黃 雨，劉魏紅，王洪陽，朱倩兒，郎曉曉，王 唯，陳生龍，于 慧

（魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東煙臺 264025）

裙帶菜（Undaria pinnatifida）隸屬于褐藻門、褐子綱、海帶目、翅藻科、裙帶菜屬，是一種大型溫帶經(jīng)濟(jì)褐藻，在我國主要分布于大連、煙臺和榮成等海域[1?2]。孢子葉是裙帶菜的繁殖器官，因其含較多纖維物質(zhì)且質(zhì)地較硬，食用口感較差，在加工過程中常作為廢料被丟棄，造成資源浪費和環(huán)境污染[3?4]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，孢子葉中含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，除多糖外，其蛋白質(zhì)含量約為16%，且含有褐藻多酚、巖藻黃素等多種生物活性物質(zhì)，可起到抗癌、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等功效，是功能性食品開發(fā)的良好原料[5?6]。就目前而言，對裙帶菜孢子葉的研究主要集中于多糖的提取，有關(guān)其蛋白質(zhì)的研究較少，并且大多采用傳統(tǒng)提取方法。有關(guān)研究表明，多肽是天然的抗氧化劑，能有效預(yù)防衰老及其他免疫疾病[7?9]。

仿生酶解，運用了化學(xué)仿生，是在酶解法的基礎(chǔ)上，模擬消化道的酸堿環(huán)境，蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)到達(dá)胃腸道后，在消化酶、酸堿環(huán)境等的作用下，被酶解成小分子物質(zhì)，進(jìn)而被人體吸收[10]。與其他酶解方法相比，仿生酶解具有作用條件溫和、水解度高、反應(yīng)周期短，模擬生物體機(jī)能，使蛋白以小肽的形式吸收更適合人體消化吸收利用的優(yōu)點[11?14]。揣欣欣等[15]使用仿生酶解工藝，對鹿骨蛋白依次用胃蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行酶解，得到的酶解肽通過體外抗氧化實驗表明，鹿骨多肽對DPPH、OH 自由基具有良好的清除能力。姜豐等[16]通過體外模擬胃腸道消化功能，研究卵白蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化活性中發(fā)現(xiàn)，卵白蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解后所得產(chǎn)物的體外抗氧化活性增強(qiáng)并與產(chǎn)物濃度呈明顯的劑量-依賴關(guān)系。韓榮欣等[17]對酸棗仁蛋白依次用胃蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行體外模擬消化的實驗顯示，經(jīng)模擬胃腸消化后，DPPH、ABTS、O2?、OH 自由基清除率分別高達(dá)81.25%、90.40%、47.51%、32.66%，通過仿生酶解工藝得到的酶解肽具有較好的氨基酸組成和抗氧化活性。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者對藻類源抗氧化肽做了大量研究，發(fā)現(xiàn)其相比合成肽具有成本低、副作用小、有助于人體健康等優(yōu)勢[18]。研究表明，蛋白的水解程度以及抗氧化活性與酶解工藝直接相關(guān)，采取雙酶法比單酶法有更好的酶解效果[19]。本團(tuán)隊前期利用仿生酶解技術(shù)從孢子葉中制備了抗腫瘤多肽，發(fā)現(xiàn)其對人胃癌細(xì)胞（SGC7901）、胰腺癌細(xì)胞（SW1990）和結(jié)腸癌細(xì)胞（LS180）的體外生長均有一定的抑制作用[20]。本實驗在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用仿生酶解工藝對裙帶菜孢子葉進(jìn)行酶解，以多肽得率和水解度為主要指標(biāo)，通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗確定最優(yōu)酶解工藝條件，對仿生酶解后的裙帶菜孢子葉多肽進(jìn)行抗氧化研究，并通過DPPH、ABTS、OH 自由基清除率參數(shù)來評價裙帶菜孢子葉的抗氧化活性，旨在為仿生酶解制備生物活性肽和裙帶菜孢子葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裙帶菜孢子葉干 山東省榮成科林水產(chǎn)食品有限公司；胃蛋白酶（1:15000）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白酶（1:250）、菲啰嗪、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）≥98% 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白 標(biāo)準(zhǔn)品，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）梯希愛（上海）化工工業(yè)發(fā)展有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；KH19A 離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；PB-10 Sartorious 普及型pH 計 德國賽多利斯股份有限公司；UV-1300 紫外可見分光光度計 上海美析儀器有限公司；XMTD-204 水浴恒溫振蕩器 金壇市天竟實驗儀器廠；LGJ-18S 真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；RE-52B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 裙帶菜孢子葉仿生酶解工藝 將裙帶菜孢子葉干粉碎后過40 目篩，取1 g 裙帶菜粉末于100 mL超純水中，進(jìn)行超聲破壁處理（超聲功率720 W、超聲時間40 min）。酶解過程使用0.05 mol/L 的HCl和NaOH 溶液來調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH，先將pH 調(diào)節(jié)至2.0 后加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解（37 ℃、2.5 h），然后進(jìn)行滅酶處理（80 ℃，15 min），后將pH 調(diào)節(jié)至8.0，加入胰蛋白酶再次進(jìn)行酶解（37 ℃、3 h），然后再次滅酶（80 ℃，15 min），將酶解液離心后（5000 r/min，20 min），取其上清液，最終得到酶解液[21]。

