李婭茹，欒宏偉，李文嬌，盧 瑛,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室，上海 201306）

甲殼類和貝類產(chǎn)品因其獨特的口感和特殊的營養(yǎng)成分，已成為人們餐桌上的常見菜肴。然而，近年來因攝入這類食品而引起過敏的報道頻繁出現(xiàn)[1]。大約85%的海鮮過敏反應(yīng)是由甲殼類或貝類引起的[2]。多達90%的海鮮過敏患者將終生受過敏問題困擾，并可能由于皮膚接觸或吸入烹飪或加工過程中產(chǎn)生的氣溶蛋白而發(fā)生[3]。原肌球蛋白（TM）是一種肌動蛋白相關(guān)蛋白，是肌肉和非肌肉細胞的動力學(xué)的關(guān)鍵調(diào)控因子[4]，也是不同的甲殼動物和軟體動物的一種常見和主要的過敏原[5]。其分子量在35～38 kDa左右，具有異常穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)，即使在長期加熱后，它仍能保持免疫球蛋白E（Ig E）的結(jié)合能力[6?7]。

日常生活中，水煮是水產(chǎn)品最常見的烹飪手段之一，人們認為該烹飪方法方便簡單，在殺滅某些水產(chǎn)品所攜帶細菌的同時，更好地保持水產(chǎn)品的特有風味。產(chǎn)生食物過敏的先決條件之一是過敏原必須對胃腸道酶的消化具有抵抗力[8]。因此，過敏原被胃腸道（Gastrointestinal，GI）消化后，其在消化過程中的穩(wěn)定性被認為是決定食物蛋白過敏性的重要因素[9?10]。研究人員發(fā)現(xiàn)，蛋白酶處理是減少TM 的Ig E 結(jié)合的有效方法[11?13]。胃蛋白酶具有廣泛的特異性，可以優(yōu)先裂解疏水和芳香族氨基酸殘基（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）之間的肽鍵[14]。腸道中的胰蛋白酶可裂解堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的羧基側(cè)的肽鍵[15?16]，胰凝乳蛋白酶將氨基酸的羰基裂解成芳香族肽鍵，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸[17]。根據(jù)糧農(nóng)組織/世衛(wèi)組織的報告，蛋白酶消化產(chǎn)生的片段和不能被酶消化的蛋白質(zhì)，當其分子量大于 3.5 kDa 時，也可能在人體中引起過敏反應(yīng)。

盡管已經(jīng)有很多研究報道了甲殼類動物過敏原的模擬胃消化特性[18?19]，并報道其是IgE 介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的最常見原因之一[20]，但未見關(guān)于甲殼類動物和貝類的水煮肌肉的過敏原特征和不同來源的過敏原的胃腸消化性能的比較研究。因此，本研究選擇不同甲殼類（Litopenaeus vannamei、Penaeus monodon、Eriocheir sinensis）和貝類（Ruditapes philippinarum、Sinonovacula constricta）的水煮肌肉作為體外模擬胃腸道消化的對象，通過調(diào)查和比較不同種類水產(chǎn)品過敏原TM 在體外模擬消化過程中的免疫學(xué)活性變化，探究過敏原TM 的抗消化性能，為今后開發(fā)低過敏性水產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲殼類、貝類水產(chǎn)品：南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、花蛤（Ruditapes philippinarum）和縊蟶（Sinonovacula constricta） 購買于浦東新區(qū)菜市場，直接用于實驗或者置于-20 ℃冰箱冷凍保存；甲殼類和貝類主要過敏原原肌球蛋白的單克隆抗體（MAb）2A7H6、CE7B2 前期研究中制備的單抗；BSA 標準品 購自美國Pierce 公司；HRP-兔抗鼠IgG 抗體 購自美國Invitrogen 公司；DAB 顯色液、TEMED（0761）、胰蛋白酶（T1426-50MG）、脂肪酶（L3126-100G）、胃蛋白酶（P7000-100G） 購自Sigma 公司；非預(yù)染Marker、預(yù)染Marker 購自Fermentas 公司；轉(zhuǎn)膜專用吸水紙 購自Whatman公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒、0.22 μm 濾膜 購自生物工程（上海）有限公司；0.22 μm PVDF 膜 購自美國Millipore 公司；其余試劑 均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

