張 妹，張彥青, ，解軍波 ，王 輕，戚務勤

（1.天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院，天津 300134；2.天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 301617）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗（Ziziphus jujubaMill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou）的干燥成熟種子，其作為衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，具有溫和、依賴性低、可長期服用等優(yōu)點，是當前研究的熱門品種。酸棗仁具有悠久的應用歷史，是中醫(yī)治療失眠多夢的首選藥物[1]。由于現(xiàn)代藥理學研究的逐漸完善，酸棗仁的活性功能被進一步挖掘，現(xiàn)代研究證明酸棗仁具鎮(zhèn)靜催眠、抗焦慮、降血糖、降血脂、增強免疫等多種藥理活性。黃酮類成分被認為是酸棗仁發(fā)揮藥理活性的主要物質(zhì)基礎之一，目前，已經(jīng)從酸棗仁中分離得到二十余種黃酮類單體，6′′′-阿魏酰斯皮諾素（6′′-Feruloylspinosin，6-FS）是酸棗仁主要的黃酮類成分之一，不同產(chǎn)區(qū)酸棗仁中6′′′-阿魏酰斯皮諾素含量約為0.26～0.88 mg/g[2?3]。近年多項研究表明該黃酮在神經(jīng)功能調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)出顯著的生物活性[4?5]，但其具體作用機制尚待進一步揭示。

由于現(xiàn)代生活壓力及全球人口老齡化的日益加劇，阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease,AD）等神經(jīng)退行性疾病，已經(jīng)成為人類面臨的最大公共健康挑戰(zhàn)之一。截至2015 年，全世界4680 萬人患有阿爾茨海默癥（中國占有相當大的比重，約1/4）[6]，預計2050年這一數(shù)字將達到1.52 億。AD 的發(fā)生與β淀粉樣蛋白（Amyloidβ，Aβ）的沉積密切相關，Aβ在腦內(nèi)沉積形成的不溶性斑塊可誘導神經(jīng)元線粒體損傷，導致氧自由基大量積聚，進一步攻擊核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)，最終導致大量神經(jīng)元凋亡，損害大腦功能[7]。傳統(tǒng)天然藥物富含多樣生物活性化合物，可以多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮神經(jīng)保護作用，并且部分傳統(tǒng)天然藥物具有藥食同源性，安全性高，已成為調(diào)節(jié)神經(jīng)功能最為有效的手段之一[8?9]。本研究利用Aβ1-42誘導SH-SY5Y 細胞損傷，并給予酸棗仁黃酮類成分6′′′-阿魏酰斯皮諾素進行干預，從細胞活力、細胞氧化應激情況以及細胞線粒體狀態(tài)等多角度探討6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42誘導損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用及相關機制，為酸棗仁的應用與防治AD 藥物的開發(fā)提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人神經(jīng)母細胞瘤細胞株（SH-SY5Y） 南開大學惠贈；6′′′-阿魏酰斯皮諾素 成都德銳可生物科技有限公司（貨號：drk1727，純度：≥98%）；Aβ1-42上海吉爾生化有限公司（貨號：SJ053487，純度：≥95%）；六氟異丙醇 北京天根生化科技有限公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒 Biosharp 白鯊生物公司；活細胞/死細胞雙染試劑盒（Calcein-AM/PI） 北京北奧萊博科技公司；B 細胞淋巴瘤/白血病-2 蛋白（Bcell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2）、Bcl-2 關聯(lián)死亡啟動子重組蛋白（Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter,Bad）、β-肌動蛋白（Beta Actin，β-Actin）抗體abcam 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白提取試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）活力檢測試劑盒、丙二醛（Malonic dialdehyde,MDA）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential,MMP）水平檢測試劑盒 碧云天生物技術研究所。

BP211D 電子分析天平 Sartorius AG；HNY2102恒溫培養(yǎng)箱 天津市歐諾儀器儀表有限公司；TI-DH 600352 倒置熒光顯微鏡 日本尼康；SpectraMax?M3 多功能酶標儀 Molecular；PowerPac TMHC 蛋白電泳儀 Bio-rad。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及細胞給藥方式 SH-SY5Y 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，細胞密度為70%～80%時進行傳代。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗，細胞培養(yǎng)過夜后，給予含6′′′-阿魏酰斯皮諾素的培養(yǎng)基預處理2 h，再加入Aβ1-42寡聚體共同孵育24 h。