1.2.2 酶解條件單因素實驗 以裙帶菜孢子葉多肽的水解度和多肽得率為指標(biāo)，主要考察超聲功率、超聲時間、料液比、胃蛋白酶量、胰蛋白酶量、胃蛋白酶酶解時間、胰蛋白酶酶解時間對裙帶菜孢子葉多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.1 超聲功率的確定 在料液比1:50 g/mL、超聲破壁40 min、加胃蛋白酶量6%、加胰蛋白酶量3%、胃蛋白酶酶解時間2 h、胰蛋白酶酶解時間3 h的條件下，選取超聲功率為450、540、630、720、810 W，考察超聲功率對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.2 超聲破壁時間的確定 在料液比1:50 g/mL、超聲功率720 W、加胃蛋白酶量6%、加胰蛋白酶量3%、胃蛋白酶解時間2 h、胰蛋白酶酶解時間3 h 的條件下，選取超聲破壁時間為20、30、40、50、60 min，考察超聲破壁時間對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.3 料液比的確定 在超聲破壁40 min、超聲功率720 W、加胃蛋白酶量6%、加胰蛋白酶量3%、胃蛋白酶酶解時間2 h、胰蛋白酶酶解時間3 h 的條件下，選取料液比為1:25、1:50、1:75、1:100、1:125 g/mL，考察料液比對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.4 胃蛋白酶量的確定 在料液比1:100 g/mL、超聲破壁40 min、超聲功率720 W、加胰蛋白酶量3%、胃蛋白酶酶解時間2 h、胰蛋白酶酶解時間3 h 的條件下，選取加胃蛋白酶量為4%、5%、6%、7%、8%，考察加胃蛋白酶量對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.5 胰蛋白酶量的確定 在料液比1:100 g/mL、超聲破壁40 min、超聲功率720 W、加胃蛋白酶量6%、胃蛋白酶酶解時間2 h、胰蛋白酶酶解時間3 h 的條件下，選取加胰蛋白酶量為1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察加胰蛋白酶量對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.6 胃蛋白酶酶解時間的確定 在料液比1:100 g/mL、超聲破壁40 min、超聲功率720 W、加胃蛋白酶量6%、加胰蛋白酶量5%、胰蛋白酶酶解時間3 h 的條件下，選取胃蛋白酶酶解時間為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，考察胃蛋白酶酶解時間對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.2.7 胰蛋白酶酶解時間的確定 在料液比1:100 g/mL、超聲破壁40 min、超聲功率720 W、加胃蛋白酶量6%、加胰蛋白酶量5%、胃蛋白酶酶解時間2.5 h 的條件下，選取胰蛋白酶酶解時間為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，考察胰蛋白酶酶解時間對裙帶菜多肽得率和水解度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，運用Box-Behnken 設(shè)計原理[22]，以料液比（A）、胃蛋白酶量（B）、胰蛋白酶酶解時間（C）為變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，因素與水平設(shè)計見表1。采用F檢驗的方法對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析以評價模型的統(tǒng)計意義。

