劉曉藝，周玉巖，過利敏，郝光飛,

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056107；2.河北省食品藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究中心，河北石家莊 050299；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆烏魯木齊 830091）

紅花（Carthamus tinctoriusL.）為菊科紅花屬，為新疆地區(qū)代表作物之一。紅花籽為紅花的種子，氣香性溫，功能與花相同，都具有防治心腦血管疾病、降低血壓等藥用價(jià)值，富含油脂、蛋白質(zhì)、維生素與礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[1?3]。紅花籽油中亞油酸含量高達(dá)75%～85%，在低溫或受熱條件下油質(zhì)穩(wěn)定[4?5]。紅花籽榨油后籽粕中富含蛋白質(zhì)，同樣具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，其氨基酸種類齊全且比例適宜，疏水性及耐熱性氨基酸含量高達(dá)40%，可作為補(bǔ)充氨基酸和制備生物活性肽的優(yōu)質(zhì)蛋白原料[6]。目前，食源性優(yōu)質(zhì)蛋白已成為研究熱點(diǎn)，越來越多新型功能肽被開發(fā)利用，如沙棘籽蛋白、西瓜籽蛋白及菠蘿蜜籽蛋白等[7?9]。與其他植物蛋白相比，紅花籽蛋白不僅資源更加豐富，還具有一定的加工特性，乳化性及發(fā)泡性與大豆蛋白相似，但在酸性及中性環(huán)境中優(yōu)于大豆蛋白[6,10]。在蛋白酶解多肽生物活性方面，紅花籽蛋白經(jīng)單酶水解后得到具有抗氧化活性的多肽，證實(shí)了其制備抗氧化肽的可行性[11]。

多肽作為蛋白質(zhì)的降解衍生物，更容易被人體吸收利用，在較小濃度下具有較強(qiáng)的生物活性，其性質(zhì)與蛋白質(zhì)類似，容易受到環(huán)境因素影響，如在食品加工過程中（如高溫）或機(jī)體胃腸消化階段，多肽可能會(huì)因氧化、脫酰胺或環(huán)化等作用而發(fā)生降解，導(dǎo)致活性下降甚至消失，此外，常見的食品原輔料及金屬離子也可能會(huì)與多肽發(fā)生作用影響活性。因此，研究紅花籽抗氧化肽穩(wěn)定發(fā)揮活性作用的環(huán)境條件可保證其在加工過程中的穩(wěn)定性，為產(chǎn)品的開發(fā)及工業(yè)化應(yīng)用提供參考[12]。目前，大部分對(duì)紅花籽多肽的研究主要在制備工藝、分離純化及功能構(gòu)效等方面，對(duì)其生物活性的穩(wěn)定性方面研究較少[13]，近年來，已發(fā)現(xiàn)杏鮑菇多肽、菜籽肽在高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下會(huì)失活[14?15]，但關(guān)于紅花籽抗氧化肽在加工、貯藏應(yīng)用及胃腸消化等環(huán)境中活性穩(wěn)定性研究尚淺，因此，有必要對(duì)紅花籽抗氧化肽穩(wěn)定性研究，保證多肽產(chǎn)品能穩(wěn)定發(fā)揮抗氧化效果。

由于紅花籽與籽粕蛋白氨基酸含量及成分等相差甚微[6]，考慮紅花籽的綜合利用，減少營養(yǎng)物質(zhì)浪費(fèi)，本試驗(yàn)以脫殼紅花籽粕為原料，提取蛋白質(zhì)后通過復(fù)合酶解法制備紅花籽抗氧化肽并超濾分離，研究不同分子量多肽在食品加工、貯藏過程及模擬胃腸消化等環(huán)境因素中抗氧化活性的穩(wěn)定性，旨在篩選得到抗氧化活性及穩(wěn)定性較高的多肽組分，得出抗氧化活性穩(wěn)定的加工應(yīng)用條件，為紅花籽抗氧化肽的產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫殼紅花籽粕 新疆伊犁州察布查爾縣雅其娜農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；堿性蛋白酶（75000 U/g）、中性蛋白酶（64000 U/g）、胰蛋白酶（25000 U/g）、胃蛋白酶（3000 U/g） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；DPPH、鄰苯三酚、水楊酸 上海阿拉丁公司；NaCl、檸檬酸、蔗糖、葡萄糖、山梨酸鉀、苯甲酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1000A 高速萬能粉碎機(jī) 永康市太陽機(jī)電有限公司；PHJ-3F pH 計(jì) 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)有限公司；JA1003 電子天平 上海精科天平；581R 高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；UV1901 紫外可見分光光度計(jì) 杭州艾普儀器設(shè)備有限公司；DK-98-1 電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特；SCIENTZ-10ND 冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物公司；ZJMP10-002 超濾系統(tǒng)美國Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅花籽蛋白的提取 脫殼紅花籽粕粉碎機(jī)粉碎過80 目篩，1:5（W/V）正己烷脫脂，攪拌浸提6 h，反復(fù)三次，1:10（W/V）比例溶于去離子水，NaOH（1 mol/L）調(diào)pH 至10，攪拌1 h，4000 r/min 冷凍離心10 min，取殘?jiān)M(jìn)行二次浸提，HCl（1 mol/L）調(diào)上清液pH 至5.5，靜置30 min，4000 r/min 冷凍離心10 min，取沉淀，調(diào)pH 至中性，?80 ℃冷凍干燥后?20 ℃封裝儲(chǔ)藏備用[10]。

