雷長(zhǎng)毅，汪開拓，譚美琳，王勁松，黎春紅

（重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，重慶 404000）

李（Prunus salicinaLindl.）為薔薇科李屬植物，其成熟果實(shí)的果色多樣，口感酸甜多汁且富含諸多有益人體健康的生物活性化合物，如多酚類化合物、類胡蘿卜素和抗壞血酸等，因此深受大眾歡迎[1]。但李果實(shí)屬于呼吸躍變型果實(shí)，且采摘期又逢高溫季節(jié)（6～8 月），采后呼吸和乙烯釋放速率高，果實(shí)在貯藏期間迅速軟化，因此易受到病原菌侵染而加速果實(shí)腐爛，從而失去商業(yè)性，其中，匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）是主要的致病菌，極易引起李果實(shí)采后品質(zhì)劣變，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。以化學(xué)殺菌劑（如噻菌靈、仲丁胺、撲海因等）來(lái)控制李果實(shí)采后病害的效果極為顯著，但化學(xué)殘留及病原菌耐藥性等問題嚴(yán)重限制了藥劑保鮮的應(yīng)用[3]?，F(xiàn)階段，眾多綠色環(huán)保的化學(xué)激發(fā)子如水楊酸、茉莉酸及其甲酯衍生物、苯丙噻唑硫代乙酸甲酯（BTH）、β-氨基丁酸（BABA）、油菜素內(nèi)酯等均被證實(shí)可有效誘導(dǎo)果蔬抗病性，降低病害發(fā)生率[4]。因此，采用激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)采后抗性是替代化學(xué)殺菌劑的可能途徑。誘導(dǎo)抗病性包括直接誘導(dǎo)作用和敏化（Priming）反應(yīng)，Priming 反應(yīng)是指植物經(jīng)激發(fā)子處理后只有受到病原菌侵染時(shí)才展現(xiàn)出更快、更強(qiáng)的抗病性反應(yīng)，包括抗病基因表達(dá)、植保素合成等，是一種低成本、高效的抗病防御機(jī)制[5]。

褪黑素（melatonin，MT）是動(dòng)植物中廣泛存在的一種吲哚胺類激素，可參與眾多信號(hào)傳導(dǎo)過程從而調(diào)控細(xì)胞抗逆性反應(yīng)以及能量和物質(zhì)代謝[6]。研究表明，采后MT 處理可顯著抑制采后香蕉[7]和梨果實(shí)[8]中乙烯合成，并維持桃[9]、荔枝[10]、石榴[11]等果實(shí)活性氧代謝平衡，進(jìn)而延緩這些果實(shí)在貯藏期間的品質(zhì)劣變速度。此外，外源MT 還可誘導(dǎo)模式作物擬南芥和煙草中水楊酸和乙烯介導(dǎo)的一系列防御基因的表達(dá)，激活植株防衛(wèi)反應(yīng)[12]。但MT 處理對(duì)采后果實(shí)抗病性的具體誘導(dǎo)模式仍不明確。本研究以“鳳凰”李果實(shí)為試材，通過研究MT 處理對(duì)李果實(shí)貯藏期間H2O2、抗性相關(guān)酶活性及苯丙烷類代謝的影響，分析MT 對(duì)李果實(shí)抗病性的誘導(dǎo)作用，為MT 處理在李果實(shí)實(shí)際保鮮中的推廣提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

八分熟的“鳳凰”李（Prunus salicinacv ‘Fenghuang’） 于2020 年6 月采自四川省遂寧市船山區(qū)仁里鎮(zhèn)有機(jī)李種植基地，采摘后2 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，先將有病蟲害和機(jī)械傷的李果實(shí)去除，挑選轉(zhuǎn)色均勻、大小一致的果實(shí)攤于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，經(jīng)自然風(fēng)散去田間熱；匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）參考Li 等[13]的方法進(jìn)行分離、純化及鑒定，以傳代培養(yǎng)后的菌絲體為材料，用無(wú)菌生理鹽水緩慢沖洗出成熟根霉孢子，并將孢子濃度稀釋為1.0×105個(gè)/mL（血球計(jì)數(shù)板），現(xiàn)配現(xiàn)用；褪黑素（MT）、幾丁質(zhì)、Follin 試劑、4-香豆酸 美國(guó)Sigma 公司；鄰苯二酚、亞油酸鈉、L-苯丙氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、亞硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、愈創(chuàng)木酚 重慶拓世眾和生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸（DNS）、昆布多糖、對(duì)二甲氨基甲醛（DMAB） 上海源葉有限公司。

