李 慧，潘思軼，徐曉云,

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430056；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070）

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于蔬菜、水果等植物性食品原料中。自然界存在的黃酮類(lèi)化合物多以黃酮苷的形式存在，即黃酮苷元與糖類(lèi)結(jié)合形成了糖苷鍵，據(jù)此黃酮類(lèi)化合物可分為黃酮氧苷和黃酮碳苷：黃酮苷元上氧原子與糖鏈以C-O 鏈接形成黃酮-O-糖苷；黃酮苷元上碳原子與糖鏈以C-C 鏈接形成黃酮-C-糖苷[1]。在黃酮類(lèi)化合物中，黃酮氧苷較黃酮碳苷類(lèi)化合物常見(jiàn)，例如芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖即大波斯菊苷[2?3]及5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元等。而隨著質(zhì)譜等鑒別技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)越來(lái)越多的黃酮碳苷被發(fā)現(xiàn)，黃酮碳苷的C-糖苷取代常發(fā)生在黃酮苷元母核結(jié)構(gòu)的C6 位或C8 位，如牡荊素和異牡荊素是芹菜素-C-糖苷同分異構(gòu)體，夏佛塔苷、異夏佛塔苷是葡萄糖和阿拉伯糖兩種不同的糖基配體與芹菜素苷元形成的芹菜素6，8-雙-C-糖苷同分異構(gòu)體[4]。黃酮類(lèi)化合物一般具有較低的毒性和廣泛的生物活性。

芹菜素黃酮苷元可以通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性[5?6]，其形成的芹菜素黃酮苷也顯示出較好的抗炎作用。芹菜素黃酮碳苷天然存在于清熱解毒的植物性材料中，如箬葉[7]、三葉青[8]、綠豆衣[9]、蓮子心[4]，基于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激建立小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 炎性細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)此類(lèi)植物提取物具有炎性抑制作用[9?10]。除此之外，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷可通過(guò)抑制炎性和氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕LPS 誘導(dǎo)的急性中耳炎[11]。然而關(guān)于5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元是否具有抗炎活性尚不明確，芹菜素形成的幾種O-糖苷、C-糖苷同分異構(gòu)體的活性差異亦尚未見(jiàn)報(bào)道。動(dòng)物模型是常用的體內(nèi)活性評(píng)價(jià)模型，但動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)樣品量消耗大，無(wú)法針對(duì)重要作用靶點(diǎn)進(jìn)行單一信號(hào)通路的研究與確認(rèn)，因此單一的細(xì)胞系模型更有助于評(píng)價(jià)黃酮類(lèi)化合物的抗炎活性及作用機(jī)制。

THP-1 是人髓系白血病單核細(xì)胞，具有與原代單核細(xì)胞相似的表型和功能特征，以及穩(wěn)定的遺傳能力[12?13]。LPS 刺激佛波酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）分化的THP-1 細(xì)胞是常用的人源性炎性細(xì)胞模型，以之建立模型，可以有效評(píng)價(jià)活性成分的抗炎作用，并分析其可能的作用機(jī)制[14]。本研究將以THP-1 單核巨噬細(xì)胞建立炎性細(xì)胞模型，以4 種芹菜素-單-C/O-黃酮苷同分異構(gòu)體（見(jiàn)表1）：牡荊素、異牡荊素、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)4 種同分異構(gòu)體的抗炎活性差異，為植物性食品原料膳食攝入芹菜素黃酮苷及營(yíng)養(yǎng)特性提供指導(dǎo)。

表1 芹菜素及其4 種黃酮苷化學(xué)結(jié)構(gòu)Table 1 Structure of apigenin and 4 apigenin glycosides

