徐曉裕，李 甜，史學(xué)偉，王 斌

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

霉菌侵染是引起葡萄采后霉變腐爛的主要原因[1?2]。作為世界范圍內(nèi)的果蔬生產(chǎn)大國，我國每年有近8500 萬噸果蔬因保鮮技術(shù)和設(shè)備的落后而腐爛變質(zhì)，腐爛率高達20%～30%，給我國果蔬產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[3?4]。因此，在果蔬儲存運輸過程中采取一些有效的防治手段來延緩腐敗變質(zhì)就顯得尤為重要。葡萄在運輸、貯藏等過程中的擠壓及機械傷口就極易引起黑曲霉（Aspergillus niger）的感染，即黑粉病，導(dǎo)致葡萄果實失去食用和商品價值[5?6]。長期以來，使用化學(xué)殺菌劑來防止果蔬的腐敗變質(zhì)一直被認(rèn)為是最有效的方法，但是該方法存在著農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和病原菌抗藥性等諸多弊端，迫切需要新的安全方法來取而代之。因此，生物防治應(yīng)運而生。生物防治是指選擇對產(chǎn)品及人體不造成危害的微生物，利用微生物之間的拮抗作用來抑制病原菌生長的一種有效防治采后病害的新途徑。

在微生物生命活動過程中，通過產(chǎn)生某種拮抗物質(zhì)或改變自身的生長環(huán)境，達到阻礙其他微生物增殖的目的，人們將這類微生物統(tǒng)稱為拮抗微生物[7?8]。目前，有研究發(fā)現(xiàn)勞倫隱球菌（Cryptococcus laurenii）對蘋果采后灰霉病、梨的灰霉病和青霉病具有顯著的防治效果[9?10]。高抗甜瓜品種內(nèi)分離的枯草芽胞桿（Bacillus subtilis）Mg15 對甜瓜白粉病具有顯著防治效果[11]。葡萄園篩選的枯草芽孢桿菌對釀酒葡萄灰霉病具有良好抑制作用[12]。尋找到有效的拮抗菌株是防治果蔬采后病害的一種高效、環(huán)保、經(jīng)濟的方法，用生物防治技術(shù)取代傳統(tǒng)的化學(xué)藥物防治也是目前果蔬病害防治的研究熱點[6,13?14]。雖然有研究表明黑粉病是葡萄貯藏過程中產(chǎn)生的主要病害[15]，但目前關(guān)于生物防治黑粉病的報道還很少。本文旨在通過從新疆葡萄土壤中分離篩選獲得對黑曲霉具有抑制作用的拮抗細(xì)菌，明確拮抗菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件，以期為由黑曲霉引起采后病害的生物防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger）從瑪納斯中信國安葡萄園中的葡萄表皮分離，現(xiàn)保存于石河子大學(xué)食品學(xué)院葡萄與葡萄酒工程中心實驗室；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基 北京陸橋生物技術(shù)有限公司；酵母膏胨葡萄糖（YPD）、瓊脂培養(yǎng)基（葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20g/L）、LB 培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L）北京奧博星責(zé)任有限公司。

MLS-3750 型高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；FX-2000FO 電子天平 濟南歐萊博科學(xué)儀器有限公司；FE20 基礎(chǔ)型 pH 計 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ 超凈工作臺 美國伯騰儀器有限公司；CX41RF 光學(xué)顯微鏡 深圳市華顯光學(xué)儀器有限公司；DNP-9272 型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 用五點取樣法在瑪納斯中信國安的葡萄園中采取土壤樣品，裝入50 mL 無菌離心管中，儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 拮抗菌的分離及篩選 采用平板稀釋涂布法在LB 固體培養(yǎng)基上對土壤樣品中的細(xì)菌進行分離，30 ℃培養(yǎng)2 d，并挑取不同形態(tài)的單菌落采用平板劃線法純化并編號保存?zhèn)溆谩?/p>

以黑曲霉為指示菌，采用平板對峙法篩選拮抗細(xì)菌。抑菌直徑（mm）=測量菌落直徑（mm）-菌餅直徑（mm），每個處理做三個平行[16]。

1.2.3 拮抗菌活體抑菌實驗 選取新鮮無病害九成熟的鮮食葡萄，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇噴灑表面，并用無菌水清洗3 次后取出、晾干后用作反接實驗。用滅菌牙簽挑取純化好的黑曲霉菌絲在葡萄果實腰部穿刺，并同時接入濃度為107CFU/mL 濃度的拮抗菌懸液，僅接入黑曲霉菌絲的葡萄果實作為對照，常溫保存5 d，觀察防治效果[17]。