1.2.2 CCK-8 法檢測細胞活力 按照文獻介紹[10]的方法制備Aβ1-42寡聚體，細胞接種于96 孔板中。首先分析Aβ1-42對細胞活力的影響，培養(yǎng)過夜后，在含有Aβ1-42（0、0.1、0.5、1、5 和10 μmol/L）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，結(jié)束后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK-8 工作液（10 μL CCK-8 溶液+90 μL DMEM），孵育4 h 后測定450 nm 處吸光度值，根據(jù)吸光值讀數(shù)選擇Aβ1-42的給藥劑量。其次，分析6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42誘導損傷的細胞活力的影響，細胞培養(yǎng)過夜后，首先利用含有不同濃度（1、5、10、20和40 μmol/L）6′′′-阿魏酰斯皮諾素的培養(yǎng)基預處理2 h 后，加入Aβ1-42共同培養(yǎng)24 h。只給予Aβ1-42，未給予6′′′-阿魏酰斯皮諾素的細胞為模型組細胞。細胞給藥培養(yǎng)結(jié)束后，按照上述方法測定不同處理組細胞吸光度值。其中，OD對照是指具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度讀數(shù)；OD空白是指沒有細胞存在，單獨具有培養(yǎng)基和 CCK-8 溶液的孔的吸光度讀數(shù)。

1.2.3 AM/PI 染色法觀察細胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細胞接種于12 孔板中，分為以下5 組：對照組、Aβ1-42模型組（5 μmol/L）、6′′-阿魏酰斯皮諾素低劑量組（6′′′-阿魏酰斯皮諾素5 μmol/L+Aβ1-425 μmol/L）、6′′′-阿魏酰斯皮諾素中劑量組（6′′′-阿魏酰斯皮諾素10 μmol/L+Aβ1-425 μmol/L）及6′′′-阿魏酰斯皮諾素高劑量組（6′′′-阿魏酰斯皮諾素20 μmol/L+Aβ1-425 μmol/L）每組設置三個復孔。采用Calcein-AM/PI 雙染法觀察細胞形態(tài)，細胞培養(yǎng)結(jié)束后，加入Calcein-AM/PI 染色工作液避光孵育細胞（37 ℃，30 min）。使用熒光倒置顯微鏡在（490±10）nm 激發(fā)波長下觀察活細胞與死細胞，另用545 nm 激發(fā)波長單獨觀察死細胞。

1.2.4 SH-SY5Y 細胞內(nèi)ROS 水平測定 細胞培養(yǎng)及給藥方式如1.2.3，培養(yǎng)結(jié)束后，加入DCFH-DA 活性氧染色工作液孵育細胞（37 ℃，50 min），孵育結(jié)束后加入DMEM 洗滌。用酶標儀測定激發(fā)波長502 nm，發(fā)射波長為530 nm 處的熒光強度值并利用熒光倒置顯微鏡進行觀察。

1.2.5 SH-SY5Y 細胞內(nèi)MDA 水平、GSH-Px 酶活力及線粒體膜電位水平測定 細胞培養(yǎng)及給藥方式如1.2.3，培養(yǎng)結(jié)束后，依據(jù)試劑盒說明書介紹的方法收集及處理細胞，并測定細胞內(nèi)MDA 水平及GSHPx 酶活力。用JC-1 法測定細胞線粒體膜電位，在細胞培養(yǎng)結(jié)束后加入JC-1 染色工作液孵育細胞（37 ℃，30 min），用酶標儀測定激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長為520 nm 及570 nm 處的熒光強度值并利用熒光倒置顯微鏡進行觀察。