Biotek Synergy 2 多功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；BIO-RAD 蛋白質(zhì)電泳儀（mini protean 4） 美國Bio-Rad 公司；AE-8135 半干式轉(zhuǎn)膜儀日本ATTO 公司；powerlook 2100XL-USB 凝膠掃描儀 UMAX 公司；X-Cite 熒光顯微鏡 Excelitas公司；Z36HK 高速冷凍離心機 德國Hermle 公司；Elixtm 純水系統(tǒng) 美國Millipore 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 甲殼類、貝類蛋白抽提液的制備 參考黃天嬌等[21]的方法并稍作改進，取5 種水產(chǎn)品，洗凈后去殼，各稱取5 g 肌肉與25 mL 的20 mmol/L PBST 混合，勻漿，4 ℃、10000 r/min 離心10 min，取上清制備為水產(chǎn)品抽提液，備用；同等條件下浸提勻漿后的肌肉樣本沸水煮10 min，離心后取上清制備為水煮抽提液，備用。蛋白含量測定方法參考BCA 蛋白定量試劑盒說明書[22]。

1.2.2 免疫活性分析

1.2.2.1 電泳和免疫印跡 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）根據(jù)Laemmli 等[23]方法稍作修改，即配制分離膠（12%）和濃縮膠（5%），上樣量10 μL，電源電壓120 V，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍染色液染色，然后脫色至蛋白條帶清晰。

免疫印記（Western blot）根據(jù)Zhang 等[24]方法稍作修改。SDS-PAGE 膠在200 mA 下轉(zhuǎn)膜30 min，然后將PVDF 膜用含0.5%吐溫-20 的PBS（PBST）溶液洗滌3 次后加5%脫脂奶粉，37 ℃反應(yīng)1 h 后，PBST 洗滌3 次后加入2A7H6 單克隆抗體[25]，37 ℃、50 r/min 搖床振蕩反應(yīng)1 h 后洗滌。加入HRP-標記的兔抗鼠IgG 二抗（1:2500），37 ℃、50 r/min 搖床反應(yīng)1 h 后洗滌。用DAB 顯色液顯色，晾干后拍照保存。

1.2.2.2 間接ELISA 法 采用間接ELISA 法分析樣品的免疫活性。首先，將樣品用包被液進行稀釋后包被于96 孔酶標板，4 ℃靜置過夜。PBST 洗滌3 次后加入5% 脫脂奶粉，37 ℃反應(yīng)1 h。洗滌后加入單克隆抗體CE7B2，37 ℃ 孵育1 h，洗滌。再加入HRP-兔抗鼠IgG（1:2500），37 ℃孵育1 h。洗滌后，加入OPD 顯色液，室溫避光放置20 min。最后加入終止液。迅速用酶標儀檢測酶標板的OD490值[26?27]。

1.2.3 體外模擬胃、腸消化

1.2.3.1 模擬胃液消化 模擬胃液（simulated gastric fluid,SGF）配制主要參考美國藥典的配方[28]，按照2000 U/mL 的胃蛋白酶活性單位配制（pH 為1.30）。取5 種水產(chǎn)品，洗凈后沸水煮 10 min，置于冰上冷卻后去殼，取肌肉組織攪拌10 s，備用；取5 支玻璃試管，各加入2 g 水煮肌肉和預(yù)熱好的10 mL SGF，混勻后50 r/min 振蕩消化，分別在反應(yīng)0、1、2、5、10、30、60、120 min 時取樣1 mL，沸水浴10 min 滅活蛋白酶，冷卻，4 ℃離心的上清即為水煮肌肉的SGF消化產(chǎn)物[29?32]，消化產(chǎn)物作為ELISA 樣品進行免疫活性分析。

1.2.3.2 模擬腸液消化 模擬腸液（simulated intestinal fluid,SIF）配制主要參考美國藥典的配方[28]，按照1685 U/mL 的胰蛋白酶和2200 U/mL 的脂肪酶活性單位配制（pH 為8.1）。取5 種水產(chǎn)品，洗凈后沸水煮10 min，置于冰上冷卻后去殼，取肌肉組織攪拌10 s，備用；取5 支玻璃試管，各加入2 g 水煮肌肉和預(yù)熱好的10 mL SIF，混勻后振蕩消化，在反應(yīng)0、1、5、10、30、60、120、240 min 后取樣1 mL，沸水浴10 min 滅活蛋白酶，冷卻，4 ℃離心后上清即為水煮肌肉的SIF 消化產(chǎn)物[29?32]，消化產(chǎn)物作為ELISA樣品進行免疫活性分析。