1.2.4 拮抗菌的鑒定 形態(tài)學(xué)和生理生化實驗：將拮抗菌株接種于LB 固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2 d 后觀察菌落的大小、顏色和質(zhì)地，表面及邊緣的形狀等菌落特征；再采用革蘭氏染色法對其進行染色，在光學(xué)顯微鏡下進一步觀察其染色情況和形態(tài)。依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中芽孢桿菌屬內(nèi)特征進行生理生化鑒定[18?19]。

分子生物學(xué)：使用OMEGA 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對菌株的DNA 進行提取，利用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGA TCA TGGCTCAG-3′）和1492F（5′-AAGGAGGTGA TCCAACCGCA-3′）進行PCR 擴增。將所有提取的DNA 樣品發(fā)送到Sangon Biotech 公司（中國上海）進行PCR 的擴增和產(chǎn)物測序。然后將測序所得的16S rDNA 測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 序列比對分析以明確該菌株的種屬關(guān)系，并使用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[20]。

1.2.5 菌株生長曲線的測定 用接種環(huán)刮取活化好的單菌落接種于裝有60 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為30 ℃，160 r/min 的搖床培養(yǎng)，每隔2 h 取樣并在OD600nm下測定吸光度值。

1.2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.6.1 裝液量對拮抗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響將拮抗菌的種子液以3%的接種量接種于含有40、60、80、100、120 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，pH 為7，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160 r/min，置于30 ℃的條件下進行恒溫振蕩培養(yǎng)30 h 后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性（方法同1.2.2），每個處理做三個平行。

1.2.6.2 接種量對拮抗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響將拮抗菌的種子液分別以1%、2%、3%、4%、5%的接種量接種于含有60 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，pH 為7，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160 r/min，置于30 ℃的條件下進行恒溫振蕩培養(yǎng)30 h 后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性，每個處理做三個平行。

1.2.6.3 培養(yǎng)溫度對拮抗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 將拮抗菌的種子液以3%的接種量接種于含有60 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，pH 為7，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160 r/min，分別置于20、25、30、35、40 ℃的條件下進行恒溫振蕩培養(yǎng)30 h 后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性，每個處理做三個平行。

1.2.6.4 培養(yǎng)時間對拮抗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響 將拮抗菌的種子液以3%的接種量接種于含有60 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，pH 為7，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160 r/min，置于30 ℃的條件下進行恒溫振蕩，分別培養(yǎng)20、25、30、35、40、45、50 h后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性，每個處理做三個平行。

1.2.6.5 初始pH 對拮抗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響將拮抗菌的種子液以3%的接種量接種于含有60 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，pH 分別設(shè)定為5、6、7、8、9，轉(zhuǎn)速設(shè)置為160 r/min，置于30 ℃的條件下進行恒溫振蕩培養(yǎng)30 h 后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性，每個處理做三個平行。

1.2.6.6 轉(zhuǎn)速對拮抗菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響將拮抗菌的種子液以3%的接種量接種于含有60 mL LB 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，pH 為7，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100、120、140、160、180、200、220 r/min，置于30 ℃的條件下進行恒溫振蕩培養(yǎng)30 h 后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性，每個處理做三個平行。

1.2.7 正交試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取三個對抑菌效果影響顯著的因素設(shè)計L9（34）正交試驗（表1），確定最佳的培養(yǎng)條件。

表1 L9（34）正交試驗因素及水平Table 1 L9 (33) orthogonal experiment factors and levels

1.2.8 驗證實驗 采用確定的最佳培養(yǎng)條件對菌株的抑菌直徑進行測量，驗證其抑菌效果。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 軟件進行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗（P＜0.05），采用Minitab 14.0 進行單因素和正交試驗方差分析，利用origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的分離

從采集到的土壤上共分離獲得60 株細(xì)菌，14 株細(xì)菌對黑曲霉具有拮抗作用（表2），其中，G8 的抑菌直徑最大，達28.19 mm（圖1）。

圖1 G8 對黑曲霉的拮抗效果Fig.1 The antagonistic effect of G8 on Aspergillus niger

表2 葡萄園土壤拮抗細(xì)菌的篩選Table 2 Screening of antagonistic bacteria in vineyard soil

拮抗菌株對黑曲霉的防治效果如圖2 所示。未接入拮抗菌株的葡萄果實發(fā)生腐爛及褐變，接入拮抗菌株的G8 對于黑曲霉有明顯的抑菌效果。接種該菌株的葡萄果實均沒有發(fā)生明顯的黑粉病癥狀。這可能是由于接種的拮抗細(xì)菌迅速繁殖，同時與黑曲霉競爭營養(yǎng)與生存空間，導(dǎo)致病原菌失去營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，無法生長繁殖以及產(chǎn)生有毒物質(zhì)，從而抑制了病害的發(fā)生[21]。