1.2.6 Western blot 分析 依據(jù)試劑盒說明書介紹的方法進行蛋白提取及濃度測定。SDS-PAGE 電泳分離蛋白后將其轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉處理1 h。添加一抗4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗凈后，加入二抗4 ℃孵育2 h 后用TBST 緩沖液洗凈。ECL 曝光顯影，以β-actin 作為內(nèi)參，利用Image J 軟件對各個條帶灰度值進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Image J 軟件對圖片中熒光強度及條帶灰度值進行分析，使用GraphPad Prism 8.0.2 進行統(tǒng)計分析，并通過t檢驗比較各組數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（）表示，與對照組比較：*P＜0.05，有差異；**P＜0.01，差異顯著；***P＜0.001，差異極顯著，與模型組比較：#P＜0.05，有差異，##P＜0.01，差異顯著，###P＜0.001，差異極顯著，所有實驗均重復三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理抑制Aβ1-42 誘導的SH-SY5Y 細胞損傷

依照實驗計劃給予SH-SY5Y 細胞6′′′-阿魏酰斯皮諾素及Aβ1-42，并利用CCK-8 法檢測細胞活力。Aβ1-42會對細胞造成損傷，且損傷程度呈劑量依賴性，結(jié)果如圖1 所示：在不給予6′′′-阿魏酰斯皮諾素的情況下，1、5、10 μmol/L Aβ1-42給藥均導致細胞活力下降，與對照組相比，Aβ1-421 μmol/L 組細胞活力降為89.17%，Aβ1-425 μmol/L 組細胞活力降為62.18%，Aβ1-4210 μmol/L 組細胞活力降為60.96%。其中，1 μmol/L Aβ1-42雖然導致細胞活力顯著下降（P＜0.01），但此時細胞損傷程度較低；Aβ1-425 μmol/L 組及Aβ1-4210 μmol/L 組細胞活力均極顯著下降（P＜0.001），且細胞活力下降程度相近，因此，本實驗選擇5 μmol/L 的Aβ1-42處理細胞構建損傷細胞模型。6′′-阿魏酰斯皮諾素預處理可以有效抑制Aβ1-42誘導的細胞活力下降，結(jié)果如圖2 所示。與模型組相比，使用6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理可以劑量依賴性地增加Aβ1-42誘導損傷的SH-SY5Y 細胞活力，其中，6′′-阿魏酰斯皮諾素低劑量組（1、5 μmol/L）效果不顯著（P＞0.05），中劑量組（10 μmol/L）以及高劑量組（20、40 μmol/L）效果極顯著（P＜0.001），本實驗選用5、10、20 μmol/L 6'''-阿魏酰斯皮諾素預處理細胞，研究6'''-阿魏酰斯皮諾素預處理對Aβ1-42誘導損傷細胞的保護作用，并分析6'''-阿魏酰斯皮諾素對細胞的保護作用是否具有濃度依賴性。

圖1 Aβ1-42 對SH-SY5Y 細胞活力的影響Fig.1 Effect of Aβ1-42 on the viability of SH-SY5Y cells

圖2 6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42 誘導損傷SH-SY5Y 細胞活力的影響Fig.2 Effect of 6′′′-feruloylspinosin on the viability of SHSY5Y cells damaged by Aβ1-42 induction

不同處理組Calcein-AM/PI 染色情況如圖3 所示：對照組細胞生長情況良好，細胞多呈現(xiàn)橢圓形或梭形，生長密集，代表死細胞的紅色熒光較弱；Aβ1-42處理24 h 后細胞出現(xiàn)損傷，細胞多呈圓形，細胞生長密度減小，死細胞數(shù)量增多，不同濃度6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理后，死細胞數(shù)量減少，并且細胞密度上升。說明Aβ1-42處理后，細胞受損，細胞生長密度降低、形態(tài)改變且死細胞數(shù)目增多，而6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理可以改善上述情況，降低Aβ1-42誘導的細胞損傷。

圖3 6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42 誘導損傷SH-SY5Y 細胞形態(tài)的影響（100×）Fig.3 Effect of 6′′′-feruloylspinosin on the morphology of SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42 induction (100×)

2.2 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理緩解Aβ1-42 誘導的SH-SY5Y 細胞氧化損傷