PAL-1 型數(shù)顯折光儀 日本愛拓公司；DW-86L328 型超低溫冰箱 浙江捷勝設(shè)備有限公司；HWS-P400C 恒溫恒濕培養(yǎng)箱 合肥達(dá)斯卡特科技有限公司；UT-1900 型全波長(zhǎng)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 MT 處理濃度參考Bal[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行確定。李果實(shí)以75%（v/v）乙醇溶液表面擦拭并晾干，隨后用無(wú)菌解剖針在果實(shí)最大橫截面處對(duì)稱穿孔2 個(gè)（2 mm×2 mm），隨后隨機(jī)劃分為4 份：對(duì)照組：用移液槍在李果實(shí)穿刺部位注入15 μL 無(wú)菌蒸餾水；MT 處理組：將10 μL 濃度為10 mmol/L 的MT溶液注入李果實(shí)穿刺部位；R.stolonifer接種組：每個(gè)穿刺部位注入15 μL 的1.0×105個(gè)/mL 的孢子懸浮液；MT+R.stolonifer處理組：先在李果實(shí)穿刺部位注入15 μL 10 mmol/L 的MT 溶液，于20 ℃放置6 h，隨后在各穿刺處接種15 μL 的1.0×105個(gè)/mLR.stolonifer孢子懸浮液。以上處理完成后，用PE 塑料盒進(jìn)行分裝，每盒6 顆果實(shí)，每個(gè)處理組共15 盒，置于（20±1）℃、80 %～90% RH 條件下貯藏5 d。在此期間每天觀察李果實(shí)根霉病的發(fā)病情況，同時(shí)取樣用無(wú)菌手術(shù)刀切取健康果肉組織于液氮速凍再置于?80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。各處理均重復(fù)3 次，整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.2.2 發(fā)病率和病斑直徑的測(cè)定 李果實(shí)病斑直徑超過2 mm 時(shí)，則可認(rèn)為是發(fā)病果；病果病斑直徑用游標(biāo)卡尺直接確定。

1.2.3 H2O2含量的測(cè)定 稱取1 g 果實(shí)凍樣，加入5 mL冷丙酮?jiǎng)驖{，勻漿液超聲提取1 h 后于2 ℃，10000×g離心10 min。收集上清液根據(jù)Patterson 等[15]的方法測(cè)定H2O2含量，結(jié)果以nmol/g FW 表示。

1.2.4 細(xì)胞壁水解酶活性的測(cè)定 根據(jù)Abeles 等[16]的方法測(cè)定幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，以每小時(shí)催化生成1 mg N-乙酰葡萄糖胺為1 個(gè)幾丁質(zhì)酶活單位，以每小時(shí)形成1 mg 葡萄糖為1 個(gè)β-1,3-葡聚糖酶活單位；以上酶活性結(jié)果均以U/g FW 表示。

1.2.5 苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶活性的測(cè)定 根據(jù)Zucker[17]的方法測(cè)定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，每小時(shí)反應(yīng)液在290 nm 處吸光度增加0.01 為1 個(gè)酶活力單位；根據(jù)范存斐等[18]的方法測(cè)定肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）和4-香豆酸輔酶A 連接酶（4-CL）活性，以每小時(shí)反應(yīng)液在340 nm 處吸光度增加0.01為1 個(gè)C4H 酶活性單位，以每分鐘反應(yīng)液在333 nm處吸光度增加0.01 為1 個(gè)4-CL 酶活性單位；根據(jù)Cao 等[19]的方法測(cè)定過氧化物酶（POD）活性，以每分鐘酶促反應(yīng)體系在470 nm 處吸光度增加0.01 為1 個(gè)酶活性單位；以上酶活性結(jié)果均以U/g FW 表示。