1.2.4 多肽得率的測定 參照文獻(xiàn)[23]的方法并稍作修改，以牛血清白蛋白對照品溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.4766x?0.0159（R2=0.9947）。樣品的測定：取0.1 mL 酶解液、0.9 mL 蒸餾水于試管中，先后加入1 mL 的堿性銅試液和4 mL 的福林酚試劑，搖勻。置于55 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，取出放冷水中10 min，然后在650 nm 的波長處測定其吸光度，并以蒸餾水作空白實驗，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算裙帶菜樣品的多肽得率（W）。計算公式如下:

式中：W 為多肽得率（%）；A 為樣品測得的吸光度；V 為樣品酶解后上清液體積（mL）；10 為稀釋倍數(shù)；M 為裙帶菜樣品的質(zhì)量（g）。

1.2.5 水解度的測定 參考文獻(xiàn)[24]取滅酶后10 mL酶解液置于50 mL 燒杯中，加蒸餾水10 mL，開動磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，用0.01 mol/L NaOH 溶液滴定至pH8.2，加入10 mL 中性甲醛溶液，混勻，用0.01 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2，記錄消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V，同時取20 mL 蒸餾水按上述方法作空白實驗，記錄消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V0。水解度（DH）計算公式如下:

式中：C 為NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mol/L）；V 為酶解液消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；V0為空白液消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）；N 為底物樣品總氮含量（g）；0.014 為氮毫克當(dāng)量。

1.2.6 酶解肽的制備工藝 在酶解液中加乙醇至體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，醇沉12～16 h，過濾后離心（8000 r/min、15 min）得到上清液。上清液經(jīng)濃縮后加入2%活性炭脫色2 h，過濾后濃縮凍干獲得多肽粉[21]。

1.2.7 抗氧化性的測定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[25?26]的方法并稍作修改，取2.00 mL 不同濃度的樣品溶液于不同的試管中，配置濃度為0.1 mol/L DPPH-乙醇溶液，向每個試管中加入2.00 mL DPPH-乙醇溶液，立即混勻，室溫下暗反應(yīng)0.5 h，于517 nm處測定溶液吸光值A(chǔ)1。同時以乙醇代替DPPH乙醇溶液作空白實驗測定其吸光度值A(chǔ)2，以蒸餾水代替樣品溶液作對照實驗測定其吸光度值A(chǔ)0。設(shè)置陽性對照（VC），樣品測定結(jié)果與VC對照組比較。計算公式如下:

1.2.7.2 ABTS 自由基清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[27]的方法并稍作修改，將ABTS（38.4 mg）溶于過硫酸鉀溶液中，避光12～16 h，生成ABTS 自由基陽離子，再用磷酸緩沖溶液（pH7.4）進(jìn)行稀釋，調(diào)734 nm 處吸光值為0.7±0.2；取0.1 mL 不同濃度的樣品溶液與3.9 mL ABTS 工作液混合，室溫避光反應(yīng)6 min，于734 nm 處測吸光值A(chǔ)1。同時以磷酸緩沖溶液代替ABTS 工作液作空白實驗測定其吸光度值A(chǔ)2，以蒸餾水代替樣品溶液作對照實驗測定其吸光度值A(chǔ)0。按下式計算ABTS自由基清除率:

1.2.7.3 OH 自由基清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[28]的方法并稍作修改，分別取1.00 mL 不同濃度的樣品溶液于試管中，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液，9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，8.8 mmol/L H2O2溶液各1.00 mL，混合均勻，于37 ℃條件下水浴30 min，510 nm 處測定溶液吸光值A(chǔ)1。同時以蒸餾水代替H2O2溶液作為空白實驗測定其吸光度值A(chǔ)2，以蒸餾水代替樣品作對照實驗測定其吸光度值A(chǔ)0。羥自由基清除率的計算方法如下所示:

