高英，劉昊，楊利云，楊翔祥，夏蕊，楊麗芳

（1.天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300392；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300384）

山櫻花（Cerasus serrulate L.）又名山櫻、野山櫻，屬于薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus）植物，是櫻花的野生種，為落葉小喬木。我國(guó)北方地區(qū)罕見(jiàn)野生山櫻花分布，2018年在天津薊州八仙山國(guó)家自然保護(hù)區(qū)首次發(fā)現(xiàn)野生種群，是適合當(dāng)?shù)丨h(huán)境的地理變異類型。該種野生山櫻花樹(shù)型優(yōu)美，花型獨(dú)特，花瓣倒卵形，先端有凹缺，花瓣白色，部分先端呈淡粉色，具有較強(qiáng)的抗病蟲(chóng)害能力、適應(yīng)性和抗逆性，蘊(yùn)含重要的櫻花基因資源，是重要而稀少的櫻屬觀賞植物和種質(zhì)資源，具有潛在的開(kāi)發(fā)利用前景［1，2］。目前，北方野生山櫻花的繁殖方式主要以實(shí)生繁育為主，無(wú)性繁殖受制于砧穗親和性和插條發(fā)育程度還存在繁育率低和苗木整齊度差等問(wèn)題，限制了野生山櫻花的資源保護(hù)及開(kāi)發(fā)利用。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)不僅具有繁殖快、成苗周期短的優(yōu)點(diǎn)，而且能夠保持優(yōu)良遺傳性狀的穩(wěn)定性，可以為山櫻花快速繁殖和資源保存提供有效途徑［3－5］。已有研究建立了多種櫻屬植物的組培快繁體系［6－12］，但對(duì)野生櫻花的研究均是南方分布區(qū)的福建山櫻花和鐘花櫻［13－15］，對(duì)北方野生山櫻花資源的研究尚處于起步階段。本研究在借鑒多種櫻花組培快繁研究的基礎(chǔ)上，以采集于天津市薊州山區(qū)的野生山櫻花為試材，對(duì)叢生芽增殖和生根誘導(dǎo)培養(yǎng)的激素組合以及煉苗時(shí)長(zhǎng)和移栽基質(zhì)等進(jìn)行篩選試驗(yàn)，以期建立該野生山櫻花的組培快繁體系，為其資源保護(hù)和有序利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)樹(shù)為天津市薊州山區(qū)的野生山櫻花（Cerasus serrulate L.）成齡樹(shù)。于2020年5月抽生新梢后，剪取5.0～6.0 cm半木質(zhì)化嫩梢進(jìn)行組織培養(yǎng)。

1.2 外植體消毒和莖段腋芽誘導(dǎo)

用洗滌劑洗去新采嫩梢表面污漬，剪掉葉片，保留葉柄1～2 cm，用流水沖洗2 h后，在超凈臺(tái)上將嫩梢浸入70%乙醇溶液中30 s，用無(wú)菌水沖洗2～3次，再放入0.3%過(guò)氧乙酸溶液中消毒2次，每次10 min，期間不斷搖動(dòng)或攪拌；用無(wú)菌水清洗3～4次，再用無(wú)菌濾紙吸干水分。剪取1.0～2.0 cm的帶芽莖段，接種在添加2 mg·L－16－芐氨基腺嘌呤（6－BA）和0.1 mg·L－1萘乙酸（NAA）的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)。

1.3 叢生芽高效增殖培養(yǎng)的激素組合篩選

待誘導(dǎo)出的腋芽長(zhǎng)至1.0～1.5 cm時(shí)，將萌發(fā)的新梢剪下，接種到添加不同種類、不同濃度激素的叢生芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)。本試驗(yàn)在已有研究基礎(chǔ)上，以MS為基本培養(yǎng)基，確定NAA濃度為0.1 mg·L－1，另外選擇6－BA、TDZ和GA3，分別設(shè)計(jì)不同濃度，形成多個(gè)處理組合，見(jiàn)表1。每瓶接入5個(gè)莖段，每個(gè)處理共接種24瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度大于5 mm的叢生芽數(shù)量，計(jì)算增殖系數(shù)和玻璃化率［13］。

表1 叢生芽增殖培養(yǎng)基添加激素的種類及濃度

增殖系數(shù)＝平均每瓶30天內(nèi)形成的有效芽苗數(shù)／接種腋芽數(shù)；

玻璃化率（%）＝培養(yǎng)30天后的玻璃化芽苗總數(shù)／培養(yǎng)30天后的有效芽苗總數(shù)×100。

1.4 組培苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素濃度及支撐物篩選

待上述叢生芽長(zhǎng)至3.0～4.0 cm時(shí)進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。本試驗(yàn)以1／2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)支撐物為7.0 g·L－1瓊脂或2.5 g干水苔、添加IBA和NAA的濃度配比7種（表2），另添加15 g·L－1蔗糖，調(diào)pH至6.0，在16 h光培養(yǎng)、8 h暗培養(yǎng)、光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx、（25±2）℃、空氣相對(duì)濕度50% ～60%條件下培養(yǎng)。每瓶接種3個(gè)芽苗，每個(gè)處理共接種24瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d后調(diào)查單株不定根數(shù)、單株側(cè)根數(shù)及生長(zhǎng)狀況。

