譚 戈，朱新貴，李學(xué)偉，肖亮琴，唐鴻標(biāo)，鄭倩望，郭麗瓊,，林俊芳,

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642；3.李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東江門 529156）

醬油，是一種歷史悠久的傳統(tǒng)調(diào)味品，以大豆、小麥等為主要原料，經(jīng)多種微生物及其酶系的作用，水解成多種糖類和氨基酸，再經(jīng)一系列新陳代謝反應(yīng)，最后形成具有獨(dú)特色香味的調(diào)味品[1?2]。在對(duì)醬油風(fēng)味研究中，氣相色譜-質(zhì)譜（gaschrom atographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)是一種較為常規(guī)的代謝組學(xué)工具，是目前應(yīng)用廣泛的揮發(fā)物測(cè)定分析技術(shù)和方法[3?5]。

從天然發(fā)酵醬油，到接種米曲霉純種制曲，再到接種米曲霉和黑曲霉混合制曲，雖然解決了傳統(tǒng)天然發(fā)酵醬油發(fā)酵體系中酶活力較低、發(fā)酵周期長(zhǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等難題，但由于醬油發(fā)酵體系中酶系單一而造成原料無法被充分分解[6]。在現(xiàn)有的技術(shù)條件下，多種酶系只能依靠多種菌株來分泌，因此多菌混合發(fā)酵是保證醬油質(zhì)量及其風(fēng)味的基礎(chǔ)。在整個(gè)醬油釀造過程中，微生物起著至關(guān)重要的作用，其中耐鹽風(fēng)味酵母菌的存在更是為醬油的風(fēng)味做出了巨大的貢獻(xiàn)，使得釀造醬油的醇味和酯味更加濃郁，風(fēng)味物質(zhì)更加完善[7?8]。Liu 等[9]以米曲霉和魯氏接合酵母混合制曲，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵醬油的谷氨酸含量較單一米曲霉制曲對(duì)照組提高了46.16%，乙酸乙酯和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚等風(fēng)味物質(zhì)也得到明顯性提升。鄒謀勇等[10]發(fā)現(xiàn)添加了酵母菌株C.oceani922-1 后，醬油中2-苯乙醇含量較對(duì)照組提高了6 倍，風(fēng)味也得到了明顯的改善。Wah 等[11]將季也蒙畢赤酵母接種到醬油中參與發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)愈創(chuàng)木酚和4-乙基-愈創(chuàng)木酚等風(fēng)味物質(zhì)的形成，進(jìn)而改善了醬油品質(zhì)。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種無監(jiān)督的多元變量統(tǒng)計(jì)分析手段，是在代謝組學(xué)分析中應(yīng)用廣泛的工具[12?13]，可用于不同發(fā)酵周期[13]、不同加工方式[14?15]、不同品種[16?18]和不同產(chǎn)地[19]樣品間進(jìn)行快速區(qū)分鑒定。

本文通過測(cè)定JL-02 菌株耐鹽性、成曲pH、成曲酶活力和不同釀造醬油工藝釀造出來的兩種醬油主要理化指標(biāo)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)來研究魯氏接合酵母的添加對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的影響，為醬油企業(yè)進(jìn)行強(qiáng)化酵母菌釀造醬油生產(chǎn)工藝提供思路和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 哈爾濱谷禾商貿(mào)有限公司；面粉 拓城縣馬培中農(nóng)產(chǎn)品加工經(jīng)營(yíng)部；醬油曲精（米曲霉3.042） 玉園生物科技有限公司；魯氏接合酵母JL-02本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；福林酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；甲醛、氫氧化鈉、鹽酸 分析純，廣州化學(xué)試劑廠；YPD 培養(yǎng)基：1%酵母抽提物，2%葡萄糖，2%蛋白胨，115 ℃滅菌20 min，固體培養(yǎng)基則添加2%瓊脂粉 自行配制；酵母抽提物、葡萄糖、蛋白胨 廣東環(huán)凱生物科技有限公司；瓊脂粉Biofroxx。