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差的統(tǒng)計分析并繪圖，采用Design-Expert 10 對響應(yīng)面分析實驗結(jié)果進(jìn)行作圖分析，其中使用ANOVA 程序作數(shù)據(jù)分析，使用Model Graphs 程序作響應(yīng)面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率的選擇 由圖1 可知，隨著超聲功率的增大，在一定范圍內(nèi)，裙帶菜孢子葉的酶解產(chǎn)物的多肽得率和水解度是上升的，當(dāng)超聲功率達(dá)到720 W時，兩者均達(dá)到最大值，多肽得率達(dá)到16.17%，水解度達(dá)到39.96%。這是因為在450～720 W 范圍內(nèi)，超聲空化產(chǎn)生的流體剪切力快速地破壞細(xì)胞壁，酶結(jié)合位點增多，使得蛋白質(zhì)的逸出加速，帶有疏水側(cè)鏈的殘基與水分子接觸，通過疏水作用加速了蛋白質(zhì)的溶解，使多肽得率和水解度均上升[29]。當(dāng)超聲功率超過720 W 后，多肽得率和水解度均呈下降趨勢。這可能是因為：超聲功率過大不利于裙帶菜溶液在超聲中形成對流，降低了超聲破壁的效率，從而導(dǎo)致多肽得率下降；蛋白質(zhì)分子過度松散，疏水作用過強(qiáng)，蛋白質(zhì)聚合成難溶的聚集體沉積在液體中，處于水分子周圍的蛋白質(zhì)區(qū)域減少，難以溶解，從而導(dǎo)致水解度下降[30]。因此，超聲功率的最優(yōu)選擇是720 W。

圖1 超聲功率對多肽得率和水解度的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on polypeptide yield and degree of hydrolysis

2.1.2 超聲時間的選擇 由圖2 可知，隨著超聲時間的增大，在一定范圍內(nèi)，裙帶菜孢子葉酶解產(chǎn)物的多肽得率和水解度是上升的，當(dāng)超聲時間達(dá)到40 min時，兩者均達(dá)到最大值，多肽得率達(dá)到15.08%，水解度達(dá)到37.89%。這是由于在20～40 min 超聲過程中，破壁程度上升，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，官能團(tuán)也隨之展露出來，蛋白質(zhì)的水合作用增強(qiáng)[31]，使多肽得率和水解度均上升。當(dāng)超聲破壁時間超過40 min 時，多肽得率和水解度均呈下降趨勢。這可能是因為：當(dāng)超聲時間超過40 min 時，裙帶菜孢子葉溶液有黑色沉淀形成，超聲時間太長導(dǎo)致蛋白質(zhì)碳化，從而引起多肽得率和水解度的降低[32]。因此，超聲時間的最優(yōu)選擇是40 min。

圖2 超聲時間對多肽得率和水解度的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on polypeptide yield and degree of hydrolysis

2.1.3 料液比的選擇 由圖3 可知，隨著料液比的增大，在一定范圍內(nèi)，裙帶菜孢子葉的酶解產(chǎn)物的多肽得率和水解度是上升的，當(dāng)料液比達(dá)到1:100 g/mL時，兩者均達(dá)到最大值，多肽得率達(dá)到23.32%，水解度達(dá)到37.63%。這是因為在料液比為1:25～1:100 g/mL 范圍內(nèi)時，由于水分含量過少，減少了裙帶菜孢子葉底物和胃蛋白酶、胰蛋白酶的擴(kuò)散和接觸，從而對酶解產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)料液比小于1:100 g/mL時，多肽得率和水解度均逐漸降低，這說明裙帶菜孢子葉底物和胃蛋白酶、胰蛋白酶的濃度過小而導(dǎo)致它們之間的碰撞幾率下降，酶解蛋白不夠徹底，從而使多肽得率和水解度降低[33]。因此，料液比的最優(yōu)選擇是1:100 g/mL。

圖3 料液比對多肽得率和水解度的影響Fig.3 Effect of solid to liquid ratio on polypeptide yield and degree of hydrolysis