表2 生根培養(yǎng)基添加激素的種類及濃度 （mg·L－1）

1.5 移栽基質(zhì)與煉苗時(shí)長(zhǎng)的確定

當(dāng)上述生根培養(yǎng)基中組培苗不定根長(zhǎng)約為5.0 cm時(shí)，進(jìn)行移栽。栽前，在室溫（23～25℃）自然光照條件下，對(duì)組培苗進(jìn)行閉瓶煉苗，移栽前一天打開(kāi)瓶蓋。移栽時(shí)，用鑷子從培養(yǎng)瓶中小心取出組培苗，用清水洗凈根上黏附的培養(yǎng)基，然后在百菌清500倍液中蘸根1～2 min，栽入已備好的育苗盤基質(zhì)中。

試驗(yàn)設(shè)置4種育苗基質(zhì)：蛭石＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1）、蛭石＋草炭（體積比2∶1）、草炭＋珍珠巖（體積比1∶1）和營(yíng)養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1）；煉苗天數(shù)設(shè)置0、5、10 d。每處理3次重復(fù)，每重復(fù)移栽組培苗30株。于移栽第30天統(tǒng)計(jì)組培苗成活情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 25.0進(jìn)行方差分析，用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類激素組合對(duì)野生山櫻花叢生芽增殖的影響

由表3可知，僅添加6－BA與僅添加TDZ的叢生芽增殖系數(shù)分別以0.50 mg·L－1和2.00 mg·L－1時(shí)最高，分別為2.25和2.46，但兩者之間及各濃度處理之間均無(wú)顯著差異。而增添GA3能夠提高增殖系數(shù)，以1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ（Z15）的增殖系數(shù)最大，為3.96，其次為0.25 mg·L－1GA3＋1.00 mg·L－16－BA（Z9）、1.00 mg·L－1GA3＋1.00 mg·L－16－BA（Z11）和0.50 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ（Z14），增殖系數(shù)在3.15～3.28范圍內(nèi)，4種組合間無(wú)顯著差異。但Z15、Z14、Z11的玻璃化率顯著低于Z9（95%），分別為6%、7%、14%，遠(yuǎn)低于其他激素組合。僅添加6－BA或TDZ的芽苗葉片增大明顯且嫩綠但玻璃化率高且程度深，輕微程度平均占比分別達(dá)到0.40和0.29，嚴(yán)重程度平均占比分別達(dá)到0.17和0.12；增添GA3的芽苗葉片大且黃綠，但玻璃化程度明顯降低，輕微程度平均占比分別降至0.38和0.22，嚴(yán)重程度平均占比分別降至0.05和0.02。

表3 不同種類激素組合對(duì)野生山櫻花叢生芽增殖的影響

綜合分析，Z15激素組合，即1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ ＋0.1 mg·L－1NAA更適宜于天津野生山櫻花莖段的增殖生長(zhǎng)。各種生長(zhǎng)情況的增殖苗見(jiàn)圖1。

2.2 不同生長(zhǎng)素組合及不同培養(yǎng)基支撐物對(duì)野生山櫻花組培苗生根的影響

2.2.1 不同濃度IBA對(duì)生根的影響 由表4可知，在固定NAA濃度為0.10 mg·L－1的前提下，以瓊脂為培養(yǎng)基支撐物時(shí)，添加0.75 mg·L－1IBA（S4）的野生山櫻花組培苗單株側(cè)根數(shù)最多，組培苗生長(zhǎng)健壯，但生根率低，僅40.00%；而添加0.25 mg·L－1IBA（S2）的生根率最高，達(dá)75.00%，單株不定根數(shù)和單株側(cè)根數(shù)均較高，生根效果最好，且組培苗生長(zhǎng)較健壯。以水苔為培養(yǎng)基支撐物時(shí)，添加0.10 mg·L－1IBA（S1）的生根率、單株不定根數(shù)、單株側(cè)根數(shù)均最高，分別達(dá)94.59%、3條、10條，均顯著高于其他處理，生根效果最好，且組培苗生長(zhǎng)很健壯。