1.2.6 總酚及木質(zhì)素含量的測(cè)定 根據(jù)Flion-Ciocalteu 法[20]測(cè)定總酚含量；木質(zhì)素含量則參照Wang等[21]的方法進(jìn)行測(cè)定?？偡雍湍举|(zhì)素含量結(jié)果均以mg/g FW 表示。

1.2.7 脂氧合酶（LOX）和多酚氧化酶（PPO）活性的測(cè)定 根據(jù)Lin 等[22]的方法測(cè)定LOX 活性，略有修改；用4 ℃預(yù)冷的磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH6.8）冰浴提取LOX 粗酶液。取2.75 mL 0.1 mol/L、pH5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.05 mL 濃度為0.1 mol/L 的亞油酸鈉溶液，在30 ℃保溫10 min 后加入0.2 mL 粗酶液混勻，以反應(yīng)液每分鐘在234 nm 處吸光度增加0.01 為1 個(gè)LOX 活性單位；根據(jù)Cao 等[19]的方法測(cè)定PPO 活性，以每分鐘酶促反應(yīng)體系420 nm 處吸光度增加0.01 為1 個(gè)酶活性單位；以上酶活性結(jié)果均以U/g FW 表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

除果實(shí)根霉病發(fā)病率和病斑直徑重復(fù)測(cè)定5 次外，其余各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次。繪圖采用Excel 2010，差異顯著性檢驗(yàn)采用SPSS26.0（Duncan 多重比較法），其中顯著水平設(shè)定為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)根霉病的影響

對(duì)照組和MT 處理組李果實(shí)的表觀無(wú)明顯變化，未見明顯的發(fā)病果實(shí)；李果實(shí)接種R.stolonifer后發(fā)病率不斷上升，同時(shí)病斑直徑也急劇增加。貯藏5 d 后，MT+R.stolonifer接種組的果實(shí)發(fā)病率為55.35%，病斑直徑為14.31 mm，較只接種R.stolonifer的果實(shí)分別下降了36.24%和45.65%，說明MT 處理能夠有效控制李果實(shí)采后病害的發(fā)生（圖1A、B）。

圖1 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)發(fā)病率（A）和病斑直徑（B）的影響Fig.1 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on disease incidence（A）and lesion diameter（B）in postharvest plums

2.2 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)H2O2含量的影響

如圖2 所示，對(duì)照李果實(shí)在20 ℃貯藏期間H2O2含量呈緩慢上升趨勢(shì)。單一MT 處理組與對(duì)照組之間的H2O2含量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而接種R.stolonifer的李果實(shí)H2O2含量大幅上升，并在貯藏第1 d 達(dá)峰值，隨后不斷下降，由于果蔬在受到病原菌侵染時(shí)會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，H2O2迸發(fā)是典型的應(yīng)激反應(yīng)，所以在接種后會(huì)大量生成。與單一接種R.stolonifer的果實(shí)相比，MT+R.stolonifer接種則更為顯著（P＜0.05）的誘導(dǎo)了李果實(shí)中H2O2的生成，其含量峰值較單一接種組上升了31.90%。

圖2 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)H2O2 含量的影響Fig.2 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on H2O2 content in postharvest plums

2.3 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)細(xì)胞壁水解酶活性的影響

如圖3 所示，對(duì)照李果實(shí)中幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性在整個(gè)貯藏期間保持穩(wěn)定。經(jīng)單一MT 處理的果實(shí)中幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性在貯藏期間逐漸上升，在貯藏3 d 后其活性顯著（P＜0.05）高于對(duì)照組水平；接種R.stolonifer后，幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性迅速上升，并在第1 d達(dá)到峰值水平，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，因?yàn)閹锥≠|(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶對(duì)病原菌有抑制作用，是植物中典型的抗病相關(guān)酶，所以當(dāng)葡萄果實(shí)遭受病原菌侵染時(shí)，其活性被立即誘導(dǎo)。MT+R.stolonifer接種處理可明顯誘導(dǎo)兩種酶在整個(gè)貯藏期間保持較高活性，其活性值在各取樣點(diǎn)均顯著（P＜0.05）高于單一接種R.stolonifer果實(shí)。

圖3 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)幾丁質(zhì)酶（A）、β-1,3-葡聚糖酶（B）活性的影響Fig.3 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on the activities of chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B) in postharvest plums