2.1.4 蛋白酶量的選擇 由圖4 和圖5 可知，隨著胃蛋白酶和胰蛋白酶量的增大，在一定范圍內(nèi)，裙帶菜孢子葉的酶解產(chǎn)物的多肽得率和水解度是上升的，當(dāng)胃蛋白量為6%時，胰蛋白量為5%時，兩者均達(dá)到最大值，多肽得率達(dá)到22.43%，水解度達(dá)到40.08%。這是因為隨著酶用量的增加使得酶與裙帶菜孢子葉中蛋白質(zhì)結(jié)合的幾率增大，酶能更充分地與底物進(jìn)行反應(yīng)，從而使多肽得率和水解度增加[34]；當(dāng)胃蛋白酶量超過6%，胰蛋白酶量超過5%后時，多肽得率和水解度有降低的趨勢。這是因為在酶解后期，裙帶菜中的蛋白被完全水解成多肽后，多肽也會作為蛋白酶的底物被進(jìn)一步水解成分子量更低的肽分子，以至于最后水解形成氨基酸，導(dǎo)致多肽得率降低；同時，隨著加酶量的增大，單位酶作用的蛋白質(zhì)會變少，若酶的量較多時，反應(yīng)會受到抑制，導(dǎo)致水解度變小[34]。因此，胃蛋白酶量和胰蛋白酶量的最優(yōu)選擇分別為6%和5%。

圖4 胃蛋白酶量對多肽得率和水解度的影響Fig.4 Effect of pepsin amount on polypeptide yield and degree of hydrolysis

圖5 胰蛋白酶量對多肽得率和水解度的影響Fig.5 Effect of trypsin content on polypeptide yield and degree of hydrolysis

2.1.5 酶解時間的選擇 由圖6 和圖7 可知，隨著胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解時間的增大，在一定范圍內(nèi)，裙帶菜孢子葉的酶解產(chǎn)物的多肽得率和水解度是上升的，當(dāng)胃蛋白酶酶解時間為2.5 h，胰蛋白酶酶解時間為3 h 時，兩者均達(dá)到最大值，多肽得率達(dá)到25.61%，水解度達(dá)到41.92%。這是因為隨著酶解時間的增長，底物能更充分地與酶反應(yīng)，從而多肽得率和水解度也在不斷增加。之后，多肽得率和水解度呈下降趨勢，這是因為：隨著酶解時間的延長，多肽被過度水解為分子量更低的小肽和氨基酸等，導(dǎo)致多肽得率下降；酶的活力可能會降低甚至喪失，而且底物會被酶結(jié)合進(jìn)行反應(yīng)，漸漸地被轉(zhuǎn)化，甚至過度水解[35]，導(dǎo)致水解度開始降低。因此，胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解時間的最優(yōu)選擇分別為2.5 和3 h。

圖6 胃蛋白酶酶解時間對多肽得率和水解度的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time of pepsin on polypeptide yield and degree of hydrolysis

圖7 胰蛋白酶酶解時間對多肽得率和水解度的影響Fig.7 Effect of trypsin enzymatic hydrolysis time on polypeptide yield and degree of hydrolysis

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，超聲時間、超聲功率、胰蛋白酶量和胃蛋白酶酶解時間對裙帶菜孢子葉多肽得率和水解度的影響不如其他3 個因素，因此，以料液比（A）、胃蛋白酶量（B）、胰蛋白酶酶解時間（C）為變量，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗[36]。

通過Design-Expert 10 軟件進(jìn)行仿生酶水解裙帶菜蛋白的工藝條件優(yōu)化的設(shè)計試驗，共有17 組試驗，其中，有5 組為中心點重復(fù)試驗（表2）。并且利用Design-Expert 10 軟件對多肽得率、水解度與各因素進(jìn)行多元回歸擬合，得二次多項式擬合方程為：