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

THP-1 單核巨噬細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存 上海細(xì)胞庫(kù)；5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素、異牡荊素 均為HPLC純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；RPMI 培養(yǎng)基 美國(guó)hyclone 公司；胎牛血清 澳大利亞Aus-GeneX 公司；GNM15140 青鏈霉素溶液（100X） 杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，L-4391）、豆蔻佛波醇乙酯（phorbol 12-myristate13-acetate，PMA）、β-巰基乙醇 美國(guó)Sigma公司；高純總RNA 提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；漿蛋白與核蛋白提取試劑盒、Weatern Blot 分析試劑 美國(guó)AspenTech 公司；PrimeScriptTM reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒TaKaRa 公司；細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫試劑盒 欣博盛生物科技有限公司；所有分析用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Multifuge X1R 高速冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)讀數(shù)儀Thermo Fisher Scientific 公司；ECLIPSE TS100 倒置顯微鏡 日本尼康公司；DYY-8C 凝膠電泳儀北京六一儀器廠；細(xì)胞培養(yǎng)板 美國(guó)Corning 公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶 德國(guó)Greiner 公司；MG96G PCR 儀杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；ChemiDoc MP 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO LEGEND 公司；qTOWER2.2 熒光定量PCR 儀 德國(guó)Analytik jena 公司；AX-Ⅱ暗匣 廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司；LiDE110 DYY-6C掃描儀 日本Canon 公司；0.45μm PVDF 膜 美國(guó)Millipore 公司；柯達(dá)醫(yī)用X 射線膠片 美國(guó)Kodak公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1 單核巨噬細(xì)胞以RPMI完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，RPMI 完全培養(yǎng)基由10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、0.1 μmol/L的β巰基乙醇組成，細(xì)胞于含5% CO2，90%濕度，37 ℃條件下的CO2恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每24 h 于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)密度達(dá)到70%～80%左右時(shí)進(jìn)行分瓶傳代[14]。

1.2.2 MTT 試驗(yàn) 采用MTT 法[15]測(cè)定黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞的毒性作用。

設(shè)置3 個(gè)組別：實(shí)驗(yàn)組，稀釋細(xì)胞懸液，加入PMA 試劑（終濃度為0.1 μmol/L），接種100 μL 細(xì)胞到96 孔板中，使其密度為3×104個(gè)/孔，細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。12 h 后細(xì)胞貼壁完全，去上清液，以溫?zé)岬腜BS 輕輕清洗細(xì)胞，去PBS，加入新鮮RPMI 完全培養(yǎng)基，靜息24 h。以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液分別配制濃度為5 μmol/L 的api-5-Oglu、api-7-O-glu、vitexin、isovitexin 溶液，去細(xì)胞上清液，以溫?zé)岬腜BS 輕輕洗滌細(xì)胞，去PBS，分別加入配制好的黃酮類(lèi)化合物溶液?？瞻捉M，不接種細(xì)胞，加入100 μL RPMI 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)到細(xì)胞孔板中，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類(lèi)化合物溶液處理細(xì)胞孔板。正常組（CK 組），THP-1 細(xì)胞接種量同樣品組，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類(lèi)化合物溶液處理細(xì)胞孔板。樣品組與2 個(gè)空白組均設(shè)8 個(gè)平行。

給藥完成后，細(xì)胞孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后取出去細(xì)胞上清液，加入配制好的MTT 溶液（濃度為0.5 mg/mL），放回CO2培養(yǎng)箱中避光孵育3～4 h。去MTT 溶液，以150 μL 二甲亞砜溶解細(xì)胞中甲瓚結(jié)晶，于37℃震蕩孵育10 min，在酶標(biāo)儀上讀取490 nm 處吸光值。

計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：

式中：AT：樣品組在490 nm 處的吸光值；AN：空白組在490 nm 處的吸光值；AC：正常組（CK 組）在490 nm 處的吸光值。

1.2.3 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）含量 設(shè)置3 個(gè)組別：實(shí)驗(yàn)組：稀釋細(xì)胞懸液，接種2 mL 細(xì)胞到6 孔板中，使其密度為1.5×107個(gè)/孔，待細(xì)胞覆蓋孔板底部80%～90%時(shí)，加入PMA 試劑（終濃度為0.1 μmol/L），放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h 后細(xì)胞貼壁完全，去上清液，以溫?zé)岬腜BS 輕輕清洗細(xì)胞，去PBS，加入新鮮RPMI 完全培養(yǎng)基，靜息24 h。以不含血清的RPMI培養(yǎng)液分別配制濃度為5 μmol/L 的api-5-O-glu、api-7-O-glu、vitexin、isovitexin 溶液，去細(xì)胞上清液，以溫?zé)岬腜BS 輕輕洗滌細(xì)胞，去PBS，分別加入配制好的黃酮類(lèi)化合物溶液。模型組（LPS 組），THP-1細(xì)胞接種量同樣品組，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類(lèi)化合物溶液處理細(xì)胞孔板。正常組（CK 組），THP-1 細(xì)胞接種量同樣品組，且以不含血清的RPMI 培養(yǎng)液代替黃酮類(lèi)化合物處理細(xì)胞孔板。各組別均設(shè)3 個(gè)平行。