TSQ8000 Evo 賽默飛氣質(zhì)聯(lián)用儀、TG-WAXMX毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm） 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；50/30 μm CAR/PDMS/DVB 萃取頭 美國(guó)Supelco 公司；Bioscreen C 全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 Oy Growth Curves Ab Ltd；UV-4802S紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；LS-35 HD 立式壓力蒸汽滅菌鍋 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；Centrifuge 5804 R 臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司；PB-10 酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SPH-2000 生化培養(yǎng)箱 廣州市深華生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐鹽實(shí)驗(yàn) 挑取JL-02 單菌落接種于YPD 液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min 恒溫培養(yǎng)24 h，得到JL-02 種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液按照1%的接種量分別接種于含NaCl 濃度為0%、5%、10%、16%和20%的YPD 培養(yǎng)基（參考某企業(yè)醬油產(chǎn)品含鹽量而設(shè)計(jì)的鹽濃度梯度，空白YPD 培養(yǎng)基作調(diào)零組），30 ℃，恒溫振蕩培養(yǎng)，用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定其在600 nm 的吸光度。

1.2.2 醬油主要發(fā)酵工藝

1.2.2.1 制曲工藝 參考劉晶晶[20]的醬油釀造工藝，并稍作修改，結(jié)合圖1 醬油制備工藝流程，以質(zhì)量百分比計(jì)算，稱取75%黃豆，加1.2 倍潤(rùn)水量（靜置浸泡2 h），置于高溫蒸汽滅菌鍋滅菌，滅菌程序?yàn)?21 ℃，15 min。將滅菌后的熟料快速冷卻至40 ℃，拌入25%面粉（經(jīng)75 ℃干熱滅菌后冷卻）。接入0.15%醬油曲精，攪拌均勻，置于生化培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)，在制曲的第8 h 和第16 h 分別翻曲一次，第40 h 時(shí)，曲料表面遍布黃綠色菌絲，制曲完成。

圖1 醬油生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Soy sauce production process

1.2.2.2 發(fā)酵工藝 參考某企業(yè)生產(chǎn)參數(shù)，配制18 °Bé/20 ℃鹽水，以成曲：鹽水質(zhì)量比=1:2.27 的比例混合，攪拌均勻后，置于2 L 發(fā)酵壇子中，常溫發(fā)酵，發(fā)酵前兩周每天攪拌一次，后面每周攪拌一次，發(fā)酵周期為90 d。

1.2.2.3 JL-02 菌株添加方式及時(shí)間 采用YPD 液體培養(yǎng)基將JL-02（接種量為4%）培養(yǎng)OD600至1.0 后，量取其發(fā)酵液于離心管中進(jìn)行離心，離心程序?yàn)?000 r/min，4 ℃，15 min，收集底部菌體后，用少量醬油進(jìn)行混勻，加入處于發(fā)酵第30 d 中的醬油壇子中，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組實(shí)驗(yàn)（JL-02 菌株接種量為0）。

1.2.3 成曲酶活、pH 的測(cè)定 在制曲結(jié)束后，對(duì)成曲的pH 和中性蛋白酶酶活力進(jìn)行測(cè)定（另收集部分成曲置于4 ℃保藏，備用），其中，pH 測(cè)定參考Feng 等[21]關(guān)于醬油pH 的測(cè)定方法，酶活力的測(cè)定采用福林法[22]。

1.2.4 醬油發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的測(cè)定 在兩組醬油發(fā)酵的第0、15、30、45、60、75 和90 d 分別進(jìn)行采樣，-20 ℃保存，試驗(yàn)前進(jìn)行離心，離心程序?yàn)? ℃，6000 r/min，15 min。對(duì)醬油發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)變化進(jìn)行測(cè)定。醬油氨基態(tài)氮、pH 和總酸指標(biāo)測(cè)定方法參考國(guó)標(biāo)[23]，其中氨基態(tài)氮含量的測(cè)定采用甲醛法，總酸含量測(cè)定采用酸度計(jì)法，pH 的測(cè)定采用精密pH 計(jì)測(cè)定；還原糖測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法[20]。

