戴文昊， 劉亦冰， 解強(qiáng)， ?？〗?， 高俊△， 張曦

1常州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科(江蘇常州 213003)； 2張曦省名中醫(yī)工作室(江蘇常州 213003)

隨著我國社會(huì)人口老齡化趨勢(shì)的不斷加深，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率逐年增高，所導(dǎo)致的一系列并發(fā)癥嚴(yán)重影響著老年人群的健康。OP是以全身骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折的慢性全身性骨代謝疾病。據(jù)研究，OP合并骨折的發(fā)生率接近10%[1]。而老年髖部骨折是骨質(zhì)疏松性骨折中一種較為常見且嚴(yán)重的骨折類型，OP也是導(dǎo)致老年髖部骨折且影響其預(yù)后的重要因素[2]。由于大部分患者機(jī)體功能衰退，代謝水平降低[3]，因此該類骨折具有風(fēng)險(xiǎn)大、預(yù)后差的特點(diǎn)。在OP的進(jìn)程中，骨代謝的異常極為顯著，當(dāng)代研究表明，除了內(nèi)分泌機(jī)制的影響，免疫細(xì)胞與其分泌的多種細(xì)胞因子相互作用，在信號(hào)通路的正負(fù)反饋調(diào)控下影響骨代謝，也會(huì)導(dǎo)致OP[4]。其中，T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在骨生成與骨吸收的調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵作用[5]。但目前對(duì)于骨折合并OP的免疫學(xué)機(jī)制研究較少。本研究通過檢測(cè)老年OP合并髖部骨折患者外周T淋巴細(xì)胞亞群、炎性細(xì)胞因子與骨代謝生化指標(biāo)，探討老年OP合并髖部骨折患者外周T淋巴細(xì)胞亞群、炎性細(xì)胞因子水平與骨代謝生化指標(biāo)的相關(guān)性，為評(píng)估該類骨折發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，為其防治提供臨床資料及理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月至2021年10月常州市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科收治的老年患者(年齡≥60歲)進(jìn)行研究。依據(jù)雙能X線骨密度測(cè)定儀檢測(cè)受試者L2-4處及股骨頸處骨密度值，按照《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南(2017)的骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)》[6]評(píng)判2個(gè)受檢部位中任一部位T值≤-2.5即診斷為OP。再根據(jù)是否發(fā)生髖部骨折，分選為：OP合并骨折組(A組)30例，其中男12例，女18例，年齡74～86歲，平均(79.88±3.52)歲；OP無骨折組(B組)30例，其中男13例，女17例，年齡68～85歲，平均(77.62±5.31)歲；選擇同一時(shí)期年齡、性別相匹配的體檢者30例作為對(duì)照組(C組)，其中男13例，女17例，年齡68～85歲，平均(76.38±7.98)歲。3組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)常州市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥60歲；(2)明確的髖部骨折；(3)OP診斷符合《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南(2017)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(4)患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴風(fēng)濕性免疫疾病患者；(2)由肝腎疾病、內(nèi)分泌疾病等導(dǎo)致的繼發(fā)性O(shè)P患者；(3)伴惡性腫瘤患者；(4)近6個(gè)月內(nèi)使用影響骨代謝的藥物患者。

1.2 樣本采集 取3組受試者早晨空腹肘靜脈血5 mL，室溫靜止15 min，2 800 r/min離心10 min，取血清，于-80℃冰箱保存待檢。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)，包括CD4+、CD8+、CD4+/CD8+；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)炎性細(xì)胞因子指標(biāo)，包括白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、γ干擾素(IFN-γ)；采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)骨代謝指標(biāo)，包括Ⅰ型膠原羧基末端肽(CTX)、Ⅰ型前膠原氨基端前肽(P1NP)；采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血鈣(Ca)、血磷(P)指標(biāo)，所有實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 外周T淋巴細(xì)胞亞群的含量 A組和B組血清中CD4+、CD8+含量低于C組，A組低于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3組間CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 3組受試者血清外周T淋巴細(xì)胞亞群的比較

2.2 炎性細(xì)胞因子的含量 A組和B組血清中IL-6、TNF-α含量高于C組，A組高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3組間IFN-γ差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 骨代謝生化標(biāo)志物的含量 A組和B組血清中CTX、P1NP含量高于C組，A組高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，3組間Ca、P差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 3組受試者血清炎性細(xì)胞因子的比較

表3 3組受試者血清骨代謝生化標(biāo)志物的比較

2.4 外周T淋巴細(xì)胞亞群、炎性細(xì)胞因子水平與骨代謝生化指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，老年OP合并髖部骨折患者血清中CD4+與CD8+含量與CTX、P1NP含量呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，IL-6、TNF-α含量與CTX、P1NP含量呈正相關(guān)(P<0.05)，見表4。