給藥完成后，細(xì)胞孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h 后取出，正常組（CK 組）不加脂多糖，實(shí)驗(yàn)組和模型組（LPS 組）加入脂多糖，使LPS 終濃度為1 μg/mL，將6 孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min。以RPMI 裂解液裂解細(xì)胞收集細(xì)胞總蛋白樣品，并采用WB 法測(cè)定總蛋白中COX-2 含量[16]，以內(nèi)參計(jì)算各組別COX-2 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)細(xì)胞上清液細(xì)胞因子的含量 設(shè)置3 個(gè)組別，各組別設(shè)置同1.2.3，但細(xì)胞接種密度為5×106個(gè)/孔，每孔接種2 mL 細(xì)胞懸液到12孔板中，待實(shí)驗(yàn)組和模型組加入脂多糖后，將孔板放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。收集細(xì)胞上清液，依據(jù)酶聯(lián)免疫法試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA 的含量 實(shí)驗(yàn)組別設(shè)置和細(xì)胞處理同1.2.4。以Trizol 試劑裂解去上清液的細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測(cè)定細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA 的相對(duì)含量，即以2?ΔΔC（T）法計(jì)算各組別相對(duì)模型組（LPS 組）的細(xì)胞因子mRNA 擴(kuò)增倍數(shù)[17]。

樣品中RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、定量方法分別按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

各指標(biāo)引物信息見(jiàn)表2：

表2 熒光定量PCR 法檢測(cè)細(xì)胞因子及內(nèi)參引物信息Table 2 Primer information of cytokines and internal primers in fluorescence quantitative PCR

1.2.6 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核P65 含量設(shè)置3 個(gè)組別，各組別設(shè)置同1.2.3，但細(xì)胞接種密度為5×106個(gè)/孔，每孔接種5 mL 細(xì)胞懸液到直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞孔板中實(shí)驗(yàn)組和模型組加入脂多糖并放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min 后，按試劑盒說(shuō)明分別收集提取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核蛋白樣品，采用WB 法測(cè)定樣品中P65 含量[18]，以內(nèi)參計(jì)算各組別P65 的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算方式同COX-2。

1.2.7 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中IκBα、IKKβ的變化 設(shè)置3 個(gè)組別，各組別設(shè)置同1.2.3，但細(xì)胞接種密度為1×107個(gè)/孔，每孔接種2 mL 細(xì)胞懸液到6 孔板中。待細(xì)胞孔板中實(shí)驗(yàn)組和模型組加入脂多糖并放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min 后，以RPMI 裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，采用WB 法測(cè)定總蛋白中IκBα、IKKβ、P-IκBα、P-IKKβ含量[18]，以內(nèi)參計(jì)算各組別IκBα、IKKβ、P-IκBα、P-IKKβ的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算方式同COX-2。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用軟件SAS 8.0 進(jìn)行LSD 多重比較分析數(shù)據(jù)顯著性，P＜0.05 表明差異顯著，P＜0.01 表明差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮類(lèi)化合物對(duì)TPH-1 單核巨噬細(xì)胞的毒性作用

前期研究表明，在基于脂多糖刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞建立的炎性細(xì)胞模型中，濃度為5 μmol/L 的4 種芹菜素黃酮苷同分異構(gòu)體對(duì)COX-2 酶mRNA 的表達(dá)就具有顯著的差異性抑制作用（P＜0.05），其中，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、牡荊素對(duì)COX-2酶mRNA 的表達(dá)顯示出更好的抑制活性[19]。本研究將進(jìn)一步探究4 種同分異構(gòu)體在5 μmol/L 濃度下的抗炎活性差異及機(jī)理。如表3 所示，與CK 組相比，5 μmol/L 的芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、牡荊素、異牡荊素處理下，細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），表明上述化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞均無(wú)細(xì)胞毒性作用。

表3 黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞的毒性作用Table 3 Toxicity of flavonoids on THP-1 macrophage cells