表4 不同濃度IBA對(duì)野生山櫻花生根和生長(zhǎng)狀況的影響

2.2.2 不同濃度NAA對(duì)生根的影響 由表5可知，當(dāng)固定IBA濃度為0.10 mg·L－1時(shí)，在以瓊脂為支撐物的培養(yǎng)基中添加0.25 mg·L－1NAA（S5）時(shí)，野生山櫻花組培苗的生根率最高，達(dá)91.30%，單株不定根數(shù)最多（9條），顯著多于其他處理，單株側(cè)根數(shù)較少，組培苗生長(zhǎng)很健壯；在以水苔為支撐物的培養(yǎng)基中添加0.10、0.50、0.75 mg·L－1NAA的生根率均超過(guò)90%，以添加0.10 mg·L－1NAA（S1）的值最高，且其單株不定根數(shù)、單株側(cè)根數(shù)均明顯高于其他處理，組培苗生長(zhǎng)很健壯。

表5 不同濃度NAA對(duì)野生山櫻花生根和生長(zhǎng)狀況的影響

綜合上述分析，以水苔為支撐物、添加0.10 mg·L－1IBA＋0.10 mg·L－1NAA的1／2MS培養(yǎng)基最適宜野生山櫻花組培苗生根。組培苗的不同生根情況見(jiàn)圖2。

圖2 野生山櫻花組培生根

2.2.3 不同支撐物對(duì)組培苗根形態(tài)的影響 由圖3可知，以瓊脂為支撐物的組培苗根呈白色，表面有透明物質(zhì)包裹（圖3A）；而以水苔為支撐物的組培苗靠近根尖部分呈黃白色，靠近莖基部呈黃褐色，表面無(wú)透明物質(zhì)（圖3B）。在顯微鏡下觀察，以瓊脂為支撐物培養(yǎng)的組培苗根系表面光滑（圖3C），而以水苔為支撐物培養(yǎng)的組培苗根系表面密布根毛（圖3D）。另外，比較兩種支撐物上的組培苗發(fā)現(xiàn)，以瓊脂為支撐物的組培苗莖基本沒(méi)有變化，而以水苔為支撐物的組培苗莖有一定的伸長(zhǎng)。

圖3 不同培養(yǎng)基支撐物的組培苗生根情況

2.3 不同基質(zhì)對(duì)野生山櫻花移栽成活率及幼苗生長(zhǎng)的影響

由表6可知，基質(zhì)為蛭石＋珍珠巖＋草炭時(shí)野生山櫻花的移栽成活率最高，達(dá)98.21%，顯著高于其他基質(zhì)處理；基質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭和草炭＋珍珠巖的組培苗成活率次之，分別為82.14%和76.79%，二者間差異不顯著。

表6 不同基質(zhì)對(duì)野生山櫻花移栽后生長(zhǎng)的影響

移栽成活植株葉片數(shù)量整體有所減少，其中蛭石＋珍珠巖＋草炭和草炭＋珍珠巖處理的葉片減少1片，而其余兩種基質(zhì)處理的葉片減少3～4片。葉片減少主要是因?yàn)橐圃院蠡坷先~脫落，而頂部新葉尚未發(fā)出。

移栽后野生山櫻花的莖粗基本無(wú)變化，株高增加不明顯，但冠幅明顯增加。不同基質(zhì)處理間，蛭石＋珍珠巖＋草炭的株高增量最大，為2.64 mm，其次為營(yíng)養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭，兩者間差異不顯著；營(yíng)養(yǎng)土＋珍珠巖＋草炭的冠幅增量最大，達(dá)43.62 mm，草炭＋珍珠巖（36.58 mm）和蛭石＋珍珠巖＋草炭（35.68 mm）次之，蛭石＋草炭最低（27.99 mm）；不同基質(zhì)處理間莖粗增量差異沒(méi)有顯著差異。

綜合各指標(biāo)，以蛭石＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1）為基質(zhì)較適宜野生山櫻花組培苗移栽成活。

2.4 不同煉苗時(shí)間對(duì)野生山櫻花移栽成活率及幼苗生長(zhǎng)的影響

由表7可知，煉苗能明顯提高組培苗的移栽成活率，以水苔為生根培養(yǎng)基支撐物的組培苗移栽成活率更高，煉苗5 d移栽成活率達(dá)80%，與煉苗10 d的成活率不存在顯著性差異。移栽成活幼苗的葉片數(shù)量整體有所減少（0～2片），莖粗基本無(wú)變化；株高增加1.73～3.87 mm，以水苔為支撐物煉苗10 d的增量最大，但與煉苗5 d的株高不存在顯著性差異；冠幅明顯增加，增量為20.89～33.31 mm。綜合分析，以水苔為生根培養(yǎng)支撐物、煉苗5 d較適宜野生山櫻花組培苗移栽成活，且移栽后生長(zhǎng)狀況較好。