1.2.5 GC-MS 測(cè)定成曲、兩組90 d 醬油揮發(fā)性風(fēng)味成分 進(jìn)樣方法：吸取5 mL 醬油樣品（稱取混勻后的成曲2 g 置于20 mL 頂空瓶中，加入4 mL 去離子水，攪拌均勻），置于20 mL 頂空瓶中將頂空瓶加蓋密封。啟動(dòng)GC-MS 自動(dòng)進(jìn)樣裝置，程序?yàn)?0 ℃恒溫震蕩，平衡10 min，萃取頭吸附30 min，等待GC進(jìn)樣。

色譜條件：TG-WAXMX 毛細(xì)管柱；載氣：氦氣；載氣流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣口溫度：240 ℃；解吸時(shí)間：3 min；程序升溫條件：初溫45 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 升溫至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源：能量70 eV，離子源溫度：240 ℃；接口溫度：240 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z：33～450 u。

定性方法：儀器設(shè)備配置的NIST 譜庫(kù)（2016），并參考醬油揮發(fā)性風(fēng)味成分的文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行綜合鑒定。

定量方法：利用峰面積歸一化法，得到各組分的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019 和SPSS 26 等軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（所有實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3 次）。繪圖軟件為Origin 2021 和SIMCA 17.0.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 JL-02 耐鹽性

如圖2 所示，不同NaCl 濃度的YPD 培養(yǎng)基對(duì)JL-02 生長(zhǎng)速率影響較為明顯。隨著NaCl 濃度的增加，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞個(gè)數(shù)濃度逐漸下降。對(duì)于JL-02 菌株，當(dāng)其處于16% NaCl 的環(huán)境下時(shí)，其對(duì)數(shù)期的到來較0% NaCl 組延遲約20 h；穩(wěn)定期時(shí)，細(xì)胞個(gè)數(shù)濃度亦較空白對(duì)照組略低，基本上能正常生長(zhǎng)。當(dāng)其處于20% NaCl 時(shí)，JL-02 基本上一直處于延滯期，說明該菌株并不能耐受20%的鹽度環(huán)境，但在整個(gè)醬油發(fā)酵中，其鹽水含量接近16%，由此說明該菌株可在醬油發(fā)酵體系中生長(zhǎng)。

圖2 不同NaCl 濃度下YPD 液體培養(yǎng)基中JL-02菌株生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of JL-02 strain in YPD liquid medium under different NaCl concentrations

2.2 成曲時(shí)pH 和酶活力的測(cè)定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)測(cè)得成曲中的pH 為6.85±0.08。在整個(gè)醬油制曲過程中，溫度、濕度等條件比較適宜時(shí)，米曲霉占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)時(shí)，成曲的pH 通常接近中性。

醬油的釀造過程中，成曲時(shí)酶活力的高低對(duì)原料的利用率和醬油成品的品質(zhì)有著重要的影響，故企業(yè)在生產(chǎn)時(shí)往往將成曲時(shí)中性酶活性的大小，作為衡量制曲是否成功的重要標(biāo)志，也常將提高酶活力作為提高醬油品質(zhì)的一條重要途徑，尤其是蛋白酶活力[24?26]。蛋白酶可以將原料中的蛋白進(jìn)行分解，生成各類呈味氨基酸，如谷氨酸，對(duì)醬油獨(dú)特的滋味和香氣具有重要作用。本次測(cè)得成曲中中性蛋白酶活力為（2109.2±45.2）U/g，與樊嘉訓(xùn)等[27]誘變選育的米曲霉H34 的酶活力差距較大，但較其利用米曲霉3.042純種制曲后的酶活力高出690.1 U/g，制曲結(jié)果較為理想。