2.2 黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞炎性模型中COX-2 調(diào)控作用

如圖1 所示，LPS 作用后，THP-1 單核巨噬細(xì)胞炎性模型中COX-2 的表達(dá)極顯著上升（P＜0.01），COX-2 是NF-κB 核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游表達(dá)產(chǎn)物，在特定組織器官發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)被誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有快速應(yīng)答炎性反應(yīng)的特質(zhì)，是炎性反應(yīng)中常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。

圖1 4 種芹菜素黃酮苷對(duì)脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細(xì)胞中COX-2 的影響Fig.1 Influence of 4 apigenin glycosides on COX-2 in THP-1 macrophage cell lines stimulated by LPS

芹菜素等多種黃酮類(lèi)化合物可以作用于巨噬細(xì)胞并對(duì)COX-2 顯示較好的抑制效果[21?23]。在本研究中，牡荊素和異牡荊素均能夠極顯著地抑制COX-2 酶在蛋白水平上的表達(dá)（P＜0.01），且牡荊素的抑制作用顯著優(yōu)于異牡荊素（P＜0.05）。而在筆者前期的研究中[19]，RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞中，牡荊素顯示出較異牡荊素更好的COX-2 酶mRNA 活性0.05），表明在抑制COX-2 基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)方面，C6 位碳苷取代的牡荊素碳強(qiáng)于C8 位碳苷取代的異牡荊素。

2.3 黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞炎性模型細(xì)胞因子的影響

表4 表明1 μg/mL 的LPS 刺激PMA 分化后的THP-1 后，細(xì)胞內(nèi)TNF-α在蛋白水平和基因水平的表達(dá)極顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。脂多糖是誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎性反應(yīng)的較強(qiáng)刺激物[24]，細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子TNF-α含量顯著提高是判斷炎性發(fā)生的重要標(biāo)志之一[25]。此外，脂多糖還可以促進(jìn)細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，LPS 刺激使IL-1β（Interleukin 1β，白細(xì)胞介素1β）的含量極顯著增加（P＜0.01），同時(shí)LPS還極顯著增強(qiáng)了IL-6（Interleukin 6，白細(xì)胞介素6）的含量（P＜0.01），極顯著增加了IL-8（Interleukin 8，白細(xì)胞介素8）和IL-10（Interleukin 10，白細(xì)胞介素10）mRNA 的表達(dá)（P＜0.01）。

表4 4 種芹菜素黃酮苷對(duì)脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的影響Table 4 Influence of 4 apigenin glycosides on cytokines in THP-1 macrophage cell lines stimulated by LPS

與LPS 組相比，2 種芹菜素黃酮碳苷對(duì)細(xì)胞炎性因子的抑制作用強(qiáng)于2 種芹菜素黃酮氧苷。4 種黃酮苷均可顯著降低IL-10 mRNA 的含量（P＜0.01），但5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元對(duì)除IL-10 mRNA外其余各指標(biāo)無(wú)顯著抑制作用（P＞0.05）；而芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)TNF-α的產(chǎn)生有顯著抑制作用（P＜0.05）；此外，牡荊素可以極顯著抑制IL-6 的表達(dá)（P＜0.01）和TNF-αmRNA 的相對(duì)含量（P＜0.05）；異牡荊素可以極顯著抑制IL-1β和IL-6 蛋白的表達(dá)（P＜0.01）、IL-8 基因的轉(zhuǎn)錄（P＜0.01）。綜上，基于對(duì)多種細(xì)胞因子的抑制作用，異牡荊素相較于其他3 種芹菜素黃酮苷顯示出最好的抗炎活性。

值得注意的是，當(dāng)作用濃度為5μmol/L 時(shí)，5-Oβ-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元促進(jìn)了巨噬細(xì)胞中IL-1β表達(dá)升高。脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要組成部分，可以引起強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)以1 μg/mL 脂多糖刺激TPH-1 單核巨噬細(xì)胞建立了炎性細(xì)胞模型。IL-1β是一種主要由單核巨噬細(xì)胞分泌的多效性細(xì)胞因子，作為炎癥反應(yīng)經(jīng)典的促炎因子，在低濃度時(shí)IL-1β可以通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大炎癥反應(yīng)，而局部高濃度的IL-1β則主要發(fā)揮內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用，可以增強(qiáng)宿主巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物的能力和游走能力[25]。實(shí)驗(yàn)濃度下的5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元對(duì)IL-1β分泌的促進(jìn)作用可能由此增強(qiáng)宿主細(xì)胞抵御病原微生物的能力。

