武文濤，陳希元，王曉杰

（張家口學(xué)院，河北 張家口 075000）

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH）是一類普遍存在于農(nóng)業(yè)土壤中的有機(jī)污染物［1］，具有難自然降解、低溶解、致畸、致癌和基因毒性等特性，對環(huán)境生態(tài)安全及人類健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，如何有效修復(fù)土壤PAH污染已成為目前亟待解決的問題［2］?；钚愿迯?fù)是一種利用植物根系分泌物及其相關(guān)根際微生物降解環(huán)境污染物的生物修復(fù)策略，具有無污染、無公害、處理費(fèi)用低廉等優(yōu)勢，成為控制和修復(fù)土壤污染的最佳選擇之一［3］。

根系分泌物是植物光合作用產(chǎn)物從地上部轉(zhuǎn)移到根系從而分泌至根際的一類化合物，是介導(dǎo)根際土壤微生態(tài)的主要驅(qū)動因素［4］。根系分泌物可充當(dāng)表面活性劑，從而增加PAH溶解；同時(shí)可通過增加土壤含氧量、改善土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)、促進(jìn)土壤劫持的PAH釋放及生物利用度介導(dǎo)土壤PAH修復(fù)過程；根系分泌物還能促進(jìn)根際微生物的增殖，形成獨(dú)特的根際細(xì)菌群落［5］。一般而言，植物根系分泌物主要由有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸、酚類化合物、維生素及甾醇組成［6］，其成分可充當(dāng)根際微生物的碳源和能量來源，從而增強(qiáng)土壤中微生物生物量及其活性［7］。此外，有研究顯示紫莖澤蘭、黑麥草及水稻等植物根系分泌物可促進(jìn)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的形成，且根際細(xì)菌比非根際細(xì)菌具有更強(qiáng)的代謝能力［4］。因此，根系分泌物被認(rèn)為是PAH根部修復(fù)的潛在功能物質(zhì)。

近年來，根系分泌物對土壤污染物降解的能力及其對相關(guān)降解基因的影響已成為土壤修復(fù)新的研究熱點(diǎn)。前人研究表明，從黑麥草根系中釋放的化合物可以上調(diào)根際細(xì)菌雙加氧酶α亞基（PAH－RHDα）基因的表達(dá)水平，并介導(dǎo)土壤中PAH降解的特定功能細(xì)菌群落［8］。土壤微生物如假單胞菌屬（Pseudomonas）和諾卡氏菌屬（Nocardioides）編碼可降解PAH的相關(guān)基因［9］，基因豐度及功能菌數(shù)量是降解PAH潛力的重要表征［10］。因此，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征是影響根際微生物修復(fù)效果的關(guān)鍵因素，PAH降解基因的豐度可作為衡量根際微生物降解能力的重要指標(biāo)［9］。然而，在PAH降解過程中其降解效率與降解基因及微生物群落對根系分泌物添加的響應(yīng)特征尚不清楚?；诖?，本研究選用萘（NAP）、菲（PHE）和芘（PYR）為PAH代表物質(zhì)，以人工根系分泌物和水稻根系分泌物為外源添加劑，nidA、nahAc和phe基因用作PAH降解物的指示基因［11］，利用定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）研究PAH降解基因?qū)Ω捣置谖锏姆磻?yīng)特性，并通過高通量測序分析根系分泌物對PAH污染土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果將有助于詮釋不同根系分泌物對多環(huán)芳烴污染土壤的微生物修復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)于2021年5—6月于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院生長調(diào)控氣候室（25±1℃）中進(jìn)行。

人工根系分泌物由26.7 mmol／L葡萄糖、26.7 mmol／L果糖、26.7 mmol／L乳酸、19.8 mmol／L琥珀酸、13.3 mmol／L蔗糖、13.3 mmol／L丙氨酸、13.3 mmol／L絲氨酸、13 mmol／L檸檬酸和7.8 mmol／L谷氨酸配制而成［12］，有機(jī)碳含量為10 g／L，原液稀釋至100 mg／L，pH＝6.0。