1.2.2 紅花籽蛋白復(fù)合酶水解 配制底物濃度為5%紅花籽蛋白溶液，采用堿性蛋白酶與中性蛋白酶2:1 復(fù)合酶解，酶解溫度50 ℃，酶解2 h，酶添加量7000 U/g，酶解過程用NaOH 維持pH 為8 不變。以反應(yīng)過程中NaOH 的消耗量計(jì)算水解度（DH），控制水解程度[16]，反應(yīng)完全后，100 ℃滅酶10 min，調(diào)溶液pH 至中性，3500 r/min 離心10 min，得到紅花籽蛋白酶解液，測(cè)定抗氧化活性，上清液冷凍干燥備用[17]。

1.2.3 紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物超濾分離 將紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物復(fù)溶于去離子水中，調(diào)pH 為7，0.45 μL微孔濾膜過濾，選擇3、5、10 kDa 超濾膜，調(diào)節(jié)超濾模板進(jìn)口壓力為0.2 Mpa，出口壓力不高于0.03 Mpa，常溫超濾，收集所得組分SSPH-Ⅰ（＜3 kDa）、SSPH-Ⅱ（3～5 kDa）、SSPH-Ⅲ（5～10 kDa）和SSPH-Ⅳ（＞10 kDa）多肽溶液，分別測(cè)定各組分體外抗氧化活性后冷凍干燥，?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 紅花籽蛋白多肽抗氧化穩(wěn)定性研究

1.2.4.1 溫度對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 配制濃度為2 mg/mL 不同分子量多肽液，分別在水浴條件60、70、80、90、100、121 ℃保溫處理2 h，取樣后冰水浴迅速冷卻至室溫進(jìn)行測(cè)定，以各組室溫條件抗氧化活性為處理前參照，計(jì)算清除能力維持率[14]。

1.2.4.2 pH 對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 將多肽樣品分別溶于pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11 的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L）中，配成質(zhì)量濃度為200 μg/mL 溶液，用HCl 和NaOH（1 mol/L）分別調(diào)節(jié)pH，在室溫下靜置2 h，以去離子水配制肽溶液為參照，計(jì)算清除能力維持率[14]。

1.2.4.3 食品原輔料對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性影響 配制濃度為2 mg/mL 不同分子量多肽液，分別添加NaCl、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、防腐劑山梨酸鉀及苯甲酸鈉。其中，NaCl、蔗糖和葡萄糖溶液的濃度為2、4、6、8、10 g/100 mL，檸檬酸和防腐劑的濃度為0.04、0.08、0.12、0.16、0.2 g/100 mL，添加蔗糖和葡萄糖組分在100 ℃下放置20 min，其他在室溫下靜置反應(yīng)2 h，以未添加以上食品原輔料肽樣品為參照，計(jì)算清除能力維持率[15,18]。

1.2.4.4 金屬離子對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 配制濃度為2 mg/mL 不同分子量的多肽液，分別加入含有K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+的金屬鹽，使溶液中的金屬離子質(zhì)量濃度為250 μg/mL，在室溫下靜置2 h，以未添加以上金屬鹽的肽樣品為參照，計(jì)算清除能力維持率[15]。