1.2.4 不同水產(chǎn)品水煮肌肉的肌原纖維分析 肌肉樣本的提取主要參考周然等[33]的方法，并略有改進。取5 種甲殼類、貝類水產(chǎn)品，稱取5 g，加入30 mL制備液，勻漿30 s。1000 r/min，離心15 min，棄去上清，取沉淀。向沉淀中加入30 mL 制備液，用玻璃棒攪拌并振蕩均勻。再次離心15 min，棄去上清液，取沉淀。重復(fù)離心3 次，收集沉淀；將沉淀用30 mL 制備液溶解，獲得樣本懸濁液。參照周然等[33]的方法，取所得懸濁液，利用X-Cite 熒光顯微鏡放大10×10 倍觀察，并利用顯微鏡計算機軟件測量肌原纖維長度，計算平均值。每個平行樣提取200 根肌肉纖維。隨后，對肌肉纖維長度進行統(tǒng)計分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品進行3 次平行試驗，數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 進行ANOVA 分析，P＜0.05 表示差異顯著；由OriginPro 9.1 64Bit 進行圖形制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 煮沸處理對水產(chǎn)品主要過敏原原肌球蛋白的影響

對煮沸前后的肌肉抽提液進行電泳和免疫印跡試驗，分析其蛋白組成變化，結(jié)果如圖1 所示。電泳圖中可觀察到大量不同分子量的蛋白質(zhì)條帶（圖1a）；所有樣品在40 kDa 附近都有明顯的條帶，結(jié)合免疫印跡結(jié)果可知，該條帶對TM 的特異性單抗2A7H6有特異性反應(yīng)，表明該處為TM 條帶。甲殼類和貝類的條帶有明顯差異。而煮沸去除不耐熱蛋白后，25～35 kDa、45～116 kDa 分子量區(qū)間的蛋白條帶大部分消失；35～45 kDa 分子量區(qū)間條帶明顯，說明它們均具有耐熱性。兩種蝦類在14.4～25 kDa 區(qū)間明顯的條帶，其可能為肌球蛋白輕鏈，具有耐熱性?；ǜ蛟?0 kDa 附近的條帶較淺，表明其含量較低。而中華絨螯蟹在40 kDa 附近的條帶高于蝦和貝類，這與Liu 等[34?35]的研究一致。

圖1 煮沸處理對水產(chǎn)品主要過敏原原肌球蛋白的影響Fig.1 The effect of boiling treatment on the TM of aquatic products

五種水產(chǎn)品抽提液與CE7B2 抗體的ELISA 結(jié)果如圖2。CE7B2 抗體可與貝類和甲殼類動物過敏原TM 的IgE 位點進行特異性結(jié)合[24]。樣品經(jīng)加熱后，免疫活性均略有降低?；ǜ颉⒖O蟶過敏原TM 過敏原性分別降低6.0%和4.2%，而南美白對蝦、斑節(jié)對蝦、中華絨螯蟹分別為2.9%、2.1%和1.6%，說明貝類經(jīng)水煮后過敏原性的丟失高于甲殼類水產(chǎn)品。

圖2 五種水產(chǎn)品抽提液和CE7B2 抗體的ELISA 結(jié)果Fig.2 ELISA result for 5 shellfish extract proteins with McAb CE7B2

綜上，水煮可以使非耐熱蛋白消失；而經(jīng)ELISA驗證發(fā)現(xiàn)，水煮對水產(chǎn)品TM 過敏原性的破壞程度不大，損失均低于10%。且煮沸后的抽提液中雜蛋白含量明顯減少，更適合選取其作為胃腸消化的對照樣本。

2.2 水產(chǎn)品種類對TM 的消化性能影響作用

2.2.1 模擬胃液消化 5 種水產(chǎn)品的SGF 消化情況見圖3 和圖4。隨著消化時間的增加，TM 條帶逐漸消失，1 min 內(nèi)產(chǎn)生了大量的小分子（4.1～14.4 kDa）（圖3），表明TM 在胃蛋白酶的作用下，蛋白降解，生成了一些小分子肽等物質(zhì)。甲殼類樣品的TM 條帶（～36 kDa）在30 min 后明顯變淺，但在 120 min 時仍存在（圖3a～3c）；其中中華絨螯蟹的TM 條帶在30 min 時幾乎肉眼不可見，與其他兩種蝦類相比，其TM 蛋白的降解速度更快（圖3c）?；ǜ蚺c縊蟶兩種貝類肌肉中的TM 條帶在1 min 時明顯變淺（圖3d～3e），并產(chǎn)生了大量0～18.4 kDa 的低分子量條帶，這些條帶直到消化結(jié)束仍然存在，可能為具有免疫活性的肽段。