水稻根系分泌物購自上海豐科生物農(nóng)業(yè)科技有限公司，原始濃度為258 mg／L，－70℃冷凍保存。在有機(jī)污染物降解方面表現(xiàn)出良好的性能［13］。

供試土壤取自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)場（38°79′N，115°56′E）的0～20 cm表層土壤。去除植物殘?bào)w及砂石，經(jīng)自然風(fēng)干后混勻過2 mm網(wǎng)篩備用。土壤類型為棕紅壤，其理化性質(zhì)為pH＝6.55、有機(jī)質(zhì)16.54 g／kg、全磷0.35 g／kg、堿解氮86.8 g／kg、有效磷3.92 mg／kg、速效鉀122.79 mg／kg。土壤中NAP、PHE和PYR均未檢出。

供試NAP（純度98.78%）、PHE（純度99.0%）和PYR（純度99.05%）均為常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。用蒸餾水及丙酮混合物將NAP、PHE和PYR配制成供試土壤含量分別為9.15、9.28、9.38 mg／kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)置人工根系分泌物（A）及水稻根系分泌物（B）處理，分別設(shè)置10（10）、20（20）、40（40）、80（80）mg／kg共4個(gè)水平，以施用相同體積蒸餾水為對照（CK），共9個(gè)處理，重復(fù)8次。

采用棕色圓柱形聚乙烯塑料瓶（3cm×3 cm×6 cm）裝土0.5 kg，用蒸餾水維持土壤含水量在田間持水量的60%。土壤樣品在70%相對濕度的氣候室中培養(yǎng)。在培養(yǎng)第14、28天每處理取3次重復(fù)樣品用于試驗(yàn)分析。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 土壤中多環(huán)芳烴濃度測定 培養(yǎng)結(jié)束后，將土壤樣品在FDU－2110真空冷凍干燥機(jī)干燥24 h，分析前將土壤過0.15 mm標(biāo)準(zhǔn)篩，保存于－20℃待測。

采用超聲波輔助溶劑萃取技術(shù)從土壤樣品中提取多環(huán)芳烴，具體參照Wang等［14］的方法。將土壤樣品采用10 mL正己烷和二氯甲烷（V∶V＝1∶1）超聲處理3次，每次30 min，離心并通過硅膠柱分離，隨后用10 mL二氯甲烷洗脫。將樣品蒸發(fā)并用1 mL甲醇溶解。配備紫外和熒光檢測器的高效液相色譜（Shimadzu，Tokyo，Japan）用于分析通過0.22μm過濾器的PAH溶液。HPLC配備Φ4.6 mm×250 mm反相C18小柱，使用甲醇和超純水作為流動相，流速為1 mL／min。色譜分析在40℃下進(jìn)行，進(jìn)樣量為20μL，采用外標(biāo)法確定NAP、PHE和PYR濃度。

1.3.2 土壤DNA提取及qRT－PCR分析 稱取新鮮土壤樣品250 mg，采用PowerSoil脫氧核糖核酸分離試劑盒 （MoBio Laboratories，Carlsbad，USA）提取gDNA。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測其純度與濃度。使用QS3（Thermo，Waltham，CA，USA）系統(tǒng)擴(kuò)增16S rRNA基因和PAH降解基因（nidA、nahAc、phe，表1）。使用SYBR GREEN PCR Master Mix（Toyobo，Osaka，Japan）和Bio－Rad CFX96實(shí)時(shí)檢測系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測。

表1 引物序列

qRT－PCR反應(yīng)體系：10.0μL AceQ－qPCR SYBR Green Master混合物（Vazyme，南京，中國）、ddH2O 1.0μL、gDNA模板0.5μL、正、反向引物各0.4μL。qRT－PCR反應(yīng)步驟：95℃10 min；95℃15 s，55℃30 s，72℃35 s，循環(huán)40次；95℃2 min，55℃30 s，95℃30 s。實(shí)時(shí)熒光定量PCR由StepOnePlus Real－Time PCR儀完成。