圖2 拮抗菌G8 對黑曲霉的活體拮抗效果Fig.2 The antagonistic effect of antagonistic antibacterial G8 on Aspergillus niger in vivo

2.2 拮抗細(xì)菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 菌株G8 在LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈現(xiàn)乳白色，表面稍微隆起，較為粗糙，不透明；經(jīng)革蘭氏染色后呈紫色，桿狀（圖3）。

圖3 菌株G8 形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain G8

2.2.2 生理生化特征測定 菌株G8 的生理生化特征顯示，該菌株可以利用葡萄糖、木聚糖、山梨醇、果糖、麥芽糖、淀粉、甘露醇等碳源進行生長，并能水解淀粉和明膠，還原硝酸鹽。接觸酶實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗、甲基紅實驗和脲酶實驗均呈陽性，能夠利用丙二酸鹽（表3）。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征[22]，菌株G8 符合暹羅芽孢桿菌的特性。

表3 菌株G8 的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain G8

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 將G8 菌株16S rDNA 擴增產(chǎn)物送至生工（上海）有限公司測序，將測序獲得的序列與Genbank 中序列進行比對，并用Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。基于16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示（如圖4），菌株G8 與暹羅芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近，處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分枝。結(jié)合形態(tài)學(xué)與生理生化特征，確定菌株G8 為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。

圖4 G8 菌株基于16S rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of G8 strain based on 16S rDNA

2.3 拮抗菌G8 生長曲線的測定

菌株G8 的生長曲線如圖5 所示。菌株G8 延緩期為4 h，在4～22 h 處于對數(shù)生長期，菌體代謝旺盛，繁殖速度快，24 h 后菌株的生物量逐漸趨于穩(wěn)定。但隨著培養(yǎng)時間的延長，菌株在40 h 之后進入衰亡期。

圖5 菌株G8 的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain G8

2.4 菌株G8 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 裝液量的影響 由圖6 可知，不同裝液量對抑菌效果的影響很小。當(dāng)裝液量為60 mL/250 mL 時菌株G8 有較大的抑菌直徑，為28.26 mm。方差結(jié)果顯示，不同裝液量對抑菌效果的影響并不顯著（P＞0.05），故不選擇裝液量作為后續(xù)影響抑菌效果的考察因素。

圖6 不同裝液量對抑菌效果的影響Fig.6 The influence of different liquid volume on theantibacterial effect

2.4.2 接種量的影響 由圖7 可知，不同的接種量對菌株的抑菌效果的影響很小。當(dāng)接種量為3%時，抑菌直徑較高，但方差結(jié)果顯示不同接種量對抑菌效果的影響不顯著（P＞0.05），這可能是由于抗菌物質(zhì)是菌體生長到一定階段，為適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生的，它的合成是受菌體細(xì)胞群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的[23]。雖然試驗最開始采用了不同的接種量，但是在發(fā)酵24 h 后，各處理菌體生物量基本一致，抗菌肽的活性差異不大，抑菌效果也基本一致。鑒于此，在后續(xù)的實驗中固定接種量為3%。

圖7 不同接種量對抑菌效果的影響Fig.7 The effect of different inoculum on the antibacterial effect

2.4.3 培養(yǎng)溫度的影響 由圖8 可知，不同溫度對菌株的抑菌效果差異顯著（P＜0.05）。隨著溫度的上升，抑菌直徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。培養(yǎng)溫度對菌體細(xì)胞中的酶、蛋白質(zhì)、DNA 等大分子的合成與活性會產(chǎn)生一定的影響，培養(yǎng)溫度較最適溫度高或低，生長速率都會隨之下降[24]。當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時，菌株G8 有最大的抑菌直徑（28.62 mm）。因此，確定菌株最適生長溫度為30 ℃，并選擇其作為下一步正交試驗的中心試驗點。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對抑菌效果的影響Fig.8 The influence of different culture temperatures on the antibacterial effect