圖3 水煮肌肉的消化產(chǎn)物模擬胃液電泳圖Fig.3 SDS-PAGE results for boiled muscle after SGF digestion

利用TM 的特異性單抗2A7H6，通過間接ELISA分析5 種水產(chǎn)品的免疫學(xué)活性結(jié)果如圖4 所示。由圖可知，五種水煮樣品的免疫活性隨著SGF 消化時間的增加均有不同程度的降低。在10 min 時，斑節(jié)對蝦的免疫活性下降率低于其他4 種水產(chǎn)品；1 h 后五種水產(chǎn)品的免疫活性下降率呈現(xiàn)平衡趨勢，但是2 種貝類的免疫活性降低率＞80%，明顯高于甲殼類。定量結(jié)果顯示，甲殼類水煮肌肉中TM 的免疫活性下降率為64.7%～67.7%，而貝類TM 的免疫活性降低率高達86.5%～86.8%。這些結(jié)果與SDS-PAGE的結(jié)果一致，表明水產(chǎn)品的種類對TM 的胃消化率有較大影響。

圖4 水煮肌肉的模擬胃液消化產(chǎn)物免疫活性Fig.4 ELISA results for boiled muscle after SGF digestion

2.3 水產(chǎn)品水煮肌肉的模擬腸液消化

本研究進一步探討了不同水產(chǎn)品的模擬腸道消化情況（圖5 和圖6）。SDS-PAGE 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲殼類樣品蛋白在不到1 min 的時間內(nèi)被消化，南美白對蝦樣品出現(xiàn)許多小分子條帶（4.1～14.4 kDa）（圖5a），這些條帶在120 min 后仍然存在，而斑節(jié)對蝦和中華絨螯蟹產(chǎn)生的小分子蛋白較少（圖5b～5c）；兩種貝類的水煮肌肉樣品消化時間更短，且均產(chǎn)生了一些新的蛋白條帶（圖5d～5e）。

ELISA 結(jié)果（圖6）顯示，在模擬消化SIF 過程中，五種水產(chǎn)品的TM 免疫活性在1 h 內(nèi)明顯降低（＞50%）。SIF 消化4 h 后，甲殼類水煮肌肉TM 的免疫活性損失為89.0%～91.5%，而貝類TM 的活性損失可達90.8%～92.2%，兩者相差不大。比較水產(chǎn)品的SGF 和SIF 的消化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)所有樣品在SIF中的消化速度都比較快。由此推測，腸道是TM 活性喪失的主要場所。

2.4 不同水產(chǎn)品水煮肌肉的肌原纖維結(jié)構(gòu)分析

為了探究TM 的胃腸道抗消化能力是否與肌纖維結(jié)構(gòu)有關(guān)，本研究進一步對五種水產(chǎn)品的肌原纖維進行了對比分析（表1）。由表可知，五種水產(chǎn)品的肌原纖維粗細和長短均不相同，甲殼類的肌原纖維（156.4～185.8 μm）明顯長于貝類（125.0～134.6 μm）。肌原纖維長度高于500 μm 的比例均很低（＜5%）；但是甲殼類的肌纖維在100 μm 以上的比例高于貝類，貝類的肌纖維長度大部分在100 μm 以下。此外，蝦、蟹（甲殼類）的肌原纖維較粗，而花蛤、縊蟶（貝類）的肌原纖維較細，甲殼類肌纖維的寬度約為貝類肌纖維的3 倍。

表1 水產(chǎn)品肌原纖維在不同長度的分布情況Table 1 Distribution of myofibrils in different lengths of aquatic products

3 討論

煮熟的海產(chǎn)品經(jīng)過人口腔咀嚼和胃和腸的消化后，其營養(yǎng)成分才能被人體吸收。甲殼類和貝類產(chǎn)品的TM 具有熱穩(wěn)定性，它可以在胃腸消化過程中被降解為各種大小的肽。故食物過敏原只有具備足夠的胃腸道穩(wěn)定性，才能到達腸道粘膜，從進而發(fā)生吸收和致敏作用[36]。而未完全降解的過敏原表位肽或過敏原進入人體后會與血清中的IgE 結(jié)合，使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)[37]。因此，致敏蛋白在胃腸道中對水解酶消化的抵抗力受到廣泛關(guān)注。

