD急性加重患者中MYD88、Fbg呈正相關(guān)(r=0.324，P=0.021)。

圖1 COPD急性加重患者組織中SAA、MYD88、Fbg表達相關(guān)性

3 討論

COPD急性加重患者是日常狀況中超常惡化，在較短時間內(nèi)出現(xiàn)咳嗽、咯痰及喘氣加重等癥狀[9-10]。其中對呼吸道的感染是導(dǎo)致病情加重的主要原因之一，而引起感染是由于支氣管感染，在氣道黏膜器官腔與黏膜組織中較多藏著感染細菌，從而使炎性反應(yīng)加重[11-12]。相關(guān)研究顯示，在COPD急性加重期患者中氣道感染與全身炎性反應(yīng)較表現(xiàn)明顯，炎性反應(yīng)的嚴重程度導(dǎo)致病情的加重，尤其是當(dāng)患者年齡增加，而不良癥狀也隨著增加，且增加明顯。在臨床上COPD急性加重較為常見，患者大多患有感染及多臟器功能衰竭等不良癥狀，嚴重影響患者預(yù)后[13-14]。COPD作為異質(zhì)性疾病的一種，本研究通過檢測SAA、MYD88及纖維蛋白原表達，以期能夠更好對對COPD病情進行指導(dǎo)治療及對患者病情發(fā)展程度做出正確判斷。

人們在繼發(fā)性淀粉樣變中認識到了SAA的作用，于1976年在血清中進行分離得到鑒定，確定是一類高度較保守的急性期蛋白家族成員[15-16]。SAA在各種哺乳類動物以及禽類中較為普遍存在，作為急性相蛋白的一種，其性質(zhì)與CRP相似，是較為敏感的急性反應(yīng)蛋白[17]。當(dāng)急性感染或者出現(xiàn)炎癥加重時，SAA濃度能夠表達到正常值的1 000倍以上。在COPD中SAA水平的上升，能夠加重炎性因子反應(yīng)程度，從而影響支氣管炎癥。相關(guān)學(xué)者認為，SAA 在區(qū)分肺癌與其他癌癥中有著重要作用，可能是肺癌的潛在指標(biāo)。在對于多數(shù)疾病的診斷、治療以及后期回訪檢查等有著重要意義，原因是均參與患者炎癥防御、免疫應(yīng)答及脂質(zhì)代謝等方面。本研究顯示，SAA在COPD急性加重患者中呈高表達，再次表明了SAA對于預(yù)估炎性反應(yīng)程度及病情程度有著重要價值。

當(dāng)COPD急性加重患者發(fā)生炎性反應(yīng)時，TLR4/MYD88通路是誘發(fā)氣道炎性反應(yīng)的重要通路[18-19]。MYD88是機體內(nèi)重要轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在信號途徑中起到關(guān)鍵的作用，還通過調(diào)控細胞因子的分泌影響適應(yīng)性免疫應(yīng)答。當(dāng)炎性介質(zhì)刺激到MYD88，從而使多種炎性因子被激活，使得肺部炎性反應(yīng)加重。目前研究主要應(yīng)用基因敲除技術(shù)用以觀察在炎癥反應(yīng)中信號傳導(dǎo)作用，有關(guān)COPD信號途徑中的MYD88研究還相對較少，希望通過本研究MYD88來觀察與COPD急性加重的關(guān)系，以期能夠通過對COPD急性加重期MYD88的研究，做到預(yù)防，便于采取有效的治療措施。本研究顯示，在COPD急性加重患者中，MYD88呈高表達，說明通過檢測MYD88表達能夠預(yù)估COPD急性加重患者中肺部炎性反應(yīng)程度。

病情的逐漸加重，導(dǎo)致一系列不良影響的出現(xiàn)。凝血、止血等一系列病理及生理在COPD病情發(fā)展過程中被刺激啟動，造成肺動脈微小血栓，從而對肺動脈高壓情況加重，一系列不良癥狀隨之而來，例如呼吸衰竭、心力衰竭等，甚至?xí)＜吧黐20]。相關(guān)研究顯示，通過檢測COPD患者中的Fbg，能夠有效觀測出凝血情況[21]。當(dāng)人們對COPD的深入研究，對Fbg在凝血功能中的作用越來越重視。Fbg由肝臟與巨核細胞共同合成，是凝血因子的一種。受到炎性因子的刺激情況下，F(xiàn)bg會大量釋放到血液中，不僅在凝血過程起到作用，還能夠與血小板膜糖蛋白相結(jié)合，同時介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)，影響到對血液黏滯度。當(dāng)Fbg的水平升高不僅能為凝血過程提供酶促反應(yīng)底物，還能夠增加血液黏滯性、使得紅細胞聚集。當(dāng)血液流動性下降，血液大循環(huán)與微循環(huán)均受到影響，極易形成血栓。本研究顯示，F(xiàn)bg在COPD急性加重患者中表達較高，說明在COPD急性加重患者中通過檢測Fbg情況能夠判斷凝血情況。

綜上所述，通過對COPD中SAA、MYD88及Fbg表達檢測，更好地對COPD患者進行指導(dǎo)治療，能夠有效預(yù)估炎性反應(yīng)程度，正確判斷凝血情況，及時應(yīng)對患者病情程度發(fā)展。