1.3.3 微生物群落的高通量測序 （1）土壤細(xì)菌DNA的提取：土壤細(xì)菌DNA采用E.Z.N.A?Mag－Bind Soil DNA Kit（OMEGA）試劑盒進(jìn)行提取。利用Qubit 3.0檢測試劑盒對基因組DNA精確定量。采用338F（5′－ACTCCTACGGGAGGCAGCAG－3′），806R（5′－GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3′）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3－V4區(qū)間。具體反應(yīng)體系及步驟參照陳海念［15］的方法。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

（2）DNA純化及Illumina－MiSeq測序：對于擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍磁珠（VAHTS TM DNA Clean Beads）處理。利用Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA進(jìn)行精確定量，每個(gè)樣品DNA量取10 ng，利用Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序。

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)CASAVA堿基識別（Base Calling）分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Sequenced Reads），結(jié)果以FASTQ（.fq）文件格式存儲。使用FLASH軟件對測序有效數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接。使用Usearch軟件，根據(jù)97%相似度對序列進(jìn)行操作分類單元聚類［16］。利用RDP對每條序列與Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123）比對進(jìn)行物種分類注釋，設(shè)置置信度閾值為70%，得到每條序列從門到屬的分類信息，基于分類學(xué)信息，在逐級分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析［17］。利用Mothur軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)生物樣本的Chao 1和Shannon多樣性指數(shù)［15］。以上分析委托上海派森諾生物科技股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），采用鄧肯氏多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用R語言、Origin 2018進(jìn)行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對土壤中多環(huán)芳烴降解的影響

由圖1可知，添加10、20、40、80 mg／kg人工根系分泌物和水稻根系分泌物皆有效促進(jìn)了土壤中NAP、PHE和PYR的降解，整體來看，降解率隨著根系分泌物濃度的增加呈先上升后降低趨勢。人工根系分泌物處理中，與CK處理相比，培養(yǎng)28 d時(shí)NAP、PHE和PYR的平均降解率分別顯著提高41.08%、68.32%和65.67%（P<0.05），NAP、PYR的降解率以40 mg／kg濃度處理最高，較CK處理分別顯著提高20.77%、30.54%；PHE降解率14 d以40 mg／kg處理最高，28 d以80 mg／kg處理最高，分別比CK顯著提高26.16%、38.92%。

圖1 不同根系分泌物處理下土壤樣品中萘（NAP）、菲（PHE）和芘（PYR）的降解率

水稻根系分泌物處理培養(yǎng)28 d時(shí)，NAP、PHE和PYR平均降解率較CK處理分別顯著增加46.27%、91.80%和60.52%。當(dāng)水稻根系分泌物的濃度從CK（0 mg／kg）增加到40 mg／kg時(shí)，NAP、PHE和PYR 的降解率分別從52.72%、38.02%和40.88%提高到85.16%、78.26%和78.36%；當(dāng)根系分泌物濃度增加至80 mg／kg時(shí)，NAP、PHE和PYR的降解率分別下降至60.55%、61.26%和58.98%。

2.2 根系分泌物對土壤16S rRNA和PAH降解基因豐度的影響

由圖2可知，與CK處理相比，添加人工和水稻根系分泌物皆降低了16S rRNA的基因拷貝數(shù)。人工根系分泌物處理中，培養(yǎng)14 d和28 d皆增加土壤中nidA、nahAc和phe的豐度，最大拷貝數(shù)分別達(dá)66.46×106、13.48×104和20.56×106，與CK處理相比，分別顯著增加3.10、2.27、1.35倍。水稻根系分泌物處理中，培養(yǎng)14 d和28 d皆顯著提高土壤中nahAc和phe的豐度，最高分別達(dá)55.55×104和24.31×106，比CK處理顯著增加12.45倍和1.99倍；但nidA的豐度低于CK處理。