2.4 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶活性的影響

如圖4 所示，在貯藏期間，對(duì)照組李果實(shí)中PAL 和4-CL 的活性基本維持穩(wěn)定，C4H 和POD 活性則緩慢上升。MT 處理可有效提高上述苯丙烷類代謝途徑關(guān)鍵酶活性。李果實(shí)接種R.stolonifer后，PAL、C4H、4-CL 和POD 活性迅速上升；MT+R.stolonifer接種處理可更為顯著誘導(dǎo)李果實(shí)中PAL、C4H、4-CL 和POD 活性的上升，使酶活性在整個(gè)貯藏期間均顯著（P＜0.05）高于單一接種處理水平。

圖4 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)PAL（A）、C4H（B）、4-CL（C）和POD（D）活性的影響Fig.4 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on the activities of PAL (A),C4H (B),4-CL (C) and POD (D) in postharvest plums

2.5 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)總酚及木質(zhì)素含量的影響

如圖5 所示，對(duì)照組李果實(shí)在20 ℃貯藏過程中，其總酚和木質(zhì)素含量在第1 d 達(dá)峰值，隨后逐漸降低。MT 處理有效促進(jìn)了李果實(shí)總酚和木質(zhì)素含量的積累，使兩者含量在貯藏期間顯著（P＜0.05）高于對(duì)照水平。R.stolonifer接種顯著提高了李果實(shí)總酚和木質(zhì)素的含量，但經(jīng)MT+R.stolonifer接種處理的果實(shí)中總酚及木質(zhì)素含量在整個(gè)貯藏期間均顯著（P＜0.05）高于單一接種組水平。

圖5 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)總酚（A）和木質(zhì)素（B）含量的影響Fig.5 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on total phenolic (A) and lignin (B) content in postharvest plums

2.6 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)LOX和PPO 活性的影響

如圖6 所示，采后貯藏期間，對(duì)照組李果實(shí)中LOX 活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢上升，同時(shí)PPO活性基本維持穩(wěn)定。單一MT 處理組李果實(shí)中LOX活性在貯藏期間緩慢上升，PPO 活性保持穩(wěn)定。R.stolonifer接種顯著（P＜0.05）誘導(dǎo)李果實(shí)LOX 和PPO 活性水平的上升；而與單一R.stolonifer接種組相比，MT+R.stolonifer接種處理可更顯著（P＜0.05）提升李果實(shí)貯藏期間這兩種酶的活性水平，使其保持在較高水平。

圖6 MT 處理和R.stolonifer 接種對(duì)采后李果實(shí)LOX（A）和PPO（B）活性的影響Fig.6 Effects of MT treatment and R.stolonifer inoculation on the activities of LOX (A) and PPO (B) in postharvest plums

3 討論

MT 為植物內(nèi)源吲哚類激素，其通過信號(hào)傳導(dǎo)作用參與植物的眾多抗逆反應(yīng)[23]。外源MT 處理可有效延緩番茄[24]、水蜜桃[9]、櫻桃[25]和草莓[26]等多種果實(shí)的采后衰老進(jìn)程，維持果實(shí)綜合品質(zhì)。在本研究中，10 mmol/L MT 處理可有效誘導(dǎo)李果實(shí)中活性氧迸發(fā)、提高抗病相關(guān)酶活性并促進(jìn)總酚和木質(zhì)素的合成，從而抑制采后貯藏期間果實(shí)根霉病的發(fā)生，維持果實(shí)的綜合品質(zhì)。