SH-SY5Y 細胞內(nèi)ROS 染色情況如圖4（A）～圖4（B）所示，與對照組相比，模型組細胞相對熒光強度極顯著增強（P＜0.001），6′′-阿魏酰斯皮諾素預處理組細胞平均熒光強度減弱，且呈現(xiàn)劑量依賴性。MDA 為氧自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，生成的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[11]；GSH-Px 是一種重要的抗氧化酶，可以催化還原型谷胱甘肽與過氧化氫反應，生成氧化型谷胱甘肽與水[12]。因此，MDA 水平以及GSHPx 酶活力常被用來衡量機體氧化損傷的程度及抗氧化能力的強弱。各組MDA 水平及GSH-Px 酶活力的檢測結(jié)果如圖4（C）～圖4（D）所示，相較于對照組，模型組MDA 水平極顯著增加，GSH-Px 酶活力極顯著下降（P＜0.001），與模型組相比，6′′′-阿魏酰斯皮諾素（20 μmol/L）預處理可以顯著降低MDA 水平（P＜0.01），并顯著提高GSH-Px 酶活力（P＜0.001）。

圖4 6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42 誘導損傷SH-SY5Y 細胞氧化應激情況的影響（40×）Fig.4 Effect of 6′′′-feruloylspinosin on the level of oxidative stress in SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42 induction (40×)

2.3 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理抑制Aβ1-42 誘導的SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位降低

各組細胞線粒體膜電位水平測定結(jié)果如圖5 所示，對照組紅色熒光較強，綠色熒光較弱，說明對照組中JC-1 多在線粒體基質(zhì)中以聚集體存在，發(fā)出紅色熒光，此時線粒體膜電位較高。模型組綠色熒光較強，說明模型組細胞線粒體膜電位極顯著下降（P＜0.001），此時，JC-1 從線粒體中擴散出來，以發(fā)出綠色熒光的JC-1 單體形式存在[13]。6′′′-阿魏酰斯皮諾素組（10、20 μmol/L）紅色熒光強度增強，綠色熒光強度減弱，說明6′′′-阿魏酰斯皮諾素可以顯著或極顯著提高Aβ1-42誘導損傷SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位（P＜0.01、P＜0.001）。

圖5 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理對Aβ1-42 誘導損傷SH-SY5Y 細胞膜電位水平的影響（100×）Fig.5 Effect of 6′′′-feruloylspinosin on the level of MMP in SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42 induction (100×)

2.4 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理調(diào)節(jié)Aβ1-42 誘導損傷的SH-SY5Y 細胞內(nèi)凋亡相關蛋白表達

6′′′-阿魏酰斯皮諾素及Aβ1-42對SH-SY5Y 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響如圖6 所示。相較于對照組，10 μmol/L 6′′-阿魏酰斯皮諾素單獨處理組細胞凋亡相關蛋白表達無顯著變化（P＞0.05）。5 μmol/L Aβ1-42處理后細胞內(nèi)Bad 蛋白表達極顯著上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達極顯著降低（P＜0.001）；6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理組Bad 蛋白表達呈濃度依賴性地下降，Bcl-2 蛋白的表達呈濃度依賴性地上升，且與模型組差異顯著（P＜0.01）。6′′-阿魏酰斯皮諾素對健康細胞凋亡相關蛋白表達沒有顯著影響（P＞0.05），但6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理可以調(diào)節(jié)誘導損傷細胞凋亡相關蛋白的表達，這表明6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42誘導損傷的SH-SY5Y 細胞的保護作用可能與其調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白表達的活性相關。

圖6 6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42 誘導損傷SH-SY5Y細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.6 Effect of 6′′′-feruloylspinosin on the expression of apoptosis-related proteins in SH-SY5Y cells damaged by Aβ1-42 induction

3 討論與結(jié)論

阿爾茲海默癥的典型病理特征為微管穩(wěn)定蛋白質(zhì)過度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）及Aβ組成的胞外老年斑（senile plaque，SP）[14?15]。其中，Aβ是淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursor protein，APP）經(jīng)β/γ裂解酶切割產(chǎn)生的含有39～43 個氨基酸的多肽[16?17]。早在20 世紀60 年代，研究者就在AD 患者腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Aβ原纖維，并明確Aβ與AD 的發(fā)生發(fā)展有著密切關系[18]?，F(xiàn)代研究表明，Aβ低聚物及纖維體沉積在腦中，會引起神經(jīng)細胞氧化應激、引發(fā)神經(jīng)炎癥、抑制海馬區(qū)長時程增強效應等，導致神經(jīng)細胞凋亡，從而損害患者的認知能力[19?21]。本研究利用Aβ1-42處理SH-SY5Y 細胞，構建神經(jīng)細胞損傷模型，發(fā)現(xiàn)5、10 μmol/L Aβ1-42可以極顯著降低SH-SY5Y 細胞活力（P＜0.001），并改變SH-SY5Y 細胞形態(tài)。10、20 μmol/L 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理可以提高損傷SH-SY5Y 細胞活力，增加細胞生長密度，改善細胞形態(tài)，這說明6′′′-阿魏酰斯皮諾素可以保護Aβ1-42誘導的損傷細胞，可能具有潛在的AD 治療作用。