1.2.4.5 體外模擬消化對(duì)紅花籽蛋白及不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 制備模擬胃液及腸液后，分別取紅花籽蛋白（SSP）及分離后的多肽2 mg/mL，調(diào)pH 至2，控制溫度37 ℃，加入5 mL 人工胃液混勻，37 ℃水浴振蕩2 h，100 ℃水浴加熱10 min終止反應(yīng)，冷卻后5000 r/min 離心15 min。胃模擬處理2 h 后NaOH 調(diào)pH 為8，加入5 mL 人工腸液，37 ℃水浴反應(yīng)3 h，每1 h 取樣，沸水浴加熱10 min終止反應(yīng)，冷卻后5000 r/min 離心15 min，以紅花籽蛋白為對(duì)照，分別計(jì)算胃消化、腸消化上清液自由基清除率[19]。

1.2.5 體外抗氧化活性和維持率的測(cè)定

1.2.5.1 體外抗氧化活性的測(cè)定 DPPH 自由基清除率參考MULLA 等[20]的方法并稍加改動(dòng)，水楊酸法測(cè)定·OH 清除率參考胡磊[21]的方法稍加改動(dòng)，鄰苯三酚法測(cè)定O2?·清除率參考LU 等[22]的方法并稍加改動(dòng)。

1.2.5.2 抗氧化活性維持率的測(cè)定 為了更直觀表達(dá)紅花籽多肽抗氧化穩(wěn)定性，各組分別測(cè)定處理前、后的DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除率，方法參考1.2.5.1，比值定義為能力維持率，各自由基清除率分別以處理前樣品活性為參照，計(jì)算公式如下：

式中：A0、A1分別表示處理前、后多肽DPPH自由基清除率；A2、A3表示處理前、后多肽O2?·清除率；A4、A5表示處理前、后多肽·OH 清除率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組做三次平行試驗(yàn)，采用Excel 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Origin 8.5 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物及不同分子量多肽抗氧化活性測(cè)定

測(cè)定酶解產(chǎn)物及各超濾組分DPPH 自由基、O2?·及·OH 自由基清除率以評(píng)價(jià)不同組分的抗氧化活性。分離后的紅花籽蛋白多肽SSPH-Ⅰ、SSPH-Ⅱ組抗氧化活性顯著高于酶解產(chǎn)物（P＜0.05），SSPH-Ⅲ、SSPH-Ⅳ組抗氧化活性對(duì)比分離前顯著降低（P＜0.05）（見圖1），多肽的抗氧化活性與分子量大小、氨基酸組成種類及排列順序有關(guān)[23]，超濾分離后，分子量較小的紅花籽多肽抗氧化活性顯著高于酶解產(chǎn)物和分子量較大多肽（P＜0.05），這可能是因?yàn)槌瑸V分子量小的多肽具有較小的空間位阻，可以作為更好的電子供體，與自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的最終產(chǎn)物，這與桃仁、玉米及紫蘇籽等大部分植物蛋白肽研究結(jié)果相同，同樣發(fā)現(xiàn)分子量較小的多肽自由基清除率較高[24?26]。因此，只對(duì)初步分離后SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ的抗氧化活性穩(wěn)定性進(jìn)行研究。

圖1 紅花籽蛋白酶解產(chǎn)物及不同分子量多肽抗氧化活性測(cè)定Fig.1 Determination of antioxidant activity of different molecular weight polypeptides and proteolytic products of safflower seed

2.2 紅花籽蛋白抗氧化肽活性穩(wěn)定性研究

2.2.1 溫度對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 溫度升高對(duì)SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ多肽組分DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除率的影響并不明顯（圖2），SSPH-Ⅱ組O2?·和·OH 清除能力維持率雖在100 ℃時(shí)出現(xiàn)波動(dòng)，但121 ℃時(shí)各自由基清除能力維持率最低仍維持93%左右。SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ抗氧化活性對(duì)溫度的敏感度都較低，這與玉米肽在高溫環(huán)境下仍能保持抗氧化活性相似[25]。這可能是因?yàn)殡亩蔚姆肿恿枯^小，在不超過某個(gè)特定溫度的條件下，肽的結(jié)構(gòu)變性較少，也可能是因?yàn)?，肽的結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，沒有受高溫分解發(fā)生不可逆變性，且紅花籽蛋白耐熱性氨基酸含量高，紅花籽多肽可能含有如Pro 等能表現(xiàn)出抗熱、抗鹽的氨基酸基團(tuán)[9,27]。因此，在熱穩(wěn)定性測(cè)定中，SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ的抗氧化活性受高溫影響較小。