圖2 不同根系分泌物對土壤16SrRNA和相關(guān)降解基因絕對豐度的影響

2.3 根系分泌物對污染土壤中細(xì)菌Alpha多樣性的影響

基于高通量測序結(jié)果，從30（10×3）個(gè)樣本中共獲得2 036 692條細(xì)菌16S rRNA基因序列。Alpha多樣性用于評估細(xì)菌多樣性（Shannon）和豐富度（Chao 1）在培養(yǎng)過程中的變化。如圖3所示，在OTU、Chao 1和Shannon指數(shù)中，人工根系分泌物（A）及水稻根系分泌物（B）在培養(yǎng)第14 d均高于CK處理，但在培養(yǎng)第28 d均低于CK處理，表明細(xì)菌的多樣性和豐富度在培養(yǎng)過程中處于動態(tài)變化。在培養(yǎng)28 d的水稻分泌物處理中，10、80 mg／kg濃度處理下的OTU、Chao 1和Shannon指數(shù)皆顯著低于CK處理，對細(xì)菌多樣性和豐富度的影響大于添加人工根系分泌物。

圖3 不同根系分泌物對污染土壤中細(xì)菌Alpha多樣性的影響

2.4 根系分泌物對污染土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可知，所有土壤樣品中細(xì)菌共確定10個(gè)門，CK處理和根系分泌物處理中優(yōu)勢細(xì)菌門相同，均為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），其相對豐度CK處理分別為30.36% ～30.53%、28.08% ～29.34%、15.87% ～16.69%和9.89%～10.50%，兩種根系分泌物處理分別為25.18%～40.15%、11.45%～37.24%、7.52%～17.89%和7.49%～20.44%。

圖4 不同根系分泌物對污染土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響（門水平）

2.5 根系分泌物對污染土壤中細(xì)菌群落聚類及分布的影響

如圖5所示，CK處理、人工根系分泌物（A）、水稻根系分泌物（B）的前50個(gè)屬熱圖的細(xì)菌群落在屬水平組成上存在一定差異。培養(yǎng)第14 d，CK處理、人工根系分泌物、水稻根系分泌物皆以芽單胞菌屬（Gemmatimonas，5.64% ～9.99%）、Gp6（7.14% ～9.31%）、Betaproteobacteria＿unclassified（5.18% ～6.69%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，4.53% ～4.96%）和Gp4（3.60%～4.34%）為優(yōu)勢屬。28 d時(shí)CK處理的優(yōu)勢屬為Gp6（8.10%）、放線菌屬（Actinophytocola，6.95%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，5.62%）、Rhizobiale s＿unclassified（5.02%）和Deltaproteobacteria＿unclassified（4.03%）；Chloroflexi＿unclassified（5.72%～10.24%）、Streptomycetaceae＿unclassified（5.62% ～7.13%）、Actinomycetales＿unclassified（4.06%～7.11%）、紅桿菌屬（Solirubrobacter，3.49% ～5.49%）和Actinobacteria＿unclassified（2.33%～4.78%）是根系分泌物處理群落中的優(yōu)勢菌屬。

圖5 不同根系分泌物處理屬水平的相對豐度熱圖

在前50個(gè)細(xì)菌屬中，14個(gè)細(xì)菌屬已被報(bào)道為PAH 降 解 功 能 細(xì) 菌［10，18］，包 括 芽 單 胞 菌 屬（Gemmatimonas，5.64% ～10.24%）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，2.84% ～4.95%）、諾卡氏屬（Nocardioides，0.70% ～3.79%）、溶桿菌屬（Lysobacter，0.92%～2.29%）、Actinomycetales＿unclassified（0.54% ～2.33%）、Sphingomonadaceae＿unclassified（0.51% ～1.71%）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter，0.15% ～1.23%）、分支桿菌屬（Mycobacterium，0.14% ～1.29%）、Burkholderiales＿unclassified（0.53% ～0.87%）、鞘脂菌屬（Sphingobium，0.12% ～1.13%）、假單胞菌屬（Pseudomonas，0.07%～3.52%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，0.22% ～0.95%）、黃單胞菌屬（Luteimonas，0.24%～0.82%）、Rhodocyclaceae＿unclassified（0.26%～0.86%），該14屬主要隸屬于芽單胞菌門（Gemmatimonas）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。