大量研究表明，Aβ是AD 發(fā)生發(fā)展過程中神經(jīng)元氧化損傷的關鍵[22]。氧自由基的存在誘導AD 模型小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積并加速AD 病程發(fā)展[23]，Aβ的存在也會損傷細胞抗氧化防御系統(tǒng)，導致細胞清除自由基的能力減弱[24]。丁軻等[25]采用活性追蹤法對酸棗仁提取組分體外抗氧化活性進行比較，發(fā)現(xiàn)6′′′-阿魏酰斯皮諾素具有抗氧化活性。Yang 等[10]也發(fā)現(xiàn)6′′′-阿魏酰斯皮諾素可以減輕熱應激誘導的秀麗隱桿線蟲氧化損傷，延長秀麗隱桿線蟲壽命?；诖?，本研究分析了6′′′-阿魏酰斯皮諾素對Aβ1-42誘導損傷的SH-SY5Y 細胞的保護作用與其抗氧化活性的關系。結(jié)果表明，5 μmol/L Aβ1-42處理SH-SY5Y 細胞24 h 后，細胞內(nèi)ROS 及MDA 水平升高并且抗氧化酶GSH-Px 酶活力極顯著降低（P＜0.001）；20 μmol/L 6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理可以降低細胞內(nèi)ROS 及MDA 累積水平并顯著提高GSH-Px 酶活力（P＜0.01、P＜0.001），減低Aβ1-42誘導的SH-SY5Y 細胞氧化應激損傷。

線粒體功能障礙是AD 發(fā)生的早期事件，線粒體作為細胞能量的主要來源及氧化還原反應的重要場所，極易遭受氧自由基的攻擊而造成損傷，表現(xiàn)為線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙、線粒體滲透性腫脹破碎、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放等[26?28]。Bcl-2 家族蛋白主要作用于線粒體外膜，與線粒體膜通透性及細胞凋亡密切相關[29]。正常情況下，Bcl-2 家族抗凋亡蛋白成員與促凋亡蛋白成員以異源二聚體形式存在。當細胞受到刺激后，Bcl-2 蛋白家族成員Bad 發(fā)生去磷酸化，并從其與分子伴侶蛋白結(jié)合組成的無活性復合物中解離，破壞異源二聚體結(jié)構，置換出大量促凋亡蛋白Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl2-associated X protein,Bax）聚集到線粒體外膜上，導致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔過度開放，細胞色素C 向胞質(zhì)釋放，激活caspase 聯(lián)級反應，誘導細胞凋亡[30?31]。本研究結(jié)果顯示，5 μmol/L Aβ1-42會導致SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位極顯著下降（P＜0.001），并使抗凋亡蛋白Bcl-2 表達極顯著降低（P＜0.001），促凋亡蛋白Bad 表達極顯著升高（P＜0.001）。不同濃度6′′′-阿魏酰斯皮諾素預處理不僅可以上調(diào)Aβ1-42誘導損傷的SH-SY5Y 細胞線粒體膜電位并且可以調(diào)節(jié)Bcl-2 家族蛋白的表達，上調(diào)Bcl-2 蛋白表達，下調(diào)Bad 蛋白表達，其中，20 μmol/L 6′′′-阿魏酰斯皮諾素組效果顯著（P＜0.001、P＜0.01、P＜0.01）。

綜上所述，6′′′-阿魏酰斯皮諾素可以抑制Aβ1-42誘導的SH-SY5Y 細胞損傷，其作用機制可能與6′′′-阿魏酰斯皮諾素抗氧化活性及調(diào)控Bcl-2 家族蛋白表達等活性相關。