圖2 溫度對(duì)SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.2 Effects of temperatures on antioxidant activities of SSPH-Ⅰ (a) and SSPH-Ⅱ (b)

2.2.2 pH 對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 不同pH 環(huán)境下，SSPH-Ⅰ、SSPH-Ⅱ各自由基清除能力維持率具有顯著性差異（P＜0.05），在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下，兩者DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除能力維持率都顯著降低（P＜0.05），只維持在40%左右，而pH 在6～8 時(shí)，SSPH-Ⅰ及SSPH-Ⅱ的各自由基清除能力維持率最高達(dá)到98%左右（見圖3）。這是因?yàn)樵趶?qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下，紅花籽抗氧化肽SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ發(fā)生外消旋或脫酰胺反應(yīng)，其含有的L-型氨基酸部分轉(zhuǎn)化為D-型氨基酸，形成D-和L-型多肽混合物，引起了化合物極性、空間位置等結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變，當(dāng)在強(qiáng)堿性條件下還可能會(huì)消耗紅花籽多肽提供清除自由基效果的氫供體上的氫，影響多肽帶電荷性質(zhì)，導(dǎo)致活性下降[28]，這與元寶楓籽抗氧化肽在過酸過堿環(huán)境中活性顯著下降得到的結(jié)果一致[29]，因此，弱酸弱堿環(huán)境對(duì)紅花籽抗氧化肽活性影響較小。

圖3 pH 對(duì)SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.3 Effects of pH on antioxidant activity of SSPH-Ⅰ(a) and SSPH-Ⅱ (b)

2.2.3 食品原輔料對(duì)紅花籽蛋白不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響

2.2.3.1 NaCl 對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 添加不同濃度NaCl 對(duì)紅花籽抗氧化肽SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ兩組分的DPPH 自由基、O2?·及·OH 的清除率維持率影響不明顯（見圖4），SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ的自由基清除能力維持率隨著NaCl濃度的增加，呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，當(dāng)NaCl 濃度為10 g/100 mL 時(shí)，SSPH-Ⅰ各自由基清除能力維持率分別增加至108%、107%、105%；SSPH-Ⅱ各自由基清除能力維持率分別增加至105%、106%、104%左右，這可能是因?yàn)榧尤隢aCl 后，離子化的Na+和Cl?會(huì)打破肽的電荷平衡，使溶液體系中的離子強(qiáng)度發(fā)生變化，增強(qiáng)自由基清除能力，這與紫花蕓豆和魚膠原蛋白肽研究得到的結(jié)果相似[30?31]。由此可見，一定濃度的NaCl 可以對(duì)多肽抗氧化活性產(chǎn)生增效協(xié)同作用。

圖4 NaCl 對(duì)SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of NaCl on antioxidant activity of SSPH-Ⅰ（a）and SSPH-Ⅱ（b）

2.2.3.2 蔗糖和葡萄糖對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 添加蔗糖和葡萄糖對(duì)紅花籽抗氧化肽（SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ）活性的影響如圖5 所示，蔗糖含量在2～10 g/100 mL 范圍內(nèi)時(shí)，SSPH-Ⅰ三種自由基清除能力維持率均保持在95%以上，SSPH-Ⅱ三種自由基清除能力維持率保持在93%以上，兩種分子量多肽的抗氧化活性均未見明顯變化。葡萄糖含量在2～10 g/100 mL 范圍時(shí)，SSPH-Ⅰ三種自由基清除能力維持率相比添加蔗糖明顯上升，最高濃度下增加至106%，SSPH-Ⅱ的三種自由基清除能力維持率也有所上升，最高濃度下增加至104%（見圖5）。葡萄糖對(duì)紅花籽抗氧化肽活性的影響大于蔗糖，可能是因?yàn)?00 ℃加熱條件下，葡萄糖加入后發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成醛、酮等還原性物質(zhì)在一定程度上提高了抗氧化能力，而蔗糖不屬于還原糖，不與多肽發(fā)生反應(yīng)，證實(shí)了高溫下還原糖與多肽結(jié)合產(chǎn)生某些物質(zhì)能增強(qiáng)抗氧化活性這一結(jié)論，且與芝麻多肽美拉德反應(yīng)后抗氧化活性提高得到的結(jié)果相似[32]。因此，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的添加能增強(qiáng)SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ的抗氧化活性，添加蔗糖對(duì)其活性影響不大。