在第14 d，與CK處理相比，10 mg／kg和80 mg／kg人工根系分泌物處理（A）均顯著增加了鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類諾卡氏屬（Nocardioides）、Sphingomonadaceae＿unclassified和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的相對豐度，其最高值均出現(xiàn)在80 mg／kg濃度下，分別占總細(xì)菌群落豐度的4.92%、3.79%、1.71%和1.23%。與CK、B10處理相比，80 mg／kg水稻根系分泌物處理（B）顯著增加了假單胞菌屬（Pseudomonas）和Rhodocyclaceae＿unclassified的相對豐度。

在第28 d，與CK處理相比，添加10 mg／kg和80 mg／kg的人工根系分泌物顯著增加了類諾卡氏屬（Nocardioides）、Actinomycetales＿unclassified、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度，分別顯著提高55.66%、69.81%，39.60%、56.38%，1.00、2.91倍，63.29%、29.11%和78.47%、29.11%。類諾卡氏屬（Nocardioides）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）的相對豐度最高值出現(xiàn)在80 mg／kg處理，分別占細(xì)菌群落豐度的3.60%和0.90%。與CK、B10處理相比，80 mg／kg的水稻根系分泌物處理中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）的相對豐度顯著增加了8.78%、46.76%，7.11、26.33倍。總體而言，某些功能菌屬的相對豐度因根系分泌物的類型和濃度以及培養(yǎng)時(shí)間而異，降解菌屬相對豐度的增加可能是根系分泌物促進(jìn)土壤中多環(huán)芳烴生物降解的重要原因。

2.6 根系分泌物處理下PAH降解率、降解基因及微生物群落間的相關(guān)性分析

2.6.1 根系分泌物處理下PAH降解率與降解基因間的相關(guān)性分析 由表2可知，nidA基因的絕對豐度與人工根系分泌物處理土壤中NAP、PHE、PYR的降解率呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），nahAc基因的絕對豐度與水稻根系分泌物處理中NAP、PHE和PYR含量呈極顯著正相關(guān)。因此，人工根系分泌物中的nidA降解基因和水稻根系分泌物中的nahAc降解基因絕對豐度的增加可能是土壤中兩種根系分泌物促進(jìn)PAH生物降解的主要原因。

表2 根系分泌物處理下PAH降解率與降解基因間的相關(guān)性分析

2.6.2 根系分泌物處理下PAH降解率與功能菌間的相關(guān)性分析 由表3可知，在人工根系分泌物中，NAP降解率與諾卡氏菌屬（Nocardioides）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、Rhodocyclaceae＿unclassified極顯著正相關(guān)（P<0.01），與Burkholderiales＿unclassified顯著正相關(guān)（P<0.05）。PHE降解率與諾卡氏菌屬（Nocardioides）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）極顯著正相關(guān)，與黃單胞菌屬（Luteimonas）顯著正相關(guān)。PYR降解率與諾卡氏菌屬（Nocardioides）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）呈極顯著正相關(guān)，與芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）及黃單胞菌屬（Luteimonas）呈顯著正相關(guān)。

表3 根系分泌物處理下PAH降解率與功能菌間的相關(guān)性分析

在水稻根系分泌物中，NAP降解率與芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、溶桿菌屬（Lysobacter）、Sphingomonadaceae＿unclassified、Burkholderiales＿unclassified、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Rhodocyclaceae＿unclassified呈極顯著正相關(guān)，與節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、黃單胞菌屬（Luteimonas）呈顯著正相關(guān)。PYR降解率與Actinomycetales＿unclassified、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、假單胞菌屬（Pseudomonas）呈極顯著正相關(guān)。PHE降解率與諾卡氏菌屬（Nocardioides）、Actinomycetales＿unclassified、黃單胞菌屬（Luteimonas）呈顯著正相關(guān)，與假單胞菌屬（Pseudomonas）呈極顯著正相關(guān)。