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental

Y1=20.95+1.16A+0.42B+0.18C?0.15AB?0.32AC+0.068BC?1.63A2?0.57B2?0.50C2。

Y2=43.19?0.22A?0.0672B+0.094C+0.29AB+0.050AC?0.14BC?1.38A2?1.65B2?1.94C2。

Y1方程回歸模型的決定系數(shù)R2是0.9907，P＜0.0001，這說明模型達(dá)到極顯著的水平。Y1方程回歸模型的失擬項P是0.7264，影響不顯著（P＞0.05），這說明該方程擬合度良好。Y2方程回歸模型的決定系數(shù)R2是0.9751，P＜0.0001，這說明模型達(dá)到極顯著的水平。Y2方程回歸模型的失擬項P是0.9542，影響不顯著（P＞0.05），這說明該方程擬合度良好。因此，可以用Y1、Y2回歸方程表示各響應(yīng)變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系，以評價各響應(yīng)因素對響應(yīng)值影響的顯著性。

通過表3 和圖8 可以得出，響應(yīng)值是裙帶菜孢子葉酶解產(chǎn)物多肽得率的模型，比較A、B、C 三個因素的F值大小以及A、B、C 與多肽得率曲線的陡峭程度可得，各響應(yīng)因素影響程度依次為：A＞B＞C，即料液比對于裙帶菜的酶解產(chǎn)物的多肽得率的影響最大。

圖8 各因素交互作用對多肽得率的影響Fig.8 Influence of interaction of various factors on polypeptide yield

表3 多肽得率二次回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of quadratic regression equation for peptide yield

通過表4 和圖9 可以得出，響應(yīng)值是裙帶菜包子葉酶解產(chǎn)物水解度的模型，比較A、B、C 三個因素的F值大小以及A、B、C 與水解度曲線的陡峭程度可得，各響應(yīng)因素的影響程度依次為：A＞C＞B，即料液比對于裙帶菜的酶解產(chǎn)物的水解度的影響最大。

圖9 各因素交互作用對水解度的影響Fig.9 Influence of interaction of various factors on degree of hydrolysis

表4 水解度二次回歸方程方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of quadratic regression equation for degree of hydrolysis

通過Design-Expert 10 軟件得到了最佳工藝條件優(yōu)化的組合為料液比103.62 g/mL、胃蛋白酶加酶量6.08%、胰蛋白酶酶解時間3.02 h。其他條件是按照單因素實驗得到的最優(yōu)結(jié)果：超聲功率720 W、超聲破壁時間40 min、胰蛋白酶用量5%、胃蛋白酶酶解時間2.5 h。為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性以及實驗的可操作性，選取料液比104 g/mL、胃蛋白酶加酶量6.1%、胰蛋白酶酶解時間3 h，做3 組平行實驗進(jìn)行驗證，得到的多肽得率為21.17%，水解度為43.07%。此結(jié)果與通過Design-Expert 10 軟件預(yù)測得到的多肽得率21.12%，水解度43.12%相比，誤差均在1%以內(nèi)。根據(jù)上述分析，采用響應(yīng)面的方法對裙帶菜孢子葉仿生酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是可行的。

2.3 裙帶菜孢子葉多肽的抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH 自由基一般在室溫下穩(wěn)定存在，常用于評價體外清除自由基的抗氧化活性[37]。由圖10 可以看出，與VC相比，裙帶菜孢子葉多肽在0.25～10 mg/mL，清除率與孢子葉多肽濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著濃度的增大，DPPH 自由基清除率迅速升高，10～25 mg/mL 時，清除率增加趨緩，并在樣品質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時達(dá)到70.50%。曹鎮(zhèn)海等[38]在對暗紋東方鲀魚皮膠原蛋白肽的實驗中發(fā)現(xiàn)，在模擬腸胃道消化之前，膠原蛋白肽的DPPH 清除能力僅7.89%，經(jīng)胃蛋白酶酶解后，DPPH 清除率可達(dá)28.77%，經(jīng)胰蛋白酶酶解后抗氧化活性稍有降低。徐杰等[39]認(rèn)為某種物質(zhì)DPPH自由基清除率的IC50值＜10 mg/mL 時，即可認(rèn)為有較好的抗氧化性。因此，可以認(rèn)為，本實驗經(jīng)仿生酶解獲得的裙帶菜孢子葉多肽具有較好的DPPH 自由基清除能力，其IC50值為5.71 mg/mL。

