凌 厲，李書鵬，張長(zhǎng)寧，桂書彥，陳立波 (.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 5805；.北京大學(xué)深圳研究生院化學(xué)生物學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 58055)

隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步和工業(yè)化時(shí)代的全面來臨，缺血性腦卒中逐漸成為目前全球范圍內(nèi)最具破壞人類健康的重大疾病[1]。缺血性腦卒中一經(jīng)發(fā)生，導(dǎo)致大腦產(chǎn)生嚴(yán)重的生理和神經(jīng)損傷，這些損傷所帶來的生理病理并發(fā)癥很大程度上取決于腦血管閉塞發(fā)生的區(qū)域及類型[2]。這種腦血管的閉塞可以是永久性的，也可以是一過性的，無論何種類型的閉塞，都會(huì)嚴(yán)重影響血流向大腦的供應(yīng)[3]，在缺乏營(yíng)養(yǎng)供給的情況下，神經(jīng)元很快經(jīng)歷了不可逆轉(zhuǎn)的凋亡壞死，神經(jīng)功能喪失[4]。腦缺血的病理生理級(jí)聯(lián)反應(yīng)已經(jīng)被廣泛認(rèn)識(shí)，常見的機(jī)制包括氧化應(yīng)激反應(yīng)[5]、毒性神經(jīng)遞質(zhì)釋放[6]、免疫炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等[7]。目前臨床中常用的治療手段只有溶栓，然而適應(yīng)證較窄和治療窗口短的特性極大地限制了溶栓藥物在臨床中的使用[8]。因此急需新的一線治療藥物。

據(jù)報(bào)道，內(nèi)源性激素的損傷與多種疾病密切相關(guān)，如癌癥[9]、心血管疾病和與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病等[10]。有文獻(xiàn)顯示腦卒中主要影響中老年人群，其機(jī)制可能與內(nèi)源性激素缺乏相關(guān)[11]，如雌激素、孕酮、褪黑素等[12]。其中褪黑素的作用備受研究者關(guān)注。隨著人類年齡的增長(zhǎng)，褪黑素表達(dá)水平下降，導(dǎo)致人類腦卒中易感性提高[13]。褪黑素的神經(jīng)保護(hù)作用可能與松果體和其他組織分泌的吲哚胺相關(guān)[14]。然而一些腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷膶?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其涉及的相關(guān)機(jī)制眾多，目前已提出來的機(jī)制包括位置鈣離子穩(wěn)態(tài)，抑制炎性反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能等[15]?？偠灾屎谒氐倪@些有益作用主要?dú)w因于其親脂特性，可以快速向大腦進(jìn)行傳輸，另一方面，褪黑素受體也在大腦中廣泛分布，與鈣調(diào)蛋白等多種胞內(nèi)蛋白相互作用，關(guān)系緊密。褪黑素與這些蛋白等結(jié)合進(jìn)一步放大了其保護(hù)效應(yīng)[16]。

過去圍繞著褪黑素參與氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制展開了大量研究，相關(guān)通路信號(hào)分子包括PI3K/Akt、增殖蛋白激酶(MAPKs),氧化應(yīng)激相關(guān)因子2 (Nrf2)等，然而針對(duì)這些作用通路的藥物研究未能轉(zhuǎn)化為有效的臨床成果，因此，褪黑素的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本文探究腦缺血過程中褪黑素通過MAPK通路參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)作用機(jī)制，闡明褪黑素對(duì)腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床中的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供有力證據(jù)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選取SD雄性大鼠，體重250～300 g，8～10周齡，分為四組，每組12只，分別為假手術(shù)組、腦缺血組[大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)手術(shù)]、褪黑素+腦缺血組(褪黑素治療組)以及褪黑素(Mela)+假手術(shù)組(褪黑素預(yù)處理組)。褪黑素治療組在腦缺血建模前給藥，以5 mg/kg劑量溶于生理鹽水中，腹腔注射。實(shí)驗(yàn)中共計(jì)7只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡，4只來自缺血組，3只來自褪黑素治療組，死亡原因包括腦水腫，血腦屏障破壞等。通過補(bǔ)充更多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以進(jìn)行調(diào)整。本研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2MCAO模型構(gòu)建：大鼠麻醉后仰臥于顯微鏡下，消毒、備皮，于頸部正中做一切口，皮下鈍性分離，沿右側(cè)胸鎖乳突肌向下找到頸動(dòng)脈，小心分離頸動(dòng)脈鞘，繼而分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，最后結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈。分離過程中注意勿觸碰迷走神經(jīng)。使用動(dòng)脈夾將頸內(nèi)動(dòng)脈夾閉并用眼科剪刀在頸總動(dòng)脈剪一小口，插入線栓并小心結(jié)扎。手術(shù)過程中檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肛溫，麻醉蘇醒后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于飼養(yǎng)室，若動(dòng)物出現(xiàn)站立不穩(wěn)提尾時(shí)轉(zhuǎn)圈等癥狀說明建模成功。建模成功24 h后取材進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.32，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色：建模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊髓離斷，心臟灌流，取腦組織，從額葉或枕葉開始連續(xù)做2 mm冠狀切片，將切片置于剛制備的2%TTC溶液中，室溫染色1 h。將切片在4%多聚甲醛中固定，拍照并測(cè)定梗死面積。