2.6.3 根系分泌物處理下降解基因與功能菌間的相關(guān)性分析 由表4可知，在人工根系分泌物的處理中，諾卡氏菌屬（Nocardioides）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）與3個(gè)降解基因（nidA、nahAc和phe）皆呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。nidA與Sphingomonadaceae＿unclassified和Burkholderiales＿unclassified呈極顯著正相關(guān)，nahAc與Sphingomonadaceae＿unclassified呈顯著正相關(guān)。

表4 不同根系分泌物處理下PAH功能菌豐度與降解基因的相關(guān)性分析

在水稻根系分泌物處理中，假單胞菌屬（Pseudomonas）與3個(gè)降解基因（nidA、nahAc和phe）皆呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Sphingomonadaceae＿unclassified、Rhodocyclaceae＿unclassified與nahAc和phe皆呈極顯著正相關(guān)，而與nidA呈極顯著負(fù)相關(guān)。nidA與諾卡氏菌（Nocardioides）、Actinomycetales＿unclassified、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、鞘脂菌屬（Sphingobium）及鏈霉菌屬（Streptomyces）呈極顯著正相關(guān)，與溶桿菌屬（Lysobacter）、Sphingomonadaceae＿unclassified、Rhodocyclaceae＿unclassified以及Burkholderiales＿unclassified呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，在一定濃度范圍內(nèi)，添加人工根系分泌物和水稻根分泌物皆有效促進(jìn)了土壤中NAP、PHE和PYR的生物降解。Xie等［5］研究表明，隨著黑麥草根系分泌物濃度的增加，PYR的降解率先增加后減少，以32.75 mg／kg根系分泌物處理時(shí)PYR的降解率最高。本研究中，人工根系分泌物和水稻根系分泌物在降解PAH規(guī)律方面趨于一致，且當(dāng)人工根系分泌物和水稻根系分泌物在40 mg／kg時(shí)均具有較大值或峰值，表明添加適量濃度的根系分泌物有利于促進(jìn)土壤中細(xì)菌生長和PAH的降解［19］。這可能是由于根系分泌物中含有有機(jī)酸，導(dǎo)致根際土壤pH值的降低和鋁的有效釋放，介導(dǎo)土壤微生物群落發(fā)生變化、微生物活性的升高所致［20］。但人工根系分泌物和水稻根系分泌物的降解率存在差異，這可能由于人工根系分泌物的組成與水稻根系分泌物相比，缺少胞外效應(yīng)物質(zhì)和潛在的復(fù)雜化學(xué)信號傳導(dǎo)分子物質(zhì)［21］。

不同多環(huán)芳烴在土壤中具有特定的環(huán)境行為。研究表明，PAH的生物降解率隨芳香環(huán)的增加而降低［22］。因此，與低分子量PAH相比，微生物對高分子量PAH的降解效率較低［23］。在CK處理中，NAP、PHE和PYR的降解率隨培養(yǎng)時(shí)間的增加整體呈增加趨勢，但降解率皆較低。分泌物處理下NAP、PHE和PYR的降解率皆顯著提升，且兩種根系分泌物對NAP的降解率整體高于PHE和PYR。這可能是由于根系分泌物對NAP功能菌傾向誘導(dǎo)性影響，也可能是微生物和根系分泌物的共代謝過程促進(jìn)了NAP在土壤中的降解［24］。