根據(jù)植物誘導(dǎo)抗性理論，抗病性的表達(dá)是一種典型植物應(yīng)激反應(yīng)，可調(diào)動(dòng)組織和細(xì)胞內(nèi)的底物和能量從正常的代謝途徑轉(zhuǎn)入病程相關(guān)基因（pathogenesis-relatedgenes，PRs）的表達(dá)和抑菌物質(zhì)的合成，因此可能限制植物的生長(zhǎng)和發(fā)育；priming 反應(yīng)是植物免疫系統(tǒng)的共同特征，也是植物誘導(dǎo)抗病性的重要細(xì)胞機(jī)制，是一種基于代謝平衡和防衛(wèi)反應(yīng)的植物抗性模式，可顯著減少植物的適應(yīng)度損失[27]。研究表明，多種物理、化學(xué)和生物等激發(fā)子在低濃度狀態(tài)下使用時(shí)，均可有效誘導(dǎo)果實(shí)的priming 反應(yīng)，從而使果實(shí)在受到病原菌嚴(yán)重侵染時(shí)表達(dá)強(qiáng)烈抗性。團(tuán)隊(duì)前期研究也證明，BABA（10～50 mmol/L）、BTH（0.1 mmol/L）和茉莉酸甲酯（10 μmol/L）等激發(fā)子均可通過誘導(dǎo)楊梅[21]、草莓[28]和葡萄[29]等果實(shí)的priming 反應(yīng)，來(lái)提升果實(shí)采后抗性，同時(shí)也促進(jìn)了可溶性糖的積累。此外，H2O2迸發(fā)是植物受到病原微生物侵染的典型應(yīng)激反應(yīng)，其充當(dāng)信號(hào)分子啟動(dòng)植物超敏反應(yīng)，從而提升果實(shí)抗性反應(yīng)[30]；幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶為植物重要的細(xì)胞壁水解酶，其可特異性水解真菌細(xì)胞壁，阻礙病原菌的進(jìn)一步侵染[16]；植物苯丙烷類代謝途徑是合成酚類和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的主要途徑，PAL、4-CL、C4H 和POD 是該途徑的關(guān)鍵酶類[31]。LOX 不僅參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老等過程，在乙烯介導(dǎo)的抗病反應(yīng)中也起著重要的調(diào)控作用[22]。在本研究中，經(jīng)單一10 mmol/L MT 處理的李果實(shí)中苯丙烷類代謝酶以及總酚和木質(zhì)素含量在整個(gè)貯藏期間均高于對(duì)照果實(shí)，但MT處理對(duì)抗病相關(guān)酶的誘導(dǎo)作用有限；當(dāng)經(jīng)MT 處理的果實(shí)再接種R.stolonifer后，果實(shí)內(nèi)H2O2含量、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖活性以及苯丙烷類代謝酶（PAL、4-CL、C4H 和POD）活性、木質(zhì)素和總酚含量在貯藏第1 d均出現(xiàn)明顯峰值，并在整個(gè)貯藏期間均顯著高于單一接種水平。這些結(jié)果說明，MT 處理誘導(dǎo)的李果實(shí)抗病反應(yīng)可歸為priming 反應(yīng)類型，即單一MT 處理可使果實(shí)處于防御準(zhǔn)備（primed）狀態(tài)，隨后病原菌侵染時(shí)則迅速激活并放大防衛(wèi)反應(yīng)，阻止病原菌的進(jìn)一步侵染，從而降低腐爛率并縮小病斑直徑。此外，MT+R.stolonifer處理也能顯著誘導(dǎo)LOX活性的上升，暗示MT 誘導(dǎo)的李果實(shí)priming 反應(yīng)可能是由乙烯介導(dǎo)的ISR（induced systemic resistance，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性）類型。與本研究相類似，眾多根瘤菌也可通過乙烯或茉莉酸途徑誘導(dǎo)植物的priming 反應(yīng)[32]。但同時(shí)，MT 也可通過水楊酸（SA）途徑誘導(dǎo)采后草莓果實(shí)SAR（systemic acquired resistance，系統(tǒng)獲得性抗性）反應(yīng)從而提高抗病性[26]。因此，MT 調(diào)控不同信號(hào)傳導(dǎo)路徑防衛(wèi)反應(yīng)的相關(guān)分子機(jī)理有待進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

a.10 mmol/ L MT 可有效誘導(dǎo)采后李果實(shí)抗病相關(guān)酶活性以及總酚和木質(zhì)素含量的提高，從而提升抗病性，減少采后貯藏期間根霉病的發(fā)生。

b.經(jīng)MT 誘導(dǎo)的李果實(shí)在遭受病原菌侵染時(shí)可展現(xiàn)出強(qiáng)烈的活性氧迸發(fā)、較高的抗病相關(guān)酶活性及抗病相關(guān)物質(zhì)含量增加，暗示該防衛(wèi)反應(yīng)歸因于一種典型的priming 反應(yīng)機(jī)制。