圖5 蔗糖和葡萄糖對(duì)SSPH-Ⅰ（a、c）和SSPH-Ⅱ（b、d）抗氧化活性的影響Fig.5 Effects of sucrose and glucose on antioxidant activities of SSPH-I（a,c）and SSPH-II（b,d）

2.2.3.3 檸檬酸對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 在紅花籽抗氧化肽（SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ）中添加一定濃度的檸檬酸，能夠提升SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ自由基清除能力。一定濃度范圍內(nèi)，檸檬酸的濃度越高，SSPH-Ⅰ的各自由基清除活性越高，當(dāng)濃度為0.2 g/100 mL 時(shí)，各自由基維持率提高了3%～5%（圖6a），這可能是因?yàn)闄幟仕嶂械聂然蛄u基可能會(huì)與肽鏈上的某些氨基酸殘基結(jié)合成為供氫體，從而增加自由基清除率。檸檬酸濃度對(duì)SSPH-Ⅱ各自由基清除率影響較小，這可能是由于檸檬酸分子的羥基結(jié)構(gòu)對(duì)抗氧化劑起到穩(wěn)定的作用，故當(dāng)濃度最大時(shí)，各維持率接近100%（圖6b），與菜籽肽添加檸檬酸后活性穩(wěn)定結(jié)果一致[15]。檸檬酸溶液雖然呈酸性，但試驗(yàn)中的濃度范圍對(duì)于體系pH 影響較小，可忽略不計(jì)。因此，檸檬酸有助于提升SSPH-Ⅰ自由基清除能力，對(duì)SSPH-Ⅱ活性無明顯影響。

圖6 檸檬酸對(duì)SSPH-Ⅰ（a）和SSPH-Ⅱ（b）抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of citric acid on antioxidant activity of SSPH-Ⅰ（a）and SSPH-Ⅱ（b）

2.2.3.4 防腐劑對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 防腐劑是食品加工過程中常用的食品添加劑。兩種常見防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉添加后對(duì)SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ的活性穩(wěn)定性影響較?。ㄒ妶D7）。添加一定濃度山梨酸鉀后，如圖7a、b 所示，SSPH-Ⅰ活性維持率出現(xiàn)先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，SSPH-Ⅱ活性維持率呈緩慢下降趨勢(shì)；添加一定苯甲酸鈉后（圖7c、d），SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ活性維持率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在兩種防腐劑添加濃度達(dá)到最大時(shí)，SSPH-Ⅰ各自由基維持率最低達(dá)到85%以上，SSPH-Ⅱ各自由基維持率最低在83%以上。因此，在規(guī)定使用濃度范圍內(nèi)，兩者不會(huì)對(duì)SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ自由基清除能力造成嚴(yán)重干擾，紅花籽抗氧化肽依然能保持較好的抗氧化功效，這與小米醇溶蛋白肽防腐劑對(duì)其穩(wěn)定性影響的研究結(jié)果相似[33]。

圖7 山梨酸鉀和苯甲酸鈉對(duì)SSPH-Ⅰ（a、c）和SSPH-Ⅱ（b、d）抗氧化活性的影響Fig.7 Effects of potassium sorbate and sodium benzoate on antioxidant activities of SSPH-Ⅰ（a,c）and SSPH-Ⅱ（b,d）

2.2.4 金屬離子對(duì)紅花籽不同分子量多肽抗氧化穩(wěn)定性的影響 食品在加工、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸中不可避免地要接觸各種金屬容器，不同金屬離子對(duì)紅花籽抗氧化肽（SSPH-Ⅰ和SSPH-Ⅱ）活性影響差異顯著（P＜0.05），添加金屬離子后SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ自由基清除能力維持率顯著下降（P＜0.05），不同金屬離子對(duì)SSPH-Ⅰ影響排序?yàn)镃u2+＞Zn2+＞K+＞Mg2+＞Ca2+，添加Cu2+后，各活性維持率僅在55%、54%、55%左右。金屬離子對(duì)SSPH-Ⅱ影響排序?yàn)閆n2+＞Cu2+＞K+＞Mg2+＞Ca2+，添加Zn2+后，各活性維持率僅在52%、53%、52%左右（見表1）。這可能是因?yàn)槠淦茐牧硕嚯闹g的特殊化學(xué)力作用，導(dǎo)致溶解度降低、疏水基團(tuán)外露等性質(zhì)改變[34]。因此，在加工應(yīng)用過程中應(yīng)避免與Cu2+、Zn2+等金屬離子接觸，保持抗氧化活性穩(wěn)定。