2.4.4 培養(yǎng)時間的影響 由圖9 可知，菌株在20 h已經(jīng)開始產(chǎn)生了抑菌物質(zhì)，并隨著發(fā)酵時間的延長，抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量逐漸增大。當(dāng)培養(yǎng)時間達到30 h 時，菌株G8 的抑菌直徑最大（28.64 mm）。但當(dāng)菌株生長到一定時間時，抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量逐漸降低。這可能是由于菌株在生長后期，會發(fā)生自溶現(xiàn)象，并釋放如蛋白酶、脂肪酶等次級代謝產(chǎn)物降解了部分抗菌活性物質(zhì)[25?26]。方差分析結(jié)果顯示不同培養(yǎng)時間對菌株的抑菌效果有顯著影響（P＜0.05）。因此，確定菌株適宜培養(yǎng)時間為30 h，并選擇其作為下一步正交試驗的中心試驗點。

圖9 不同培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響Fig.9 The influence of different culture time on the antibacterial effect

2.4.5 初始pH 的影響 由圖10 可知，不同初始pH對菌株的抑菌效果影響較為顯著（P＜0.05）。當(dāng)發(fā)酵pH 在5～7 時，菌株G8 的抑菌效果逐漸增加。當(dāng)pH為7 時，菌株G8 表現(xiàn)出最大的抑菌直徑（28.34 mm）。當(dāng)后續(xù)pH 持續(xù)增加時，抑菌效果呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，這可能由于不同的酸或堿性條件影響了菌體的生長以及次級代謝產(chǎn)物的分泌[27]。因此，確定菌株G8產(chǎn)生最好抑菌效果的初始pH 為7，并選擇其作為下一步正交試驗的中心試驗點。

圖10 不同初始pH 對抑菌效果的影響Fig.10 The effect of different initial pH on the antibacterial effect

2.4.6 轉(zhuǎn)速的影響 由圖11 可知，轉(zhuǎn)速為140、160、180 r/min 時對菌株G8 抑菌效果的影響并不顯著（P＞0.05）。轉(zhuǎn)速不斷升高時，菌株的抑菌效果逐漸增強。當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min 時，菌株的抑菌直徑達到了最大值。然而，隨著轉(zhuǎn)速的不斷升高，菌株的抑菌效果不斷下降。因此，確定菌株的產(chǎn)生最優(yōu)抑菌效果的轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖11 不同轉(zhuǎn)速對抑菌效果的影響Fig.11 The influence of different speeds on the antibacterial effect

2.5 正交試驗優(yōu)化

菌株G8 在發(fā)酵條件正交試驗設(shè)計各處理中產(chǎn)生的抑菌效果如表4 所示。R 絕對值大小代表不同因素對菌體產(chǎn)生抑菌效果的影響程度，R 值越大，說明該因素影響程度越大。因此可以從實驗結(jié)果中可以看出這三個因素對抑菌效果的影響大小順序為培養(yǎng)時間＞ pH＞培養(yǎng)溫度。經(jīng)數(shù)據(jù)分析可得到最優(yōu)的發(fā)酵條件培養(yǎng)參數(shù)為B3C2A3，即培養(yǎng)時間為33 h，pH 為7，培養(yǎng)溫度為33 ℃。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment results

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化后的抑菌效果測定

使用優(yōu)化后的發(fā)酵條件對菌株G8 進行培養(yǎng)，即裝液量為60 mL/250 mL，接種量為3%，培養(yǎng)溫度為33 ℃，pH 為7，轉(zhuǎn)速為160 r/min 的條件下培養(yǎng)33 h，得到的發(fā)酵液對黑曲霉的抑菌直徑達到了28.79 mm。

3 結(jié)論

本研究從新疆葡萄園土壤中共篩選出14 株對黑曲霉有抑菌效果的拮抗細(xì)菌，其中菌株G8 對黑曲霉的抑菌效果最佳。經(jīng)鑒定，菌株G8 為暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）。在常溫下，暹羅芽孢桿菌能顯著降低黑曲霉引起的病害問題，有效抑制葡萄果實霉變。其產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)最適的生長條件為：裝液量為60 mL/250 mL、培養(yǎng)溫度為33 ℃、培養(yǎng)時間為33 h、接種量3%、pH7、轉(zhuǎn)速為160 r/min。上述研究結(jié)果將為暹羅芽孢桿菌在黑曲霉采后病害的生物防治應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。本實驗室將進一步對暹羅芽孢桿菌G8 所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的純化、鑒定與抑菌機制等進行深入研究。