1.4HE染色：將組織切片進(jìn)行脫蠟處理，經(jīng)二甲苯處理、再用分級(jí)酒精溶液重新水化(從100%到70%，每次洗滌5～10 min)。隨后將載玻片用蒸餾水沖洗以清除殘留乙醇，并在室溫下浸泡蘇木素10 min。蒸餾水洗凈載玻片,在顯微鏡下觀察,以確保核染色，若染色未完全則增加蘇木素處理時(shí)間。使用Image J軟件對(duì)神經(jīng)元死亡和存活程度進(jìn)行分析。

1.5Western印跡：提取腦組織蛋白離心后，取上清液仔細(xì)分離。使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。調(diào)整蛋白質(zhì)樣品濃度至30 μg，電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯PVDF膜上。封閉后將 PVDF與一抗置于冰箱中過夜孵育。次日加二抗。ECL檢測(cè)試劑檢測(cè)X射線條帶。所使用的抗體包括抗-p-JNK、抗-JNK、抗-Nrf2、抗-HO-1、抗-Trx和β-actin，抗體稀釋濃度為1∶1 000。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS22.0版本版件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1褪黑素預(yù)處理對(duì)腦缺血的影響：將小鼠分為假手術(shù)組、腦缺血組和褪黑素治療組，TTC結(jié)果顯示褪黑素治療后顯著減少小鼠的腦缺血體積(P<0.05),見圖1。缺血性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷可能是由于梗死區(qū)血流量驟降和ATP供應(yīng)嚴(yán)重耗竭而導(dǎo)致的壞死，也可能是由于梗死區(qū)周圍半暗帶區(qū)的細(xì)胞凋亡所致。根據(jù)大腦位置的不同，壞死和凋亡細(xì)胞死亡之間存在廣泛的干擾，多由谷氨酸和活性氧等活性因子觸發(fā)。接下來我們選擇梗死周圍區(qū)域作為感興趣區(qū)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。HE染色顯示額葉皮質(zhì)和紋狀體的神經(jīng)元損傷程度。與假手術(shù)組相比，腦缺血組小鼠腦皮質(zhì)的神經(jīng)纖維束表現(xiàn)出明顯的異常形態(tài)特征。然而，褪黑素治療在很大程度上減輕了這種損害(P<0.05)。缺血后同側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的特征包括神經(jīng)元扇形結(jié)構(gòu)樣，伴有輕微的染色改變、空泡形成和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖2。

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.001;與腦缺血組比較，②P<0.05圖1 腦缺血組和褪黑素預(yù)處理組腦組織TTC染色及統(tǒng)計(jì)

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.001;與腦缺血組比較，②P<0.05圖2 腦缺血后皮質(zhì)區(qū)及紋狀體區(qū)HE染色和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(40×)

2.2褪黑素預(yù)處理對(duì)MCAO介導(dǎo)的MAPK-p38/p-JNK通路轉(zhuǎn)歸的影響:MCAO損傷后p-JNK和p-P38的表達(dá)高于假手術(shù)組。褪黑素預(yù)處理后MCAO介導(dǎo)的應(yīng)激相關(guān)MAPK p-P38/p-JNK通路的上調(diào)顯著下降(P<0.05)。見圖3。

注：1～4：腦缺血組、褪黑素治療組、假手術(shù)組、褪黑素預(yù)處理組

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.001,②P<0.01;與腦缺血組比較，③P<0.05圖3 皮質(zhì)和紋狀體區(qū)腦缺血后p-38,p-p38,JNK和p-JNK的表達(dá)

2.3褪黑素對(duì)內(nèi)源性抗氧化劑Nrf2/HO-1/Trx通路的作用:MCAO處理24 h后Nrf2和HO-1的表達(dá)較假手術(shù)組增高(P<0.05)。見圖4。Trx在腦缺血后表達(dá)下調(diào)，而褪黑素治療顯著恢復(fù)了Trx的表達(dá)水平。值得注意的是，沒有觀察到褪黑素治療組的Nrf2的表達(dá)水平有任何影響(P>0.05)。見圖4。

注：1～4：腦缺血組、褪黑素治療組、假手術(shù)組、褪黑素預(yù)處理組

注：與假手術(shù)組比較，①P<0.001,②P<0.01;與腦缺血組對(duì)比，③P<0.05，④P<0.01圖4 皮質(zhì)和紋狀體區(qū)腦缺血后Nrf2、HO-1和Trx的表達(dá)