2.4 黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞炎性模型中P65 調(diào)控作用

NF-κB 蛋白家族迅速進(jìn)入細(xì)胞核并啟動(dòng)各種κB 依賴(lài)性基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β，同時(shí)細(xì)胞因子可以反饋調(diào)控NF-κB[26]。P65是NF-κB 蛋白家族的重要成員，具有重要的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain，TAD），TAD 結(jié)構(gòu)的存在對(duì)于細(xì)胞因子基因表達(dá)是必不可少的[27]。

通過(guò)計(jì)算P65 蛋白對(duì)內(nèi)參的相對(duì)含量，分析4 種芹菜素黃酮苷對(duì)脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中P65 的影響。脂多糖作用30 min后，細(xì)胞核P65 較大程度地增加（見(jiàn)圖2b）。芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷與8 位碳苷取代形成的異牡荊素均極顯著地抑制了P65 的核移位作用（P＜0.01），即細(xì)胞核內(nèi)P65 含量顯著下降，異牡荊素的8 位碳苷取代強(qiáng)于7 位氧苷取代的抑制作用（P＜0.01），可能由此異牡荊素對(duì)P65 核轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游炎性指標(biāo)如IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10 發(fā)揮了較強(qiáng)的抑制作用。

圖2 黃酮類(lèi)化合物對(duì)脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細(xì)胞核P65 的影響Fig.2 Effects of flavonoids on THP-1 mononuclear macrophage nucleus P65 stimulated by LSP

2.5 黃酮類(lèi)化合物對(duì)THP-1 單核巨噬細(xì)胞炎性模型P-IκBα、P-IKKβ 信號(hào)通路的調(diào)控作用

通過(guò)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量分析黃酮類(lèi)化合物對(duì)脂多糖刺激下THP-1 單核巨噬細(xì)胞中IκBα和IKKβ變化。脂多糖作用30 min 后促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)IκBα和IKKβ發(fā)生磷酸化反應(yīng)（分別以P-IκBα、P-IKKβ進(jìn)行定量）（見(jiàn)圖3b、圖3c）。5 μmol/L 芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷預(yù)處理后，對(duì)IκBα的磷酸化無(wú)顯著影響（P＞0.05），5 μmol/L 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元、牡荊素、異牡荊素則在一定程度上促進(jìn)了IκBα的磷酸化，4 種黃酮類(lèi)化合物均極顯著促進(jìn)了IκBα總表達(dá)量的增加（P＜0.01）。5 μmol/L 5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷芹菜甙元預(yù)處理后，極顯著抑制了IKKβ的表達(dá)（P＜0.01），但4 種黃酮類(lèi)化合物均在一定程度上極顯著地促進(jìn)了IKKβ的磷酸化（P＜0.01）。這表明4 種黃酮類(lèi)化合物的預(yù)處理未對(duì)LPS 刺激THP-1 單核巨噬細(xì)胞下IκBα和IKKβ的磷酸化反應(yīng)發(fā)揮抑制作用。因此，4 種芹菜素黃酮苷并非通過(guò)直接抑制IκBα和IKKβ的磷酸化作用而抑制COX-2 或炎性因子。

3 討 論

黃酮類(lèi)化合物為機(jī)體組織利用并發(fā)揮不同生理活性的過(guò)程中，第一步反應(yīng)即為吸收。大量研究表明黃酮類(lèi)化合物在腸道的主要吸收方式為被動(dòng)擴(kuò)散[28?30]，而分子結(jié)構(gòu)的多樣性與其吸收存在本質(zhì)聯(lián)系，多項(xiàng)研究表明糖苷取代位置及數(shù)目的不同會(huì)影響黃酮類(lèi)化合物的腸吸收。本團(tuán)隊(duì)前期關(guān)于黃酮類(lèi)化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)攝入實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芹菜素苷元的吸收率顯著高于牡荊素和異牡荊素[31?32]。而Chen 等[33]在對(duì)異戊二烯基取代的黃酮類(lèi)化合物的研究表明，當(dāng)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的糖基取代環(huán)上羥基時(shí)，黃酮類(lèi)化合物腸吸收顯著降低；減少一個(gè)糖基后能在一定程度上增加黃酮類(lèi)化合物的吸收，但無(wú)糖基取代的黃酮苷元吸收卻并未如預(yù)期中得以提高，原因在于苷元水溶性差（＜0.5 μg/mL）。而黃酮碳苷是一類(lèi)極性相對(duì)較大的黃酮類(lèi)化合物，在水溶液中具有較好的溶解性，這可能是其本研究中芹菜素黃酮碳苷較其氧苷同分異構(gòu)體發(fā)揮更好抗炎活性的原因之一。