2.3 醬油主要理化指標(biāo)的分析

還原糖、氨基態(tài)氮、總酸和pH 是反映醬油品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，與醬油的發(fā)酵有著密切的聯(lián)系。對(duì)醬油發(fā)酵動(dòng)態(tài)過程中醬油的還原糖、氨基態(tài)氮、總酸和pH 理化指標(biāo)進(jìn)行分析，得出添加JL-02 菌株后使醬油的總酸、pH 和還原糖較對(duì)照組有明顯影響，即添加JL-02 菌株后醬油的總酸含量較對(duì)照組明顯升高，pH 和還原糖含量較對(duì)照組明顯下降，而對(duì)氨基態(tài)氮指標(biāo)則無明顯影響。由圖3a 可知，發(fā)酵完成后，JL-02 組還原糖含量為（1.06±0.01）g/100 mL，對(duì)照組中還原糖是JL-02 組的1.27 倍，這可能是由于JL-02菌株的加入，增加了其對(duì)還原糖的利用，進(jìn)而合成醇類等風(fēng)味物質(zhì)，這與鐘小廷等[28]、呂變梅等[29]的研究結(jié)果較為接近。由圖3b 可知，兩組實(shí)驗(yàn)中的氨基態(tài)氮含量在0～30 d 均有較大幅度的提升，這主要是米曲霉的蛋白酶水解蛋白質(zhì)，使得氨基態(tài)氮的含量能迅速提升，后期逐漸趨于穩(wěn)定[20]，最后兩組醬油中氨基態(tài)氮含量均接近1.0 g/100 mL，達(dá)到了特級(jí)醬油標(biāo)準(zhǔn)。由圖3c 可知，兩組醬油在發(fā)酵第0～15 d 時(shí)，總酸含量迅速上升，在發(fā)酵后期呈現(xiàn)出一定的波動(dòng)性。JL-02組在第30～45 d 時(shí)總酸含量有所下降，可能是由于JL-02 菌株的加入產(chǎn)生了較多醇類，與酸類合成了酯類等風(fēng)味物質(zhì)，最后總酸含量為（1.14±0.01）g/100 mL?？傮w而言，對(duì)照組總酸較添加酵母JL-02 組稍低，這與權(quán)武等[30]的研究結(jié)果較為一致。由圖3d 可知，兩組醬油的pH 隨著發(fā)酵的開始，都有不同程度地下降，最后pH 趨于5.0 左右（實(shí)驗(yàn)組pH 為5.09±0.03，對(duì)照組pH 為5.25±0.03），在一定程度上也有利于醬油的防腐[31]。

圖3 高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中理化指標(biāo)的變化趨勢(shì)Fig.3 The change trend of physical and chemical indexes in high-salt dilute fermented soy sauce

2.4 成曲、兩組90 d 醬油揮發(fā)性風(fēng)味測(cè)定結(jié)果

由表1 和圖4 可知，在制曲完成后，成曲揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類有15 種，其中，化合物種類排序?yàn)榇碱悾? 種）、醛類（4 種）和酯類（3 種），相對(duì)含量占比排序前三為醇類（77.72%±23.02%）、醛類（19.02%±8.79%）和酯類（3.26%±0.32%）；在對(duì)照組中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類有52 種，其中，化合物種類排序前三為酯類（24 種）、醛類（11 種）和醇類（11 種），相對(duì)含量占比排序前三為醇類（71.82%±4.47%）、酯類（11.77%±1.17%）、醛類（7.97%±0.99%）；在JL-02 組中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類有57 種，其中，化合物種類排序前三為酯類（26 種）、醇類（11 種）、醛類（7 種）和酮類（7 種），相對(duì)含量占比排序前三為醇類（69.96%±4.66%）、酯類（19.04%±2.50%）和酮類（2.99%±0.41%）。從上述數(shù)據(jù)得知，制曲完成后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類相對(duì)較少，在后期醬油發(fā)酵過程中，風(fēng)味物質(zhì)種類增加明顯，約40 種，且添加JL-02 菌株后的醬油所含風(fēng)味物質(zhì)種類也得到了一定提高，如酚類、酮類和呋喃類（2-正戊基呋喃、4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮和2,3-二氫苯并呋喃），使醬油釀造過程中的風(fēng)味物質(zhì)種類發(fā)生了一定的轉(zhuǎn)變。

表1 成曲和兩組醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量Table 1 Relative content of volatile flavor compounds in koji and two groups of soy sauce

續(xù)表1

圖4 成曲和兩組醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量占比及種類Fig.4 The relative content and types of volatile flavor substances in koji and two groups of soy sauce