表7 不同煉苗時(shí)間對(duì)野生山櫻花移栽后生長(zhǎng)情況的影響

3 討論

細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值決定了芽和根的分化，細(xì)胞分裂素在芽的增殖和生長(zhǎng)中起決定性作用［15］。6－BA和TDZ是組織培養(yǎng)中常用的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，對(duì)植物的形態(tài)發(fā)生起有效調(diào)節(jié)作用，應(yīng)用范圍遍及草本植物到木本植物［16］。在櫻屬植物再生的研究中，TDZ對(duì)誘導(dǎo)酸櫻桃［17］離體器官產(chǎn)生不定芽具有較強(qiáng)的活性，而6－BA對(duì)誘導(dǎo)馬哈利櫻桃［18］離體葉片再生更有效。本研究發(fā)現(xiàn)，在野生山櫻花莖段增殖時(shí)使用6－BA或TDZ均出現(xiàn)了不同程度的組培苗玻璃化現(xiàn)象，玻璃化率最高達(dá)到87%，這與前人在山櫻花［3］上的試驗(yàn)結(jié)果一致；使用6－BA雖然繁殖系數(shù)較高，但組培苗仍有節(jié)間短的現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加GA3可以明顯增加垂枝櫻花的增殖系數(shù)［19］，GA3濃度達(dá)到0.3 mg·L－1對(duì)福建山櫻花叢生芽增殖有明顯促進(jìn)作用［20］。本研究也發(fā)現(xiàn)，增添GA3能明顯提高野生山櫻花的增殖系數(shù)，降低不定芽玻璃化率，改善節(jié)間短的現(xiàn)象，以1.00 mg·L－1GA3＋0.50 mg·L－1TDZ＋0.1 mg·L－1NAA對(duì)野生山櫻花叢生芽增殖的效果最好。

IBA和NAA是誘導(dǎo)木本植物不定根形成的重要植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［21，22］，作用效果存在品種差異性，如在微毛櫻生根培養(yǎng)基中添加0.5 mg·L－1IBA可有效誘導(dǎo)組培苗生根且生根率最高可達(dá)100%［7］，而在櫻花生根培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L－1IBA才顯著提高組培苗的生根率［4］。對(duì)福建山櫻花的研究發(fā)現(xiàn)，IBA和NAA配合使用可顯著提高其根系形成速率，且根系生長(zhǎng)粗壯，當(dāng)兩者配比為1.0 mg·L－1NAA＋1.0 mg·L－1IBA時(shí)，生根率達(dá)90%以上［14］。本研究也證實(shí)兩種生長(zhǎng)素配合使用可以促進(jìn)野生山櫻花組培苗不定根的形成，但適宜的濃度相對(duì)較低，0.10 mg·L－1NAA＋0.10 mg·L－1IBA的生根表現(xiàn)最好，生根率最高達(dá)到94.59%，單株不定根數(shù)為3條，單株側(cè)根數(shù)可達(dá)10條，植株生長(zhǎng)很健壯。本研究結(jié)果也表明野生山櫻花不定根發(fā)生屬于誘導(dǎo)生根型，且對(duì)生長(zhǎng)素較敏感。

本研究使用水苔作為培養(yǎng)基支撐物，在高等木本植物的組織培養(yǎng)中尚屬罕見(jiàn)，結(jié)果表明水苔較瓊脂對(duì)野生山櫻花的生根效果有明顯改善，生根率更高，顯微鏡下可觀察到側(cè)根上長(zhǎng)出了根毛。

移栽基質(zhì)及煉苗時(shí)長(zhǎng)對(duì)組培苗的移栽成活起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明添加了珍珠巖的基質(zhì)對(duì)野生山櫻花的移栽成活率具有明顯提高作用，這與在日本晚櫻［23］上的試驗(yàn)結(jié)果相似。有研究表明草莓閉瓶煉苗3 d，獼猴桃閉瓶煉苗3～5 d、開(kāi)瓶煉苗2 d，大櫻桃開(kāi)瓶煉苗10～15 d均可提高其組培苗的移栽成活率［24－26］。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，增加煉苗時(shí)長(zhǎng)有利于野生山櫻花組培苗移栽成活，但采用水苔做培養(yǎng)基支撐物可大大縮短煉苗時(shí)長(zhǎng)且提高成活率，這可能與水苔營(yíng)造的暗生長(zhǎng)環(huán)境和溶氧量較高有利于側(cè)根根毛發(fā)生有關(guān)。

4 結(jié)論

天津野生山櫻花叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS＋0.50 mg·L－1TDZ＋1.00 mg·L－1GA3＋0.1 mg·L－1NAA，最佳生根培養(yǎng)基為用水苔作為支撐物的1／2MS＋0.10 mg·L－1IBA ＋0.10 mg·L－1NAA，最佳移栽基質(zhì)為蛭石＋珍珠巖＋草炭（體積比2∶1∶1），移栽前閉瓶煉苗5 d。野生山櫻花組培體系的建立為其大量快速繁殖奠定了基礎(chǔ)。