3 討論

本次研究探究了內(nèi)源性神經(jīng)激素褪黑素對(duì)MCAO誘導(dǎo)的腦缺血的保護(hù)機(jī)制，是既往研究的延伸，進(jìn)一步證明了褪黑素的作用機(jī)制。本次研究主要應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，探究了褪黑素在腦缺血發(fā)生后對(duì)集中紋狀體蛋白的調(diào)節(jié)作用。褪黑素在各種病理和疾病條件下都被認(rèn)為是一種內(nèi)源性強(qiáng)抗氧化劑、自由基清除劑和內(nèi)源性抗氧化酶的調(diào)節(jié)劑[17]，早期研究報(bào)道了氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)過程的交叉互作[18]，因此，圍繞褪黑素展開的治療的目標(biāo)應(yīng)該多通過刺激抗氧化酶來調(diào)節(jié)和減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激的積累。實(shí)際上，褪黑激素與多種抗氧化系統(tǒng)的激活有關(guān)，因此有助于維持大腦內(nèi)的平衡環(huán)境[19]。特別是褪黑激素可以激活谷胱甘肽和Nrf2/HO-1通路等的研究，已被業(yè)內(nèi)廣泛熟知。此外，有研究表明褪黑激素通過激活Sirt1、Sirt3、Sirt6和其他抗氧化途徑和介質(zhì)在能量缺乏和細(xì)胞生存相關(guān)的細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[20]。研究表明，天然衍生的多酚類物質(zhì)的抗氧化作用涉及Sirt1-Nrf2通路的激活[21]。同樣，褪黑激素作為一種有效的抗氧化劑和內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)神經(jīng)激素，也可以激活Sirt1-Nrf2通路[22]。雖然氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)雖然是腦缺血過程中的重要病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，圍繞褪黑素的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)的研究也已開展多年，但在腦缺血的臨床治療中仍未得到良好的成果轉(zhuǎn)化。

首先，褪黑素的腦缺血保護(hù)作用毋庸置疑，在本次研究中也得到了驗(yàn)證。研究表明MCAO模型梗死區(qū)通常涉及紋狀體區(qū)域，神經(jīng)元的壞死大多也發(fā)生在該部位，TTC染色結(jié)果顯示該區(qū)域在腦缺血發(fā)生后呈白色，代表血流供給中斷和細(xì)胞的壞死。然而褪黑素處理后梗死區(qū)顯著降低，說明了褪黑素的潛在保護(hù)作用。以前的研究介紹了褪黑素針對(duì)腦卒中的多種保護(hù)功效，大多數(shù)圍繞其減輕活性氧自由基(ROS)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)等展開論述，多項(xiàng)腦缺血模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明褪黑素因下調(diào)核因子(NF)-κB、環(huán)氧化酶(COX)-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)而具有抗炎潛力，然而針對(duì)這些通路的臨床轉(zhuǎn)化效果不如預(yù)期，因此還需要更多的實(shí)驗(yàn)探究褪黑素參與腦缺血的作用機(jī)制。本研究中關(guān)注到褪黑素通過MAPK-p38/p-JNK信號(hào)通路參與腦缺血保護(hù)的作用機(jī)制。褪黑素可以通過下調(diào)MAPK通路信號(hào)蛋白的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)的作用。研究表明MAPK/JNK/p-38信號(hào)通路主要參與機(jī)體的炎性反應(yīng)，降低該信號(hào)通路分子的表達(dá)可以通過減少iNOS和COX2分子產(chǎn)生ROS，進(jìn)而減少腦缺血后的梗死面積。本研究結(jié)果顯示，褪黑素處理后，JNK以及p-38蛋白表達(dá)水平顯著下降，說明褪黑素可能通過該信號(hào)通路起到減少梗死體積，保護(hù)神經(jīng)功能的作用。本研究還關(guān)注了褪黑素對(duì)Trx表達(dá)的影響。Trx蛋白是一種可以調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)的關(guān)鍵作用蛋白，本文結(jié)果顯示褪黑素預(yù)處理的條件下可以顯著提高Trx的表達(dá)水平，進(jìn)一步支持了褪黑素在缺血性損傷中的抗氧化作用，補(bǔ)充了褪黑素的作用機(jī)制。

綜上所述，內(nèi)源性抗氧化劑和晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)劑褪黑素預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷有保護(hù)作用，相關(guān)機(jī)制包括對(duì)如氧化應(yīng)激相關(guān)激酶和神經(jīng)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)，補(bǔ)充內(nèi)源性抗氧化神經(jīng)激素褪黑素將通過調(diào)節(jié)將MAPK p-P38/pJNK信號(hào)通路、 Trx蛋白的表達(dá)減輕腦缺血的神經(jīng)損害。