2.5 成曲、兩組醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.5.1 成曲、兩組醬油PCA 結(jié)果 對(duì)成曲和兩組醬油進(jìn)行PCA 主成分分析，結(jié)果見圖5。在圖5 中可看出，在95%的置信區(qū)間，PC1 和PC2 分別解釋了總方差的49.6%和45.7%，兩者貢獻(xiàn)率之和為95.3%，表明它們能代表樣品中大部分?jǐn)?shù)據(jù)?？傮w而言，成曲和兩組醬油具有較明顯的區(qū)域分布特征且呈現(xiàn)較高的聚類趨勢(shì)，PCA 結(jié)果良好。

圖5 成曲、兩組醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)PCA 圖Fig.5 PCA diagrams of volatile flavor compounds in koji and two groups of soy sauce

2.5.2 成曲、兩組醬油Biplot 結(jié)果 Biplot 圖，可以展示每一種風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)重要性及風(fēng)味化合物與樣品間的關(guān)系。對(duì)成曲和兩組醬油進(jìn)行Biplot 圖繪制，利用載荷信息找出這三者間的差異物質(zhì)，見圖6。分析圖6 得知，成曲組（序號(hào)4、5 和6，位于第一象限）主要與棕櫚酸甲酯這風(fēng)味物質(zhì)關(guān)聯(lián)度較大；JL-02 組（序號(hào)7、8 和9，位于第四象限）主要與苯乙酸甲酯、丁酸異戊酯、異丁酸異丁酯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、十一烷酮、2-十一酮、3-羥基-2-丁酮、2-壬酮、4-壬酮、4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、2,3-二氫苯并呋喃、2-正戊基呋喃、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、苯酚、（2S,3S）-（+）-2,3-丁二醇、糠醇和異丁醛等風(fēng)味化合物關(guān)聯(lián)度較大；對(duì)照組（序號(hào)1、2 和3，位于第二象限）主要與2，4-二甲基苯甲醛、2-苯基丁醛、（E）-巴豆醛、3-糠醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛、癸醛、辛醇、3-辛醇、反-2-辛烯醇、正丁醇、γ-壬內(nèi)酯、十五酸乙酯、壬酸乙酯、月桂酸乙酯、4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、丁基丙基甲酮、1-辛烯-3-酮等風(fēng)味化合物關(guān)聯(lián)度較大。

圖6 成曲、兩組醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Biplot 圖Fig.6 Biplot diagrams of volatile flavor compounds in koji and two groups of soy sauce

3 結(jié)論

本研究在測(cè)定了JL-02 菌株耐鹽性、成曲pH和中性酶活力的基礎(chǔ)上，圍繞著不同工藝釀造的醬油進(jìn)行了發(fā)酵過程主要理化指標(biāo)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)兩組醬油氨基態(tài)氮指標(biāo)均達(dá)到特級(jí)醬油（氨基態(tài)氮≥0.8 g/100 mL）的標(biāo)準(zhǔn)；強(qiáng)化魯氏接合酵母后的醬油較對(duì)照組總酸含量明顯增加，而還原糖含量和pH 明顯降低，氨基態(tài)氮含量無明顯差異；基于GC-MS 對(duì)成曲、兩組醬油進(jìn)行了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鑒定與分析，得知成曲、對(duì)照組醬油和JL-02 組醬油所含風(fēng)味物質(zhì)分別為15、52 和57 種，對(duì)其進(jìn)行了PCA 分析，得知樣品間聚類趨勢(shì)和分散結(jié)果較好；通過Biplot圖可知，成曲中與棕櫚酸甲酯關(guān)聯(lián)度較大，JL-02 組中與4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮等風(fēng)味物質(zhì)關(guān)聯(lián)度較大，同樣對(duì)照組與4-乙基愈創(chuàng)木酚等風(fēng)味物質(zhì)關(guān)聯(lián)度較大?；谏鲜?，可為醬油企業(yè)進(jìn)行強(qiáng)化酵母菌株釀造醬油的生產(chǎn)工藝提供一定的思路和技術(shù)方法。