圖10 裙帶菜孢子葉多肽對DPPH 自由基清除能力的影響Fig.10 Effects of Undaria pinnatifida sporophyll polypeptide on DPPH free radical scavenging ability

2.3.2 ABTS 自由基的清除能力 ABTS 自由基既能溶于水相也能溶于有機(jī)相，也常用于評估抗氧化能力。由圖11 可以看出，與VC相比，裙帶菜孢子葉多肽在0～1.25 mg/mL，清除率與孢子葉多肽濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著濃度的增大，ABTS 自由基清除率迅速升高，1.25～2.5 mg/mL 時，清除率增加趨緩，并在樣品質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時達(dá)到88.66%。馮曉文等[40]認(rèn)為，經(jīng)仿生酶解后，可能是由于經(jīng)模擬腸胃道消化后，分解成了更多具有ABTS 自由基清除活性的小肽，乳清肽的ABTS 自由基清除能力有一定的提高。毛小雨[41]研究表明，與蕓豆蛋白相比，經(jīng)胃部模擬消化后多肽的ABTS 自由基清除率增加了43.72%，經(jīng)腸道消化后的ABTS 自由基清除率增加了121.07%。因此可以得到，經(jīng)過仿生酶解后得到多肽的抗氧化活性進(jìn)一步提升。本實驗所研究的裙帶菜孢子葉多肽具有較強(qiáng)的ABTS 自由基清除能力，但比相同濃度下，陽性對照組VC的清除率低，其IC50值為0.82 mg/mL。

圖11 裙帶菜孢子葉多肽對ABTS 自由基清除能力的影響Fig.11 Effects of Undaria pinnatifida sporophyll polypeptide on ABTS free radical scavenging ability

2.3.3 OH 自由基的清除能力 OH 基自由基是一種非?；顫姷淖杂苫?，可使機(jī)體內(nèi)的有機(jī)大分子發(fā)生氧化，對身體造成損傷[42?43]。由圖12 可以看出，與VC相比，裙帶菜孢子葉多肽在0.125～1.5 mg/mL，清除率與孢子葉多肽濃度呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著濃度的增大，OH 自由基清除率迅速升高，1.5～5 mg/mL時，清除率增加趨緩，并在樣品質(zhì)量濃度為5 mg/mL時達(dá)到96.01%，這與葉昱輝[44]對牡蠣多肽的羥自由基清除力的研究結(jié)果類似。畢秋蕓[37]通過堿性蛋白酶酶解裙帶菜蛋白，再經(jīng)超濾分級得到不同分子量的多肽，研究發(fā)現(xiàn)，低分子量多肽的抗氧化活性高于高分子量的多肽，但其OH 自由基清除能力較低，最高僅21.85%。而本實驗說明通過仿生酶解制備的孢子葉多肽具有較好的OH 自由基清除能力，其IC50值為1.35 mg/mL。

圖12 裙帶菜孢子葉多肽對OH 自由基清除能力的影響Fig.12 Effects of Undaria pinnatifida sporophyll polypeptide on OH free radical scavenging ability

3 結(jié)論

本實驗以裙帶菜孢子葉為原料，利用仿生酶解工藝，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析，獲得優(yōu)化裙帶菜孢子葉的最佳酶解工藝條件：超聲功率720 W，超聲破壁時間40 min、料液比1:104 g/mL、胃蛋白酶加酶量為6.1%、酶解時間2.5 h、胰蛋白酶加酶量為5%、酶解時間3 h。在此條件下進(jìn)行酶解，多肽得率為21.17%，水解度為43.07%。運用仿生酶解工藝，在最優(yōu)條件下制備的孢子葉酶解肽，對DPPH、ABTS、OH 自由基清除率分別達(dá)到70.50%、88.66%、96.01%。通過抗氧化研究，在一定范圍內(nèi)，孢子葉多肽對自由基清除能力呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，其DPPH、ABTS、OH 自由基的IC50值分別為5.71、0.82、1.35 mg/mL，此結(jié)果可為今后裙帶菜孢子葉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。