PAH的微生物降解及代謝依賴于各種功能基因，這些基因的表達(dá)豐度是評估細(xì)菌群落在污染土壤中降解多環(huán)芳烴潛力的重要表征［25］。nidA、nahAc和phe基因在PAH降解功能菌存在環(huán)境中被普遍誘導(dǎo)表達(dá)，這有助于催化PAH雙加氧酶和單加氧酶基因的轉(zhuǎn)錄［8，22］。根據(jù)這些酶的底物利用范圍，nidA基因來自革蘭氏陽性菌，可同時(shí)降解低分子量和高分子量PAH。nahAc基因來自革蘭氏陰性菌，主要介導(dǎo)降解低分子量PAH［26］。本研究中，與CK處理相比，PAH降解基因（nidA、nahAc、phe）的絕對豐度與兩種根系分泌物處理中的PAH降解率具有顯著正相關(guān)關(guān)系，這可能是由于水稻根系分泌物可為土壤微生物提供底物營養(yǎng)（例如C、N）［7，20］。本研究也發(fā)現(xiàn)，水稻根系分泌物處理土壤中的nidA基因豐度整體低于CK處理，這可能是由于水稻根系分泌物抑制了攜帶nidA基因功能菌的生長。此外，在土壤中添加任一濃度的人工根系分泌物或水稻根系分泌物處理中16SrRNA基因的豐度均整體低于CK處理，說明由于添加根系分泌物，土壤細(xì)菌群落發(fā)生了變化，敏感性細(xì)菌的豐度下降，導(dǎo)致16SrRNA基因的總豐度下降［27］。

Alpha多樣性數(shù)據(jù)表明，添加根系分泌物和延長培養(yǎng)時(shí)間皆可影響土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，水稻根系分泌物處理影響更加明顯。根系分泌物濃度過高會破壞土壤細(xì)菌群落的原微生態(tài)平衡，同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，敏感性較強(qiáng)的細(xì)菌數(shù)量減少，而具有耐受性或具有潛在PAH降解能力的細(xì)菌因此積累［7，28］。與CK處理相比，根系分泌物處理導(dǎo)致土壤中細(xì)菌群落豐富度和多樣性下降，但促進(jìn)了相關(guān)PAH降解功能菌的數(shù)量。水稻根系分泌物顯著增加了假單胞菌屬（Pseudomonas）和Rhodocyclaceae＿unclassified的相對豐度，人工根系分泌物顯著增加了諾卡氏菌屬（Nocardioides）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、Actinomycetales＿unclassified、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度。

在污染的土壤中，PAH降解率往往與細(xì)菌總數(shù)量無明顯相關(guān)性，而是與介導(dǎo)降解過程的特定功能菌數(shù)量相關(guān)［29］。目前已確定變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和芽單胞菌門（Gematimonadetes）為主的PAH降解菌［30］。本研究中，鑒定到14個(gè)降解PAH的功能菌屬，人工根系分泌物和水稻根系分泌物可對某些PAH降解功能菌的相對豐度產(chǎn)生積極影響。PAH降解率與降解基因間的相關(guān)分析表明nidA基因與人工分泌物處理下的PAH降解率皆呈極顯著正相關(guān)，nahAc基因與水稻根系分泌物處理下的PAH降解率皆呈極顯著正相關(guān)。PAH降解率與功能菌間的相關(guān)分析表明，諾卡氏菌屬（Nocardioides）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）與人工分泌物處理下的PAH降解率極顯著正相關(guān)，假單胞菌屬（Pseudomonas）與水稻根系分泌物處理下的PAH降解率極顯著正相關(guān)。降解基因絕對豐度與功能菌相對豐度的相關(guān)性分析表明，人工根系分泌物處理下降解基因與諾卡氏菌屬（Nocardioides）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）皆呈極顯著正相關(guān)，水稻根系分泌物處理下降解基因與假單胞菌屬（Pseudomonas）極顯著正相關(guān)。因此，根系分泌物處理下降解率、降解基因豐度及功能菌豐度之間互相存在著很強(qiáng)的相關(guān)性［9，31］。

綜上，人工根系分泌物和水稻根系分泌物皆可提高PAH相關(guān)降解基因和功能菌豐度從而促進(jìn)對NAP、PHE和PYR的生物降解。