黃酮苷一般會(huì)經(jīng)過(guò)水解代謝為黃酮苷元后，進(jìn)一步在機(jī)體中被吸收利用[34]，吸收利用度和其在體內(nèi)的作用時(shí)間也是導(dǎo)致不同結(jié)構(gòu)黃酮苷發(fā)揮不同生物活性的原因之一。研究表明：牡荊素、異牡荊素等黃酮碳苷在大鼠體內(nèi)吸收較好，吸收迅速，給藥5 min均可檢出，1～2 h 血藥濃度達(dá)到峰濃度，但兩者的吸收率相差不大，分別為5.82%與5.53%[35]。但牡荊素?cái)z入后可快速消除，廣泛分布于各組織，肝、腎組織濃度最高，主要通過(guò)肝臟和腎臟代謝排泄[36]。異牡荊素與牡荊素的消除速度不同，灌胃給藥牡異荊素消除較牡荊素慢，靜脈給藥異牡荊素的消除速度也顯著慢于牡荊素，表明C-8 位的碳苷取代導(dǎo)致了異牡荊素可在機(jī)體存留更長(zhǎng)時(shí)間[37]。因此，盡管牡荊素與異牡荊素具有相近的吸收率，然而異牡荊素在機(jī)體內(nèi)具有更慢的消除速度即更長(zhǎng)的作用時(shí)間，這可能使其抗炎活性強(qiáng)于牡荊素。

黃酮類(lèi)化合物對(duì)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制活性主要在于抑制NF-κB 信號(hào)通路[38]。IKKβ對(duì)NFκB 信號(hào)通路經(jīng)典途徑的激活發(fā)揮著不可取代的作用，在典型的NF-κB 信號(hào)通路經(jīng)典途徑中，IKKβ與IκBα的Ser32 和Ser36 磷酸化存在充分必要條件關(guān)系，然而IκBα磷酸化對(duì)于NF-κB 信號(hào)通路經(jīng)典途徑并不是必須的[29]。本研究中異牡荊素通過(guò)極顯著地降低了NF-κB 蛋白家族中P65 核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生核移位作用（P＜0.01），進(jìn)而極顯著地抑制了下游炎性指標(biāo)COX-2、IL-1β、IL-6 的表達(dá)（P＜0.01），發(fā)揮了較強(qiáng)的抗炎作用。但異牡荊素對(duì)P65 的抑制作用并非是通過(guò)對(duì)上游調(diào)控蛋白IKKβ和IκBα的抑制而實(shí)現(xiàn)的，這表明其對(duì)巨噬細(xì)胞中炎性反應(yīng)的抑制活性并非依賴(lài)于IκBα磷酸化的NF-κB 信號(hào)通路。后續(xù)可對(duì)IkBα上游通路中AKT、PDK1、PI3K 等蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)分析，探究異牡荊素的抗炎機(jī)制。

4 結(jié) 論

研究基于THP-1 單核巨噬細(xì)胞評(píng)價(jià)了2 種芹菜素黃酮氧苷和2 種芹菜素黃酮碳苷的抗炎活性，結(jié)果顯示芹菜素黃酮碳苷相對(duì)其黃酮氧苷具有更好的抗炎活性，尤其異牡荊素極顯著抑制了COX-2、IL-1β和IL-6（P＜0.01）的表達(dá)，極顯著抑制核轉(zhuǎn)錄因子P65 的入核（P＜0.01），發(fā)揮了最強(qiáng)的抗炎作用，但異牡荊素未通過(guò)抑制IκBα、IKKβ而抑制NF-κB 蛋白家族P65 的核移位作用，即在人源的THP-1 單核巨噬細(xì)胞炎性模型中，異牡荊素對(duì)抗炎活性并非是通過(guò)IκBα依賴(lài)的NF-κB 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。