表1 不同金屬離子對(duì)紅花籽不同分子量多肽活性穩(wěn)定性影響Table 1 Effects of different metal ions on the activity and stability of polypeptides with different molecular weights in safflower seed

2.2.5 體外模擬胃腸消化對(duì)紅花籽蛋白及不同分子量多肽抗氧化活性影響 紅花籽蛋白及不同分子量多肽經(jīng)體外模擬胃腸消化后三種自由基清除率差異較大（圖8）。總體來看，消化各個(gè)階段的SSP 抗氧化活性顯著低于酶解分離后的多肽（P＜0.05），且胃消化對(duì)自由基清除活性影響顯著小于腸消化（P＜0.05）；SSPH-Ⅰ在胃消化2 h 前、后各自由基清除能力無顯著差異（P＞0.05）；腸消化3 h 后各自由清除能力顯著下降（P＜0.05），但維持率仍在80%以上。SSPH-Ⅱ在胃消化后各自由基清除率對(duì)比消化前顯著下降，腸消化后下降更為顯著（P＜0.05），三種自由基維持率最高僅為77%，這與菠蘿蜜籽抗氧化肽胃腸消化得到的結(jié)果相似，在胃腸消化一段時(shí)間后活性下降[9]。這可能是因?yàn)镾SPH-Ⅰ分子量較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，酶解位點(diǎn)酶切完全，在消化過程中結(jié)構(gòu)沒有被破壞，活性較穩(wěn)定，對(duì)胃腸消化酶具有一定耐受度；而SSPH-Ⅱ抗氧化活性顯著下降，是由于SSPH-Ⅱ肽鏈長(zhǎng)度與結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，更多的疏水基團(tuán)被酶解反應(yīng)破壞，氨基酸排列順序及結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，抗氧化活性降低，也可能是因?yàn)槠湓谀M腸道消化過程中對(duì)環(huán)境變化較敏感，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致抗氧化活性降低[9,35?36]。綜合來看，SSPH-Ⅰ（＜3 kDa）對(duì)體模擬胃腸消化有更強(qiáng)的耐受性。

圖8 紅花籽蛋白及不同分子量多肽體外模擬消化抗氧化活性變化Fig.8 Antioxidant activity of safflower seed protein and different molecular weight polypeptides during simulated digestion in vitro

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了加工、貯藏及模擬胃腸消化等環(huán)境因素對(duì)不同分子量紅花籽抗氧化肽穩(wěn)定性的影響。紅花籽蛋白復(fù)合酶水解后對(duì)酶解產(chǎn)物超濾分離，分離后SSPH-Ⅰ與SSPH-Ⅱ抗氧化活性顯著上升（P＜0.05），以DPPH 自由基、O2?·及·OH 清除能力維持率為指標(biāo)，考察不同分子量抗氧化肽活性穩(wěn)定性，篩選得到了抗氧化穩(wěn)定性高的多肽組分（＜3 kDa），在高溫、弱酸弱堿環(huán)境下能保持抗氧化活性穩(wěn)定，添加一定濃度NaCl、檸檬酸和葡萄糖對(duì)SSPH-Ⅰ抗氧化活性具有增效協(xié)同作用，蔗糖、防腐劑對(duì)其抗氧化活性影響不明顯，常見金屬離子對(duì)紅花籽抗氧化肽的穩(wěn)定性影響不一，在應(yīng)用過程中避免與Cu2+、Zn2+等金屬離子接觸，經(jīng)模擬胃腸消化，SSPH-Ⅰ在模擬胃消化時(shí)活性較穩(wěn)定，在模擬腸消化時(shí)活性下降顯著（P＜0.05），但維持率仍在80%以上。本文初步得到＜3 kDa 分子量紅花籽抗氧化肽活性較強(qiáng)且在常見加工過程及模擬胃腸消化環(huán)境影響下活性較穩(wěn)定，后續(xù)可對(duì)其進(jìn)一步純化，研究體內(nèi)活性發(fā)揮效果，為新型抗氧化肽功能性產(chǎn)品的開發(fā)與工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)，促進(jìn)紅花產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)與發(fā)展。