模擬胃腸消化結(jié)果顯示，TM 的消化率和免疫活性的變化主要發(fā)生在腸消化階段。在單一的SGF和SIF 消化階段，SDS-PAGE 中的TM 條帶明顯減弱并消失（圖3 和圖5）。SGF 消化中，水煮肌的TM條帶逐漸變淺，且TM 略微向低分子量遷移，說明TM 在蛋白酶的作用下開始降解，這一結(jié)果同王學(xué)麗等[38]的研究結(jié)果一致。圖4 和圖6 說明TM 酶解產(chǎn)物對抗體有特異性反應(yīng)，特異性反應(yīng)條帶顯示降解片段仍有免疫活性，這說明其具有一定的耐消化性。TM 在消化道中的降解模式與Liu 等[35]和Wu[18]等的研究結(jié)果相似。然而，Liu 等[34]認為，蝦類肌纖維蛋白中的TM 比其他非過敏性蛋白消失得相對更慢。本研究結(jié)果可觀察到TM 的消化速率與非致敏蛋白相差不大。這可能與被測試樣品的性質(zhì)以及消化條件有關(guān)，如酶的比例、食物顆粒大小或食物種類的差異等[39?40]。

圖5 水煮肌肉的消化產(chǎn)物模擬腸液電泳圖Fig.5 SDS-PAGE results for boiled muscle after SIF digestion

圖6 水煮肌肉的模擬腸液消化消化產(chǎn)物免疫活性Fig.6 ELISA results for boiled muscle after SIF digestion

在SGF 和SIF 反應(yīng)中，樣品均在消化1 min 后產(chǎn)生了大量的小分子，這可能是由于完整的蛋白質(zhì)被消化成不同大小的肽段，空間結(jié)構(gòu)被破壞所致[41]。且貝類的消化速度比甲殼類快，這可能是因為甲殼類肌纖維的寬度明顯比貝類寬[42?43]。在SGF 反應(yīng)中，三個甲殼類樣品中，螃蟹的消化效果最明顯，其次是南美白對蝦；在SIF 反應(yīng)中，其他四個樣品的消化效果均優(yōu)于南美白對蝦。這表明，水產(chǎn)品的種類對免疫活性和過敏性有較為明顯的影響。人體攝入的蛋白質(zhì)通常是經(jīng)過加工的食物成分之一。加工過程可以使食物基質(zhì)中的蛋白質(zhì)變性并改變其空間結(jié)構(gòu)。消化酶的消化作用會進一步影響過敏原的空間結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，即便是經(jīng)過胃腸消化后，樣品仍具有一定的免疫活性。這可能是因為有少數(shù)線性表位可以在加工和消化后完全或部分保留致敏性[44]。

食品加工可以通過改變過敏原的結(jié)構(gòu)特性來影響過敏原的穩(wěn)定性和其他物理化學(xué)特性。周然等[33]研究發(fā)現(xiàn)，魚肉的肌纖維在儲存過程中變短，這說明肌纖維能在一定程度上反映水產(chǎn)品肌肉組織的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。陳錚等[45]研究了熱處理過程中牡蠣閉殼肌肌原纖維蛋白的濁度、溶解度、表面疏水性、α-螺旋含量和總巰基含量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，牡蠣閉殼肌肌原纖維蛋白的濁度整體呈增大趨勢，α-螺旋含量、總巰基含量逐漸降低，這表明肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)變化對理化性質(zhì)影響顯著。綜上所述，水產(chǎn)品的肌原纖維蛋白在不同的環(huán)境和加工條件下，因其結(jié)構(gòu)變化表現(xiàn)出不同的理化特性和食用品質(zhì)。本研究中，由于原肌球蛋白是肌原纖維結(jié)構(gòu)中的一部分，其在蛋白酶中的消化性與其暴露程度會受到肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)變化影響，因此，認為甲殼類和貝類肌肉組織結(jié)構(gòu)的差異可能是造成甲殼類和貝類消化率和免疫活性存在差異的原因之一。

4 結(jié)論

本文選取五種水產(chǎn)品作為研究對象，系統(tǒng)性地調(diào)查了TM 在體外胃腸消化中免疫活性和過敏原性的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，腸道是TM 免疫活性損失的主要場所；在模擬胃腸道消化中，甲殼類TM 的免疫活性消減率均低于貝類，說明水產(chǎn)品的種類會影響TM 的胃腸道消化能力，甲殼類和貝類肌肉組織結(jié)構(gòu)的差異可能是造成甲殼類和貝類消化率和免疫活性差異的原因之一。此外，經(jīng)過胃腸道模擬消化后，仍然存在一些低分子量的致敏片段，今后有必要深入研究殘留片段的抗原表位，以解析過敏原TM的抗消化機制。本研究可對今后過敏原的消減技術(shù)和低過敏性食品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。