表4 老年OP合并髖部骨折患者血清中CD4+、CD8+、IL-6、TNF-α與骨代謝生化指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

隨著我國人口老齡化現(xiàn)象的加劇，OP已經(jīng)成為一個(gè)重要的公共健康問題，由OP導(dǎo)致的老年髖部骨折病例也呈逐年上升趨勢(shì)[7]。髖關(guān)節(jié)作為人體最大的負(fù)重關(guān)節(jié)，不僅支撐著上半身的重量，而且維持著下肢的活動(dòng)。當(dāng)老年人全身存在OP時(shí)，髖關(guān)節(jié)部位骨組織極易發(fā)生病變，發(fā)生髖部脆性骨折。與此同時(shí)，Trevisan等[8]對(duì)老年OP合并髖部骨折患者進(jìn)行調(diào)查隨訪，發(fā)現(xiàn)約1/6的患者出院后1年內(nèi)會(huì)發(fā)生第2次髖部骨折，研究表明二次髖部骨折可能進(jìn)一步影響老年人的臨床易感性和病死率，其罪魁禍?zhǔn)妆闶侨硇設(shè)P。因此，急需深入探究OP的發(fā)生機(jī)制，通過相關(guān)指標(biāo)評(píng)估該類骨折發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，從而找到更好的防治措施。以雌激素減少為觀點(diǎn)的內(nèi)分泌機(jī)制一直被認(rèn)為是導(dǎo)致OP的重要原因。2000年，Arron等[9]提出骨骼免疫學(xué)(Osteoimmunology)的概念，將骨骼系統(tǒng)與免疫學(xué)相結(jié)合。隨后，眾多研究者從各種信號(hào)通路與細(xì)胞因子參與骨組織細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間相互作用的分子機(jī)制角度進(jìn)行更深入的探究[4]，發(fā)現(xiàn)了核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand， RANKL)/核因子-κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)這一關(guān)鍵信號(hào)通路。而骨組織細(xì)胞與免疫細(xì)胞共享著包含相同細(xì)胞因子及其受體、信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)分子[10]。在骨代謝的過程中，成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)和破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)之間的動(dòng)態(tài)平衡受到免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子調(diào)控，一旦打破該平衡狀態(tài)，便會(huì)導(dǎo)致OP。來源于骨髓造血干細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞是一種能夠影響骨組織重塑的重要免疫細(xì)胞，以CD4+與CD8+細(xì)胞最具代表性。CD4+T細(xì)胞具有維持免疫的功能[11]。在適當(dāng)?shù)臈l件下，CD4+T細(xì)胞可分化為Th1、Th9、Th17、Treg等細(xì)胞。已有研究表明，Treg對(duì)骨組織吸收具有抑制作用[12]。CD8+T細(xì)胞通過表達(dá)大量OPG，抑制OC的形成，減緩骨吸收的速率。Weitzmann等[13]研究認(rèn)為，當(dāng)人體出于不同炎癥或病理?xiàng)l件下，T細(xì)胞發(fā)生活化，通過RANKL和TNF-α加速骨組織破壞，消耗了大量的CD4+和CD8+細(xì)胞。而CD4+/CD8+的比值能夠反映體內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定狀態(tài)，該狀態(tài)可能會(huì)影響OP的發(fā)生。筆者對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者外周T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)CD4+、CD8+與CD4+/CD8+含量變化進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組比較，A組和B組患者血清中CD4+與CD8+含量降低(P<0.05)，且A組患者的各項(xiàng)指標(biāo)低于B組(P<0.05)。而3組患者血清中CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這表明，CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的下降與OP及其誘發(fā)的老年髖部骨折存在密切的關(guān)系。因而推測(cè)外周T淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)CD4+、CD8+含量變化能夠影響骨代謝水平，打破了體內(nèi)骨形成與骨吸收之間的平衡狀態(tài)。

不僅是免疫細(xì)胞，其分泌的多種相關(guān)性細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α、IFN-γ等。既能夠促進(jìn)血細(xì)胞發(fā)育和調(diào)節(jié)免疫，又能通過OPG-RANKL-RANK依賴途徑或非依賴途徑對(duì)骨代謝產(chǎn)生影響[10]。由OB和B細(xì)胞分泌的IL-6是一種多功能的細(xì)胞因子[14]。研究認(rèn)為，IL-6參與了骨代謝的調(diào)節(jié)，人體內(nèi)雌激素對(duì)其有著抑制作用，防止其過度表達(dá)。病理狀態(tài)下，IL-6促進(jìn)OC分化，抑制OB分化[15]。TNF-α是RANKL介導(dǎo)的刺激破骨發(fā)生和骨吸收的關(guān)鍵信號(hào)分子[16]，一旦TNF-α的含量上升，便意味著存在OP的可能。TNF-γ也是一種多效細(xì)胞因子，它既能在正常生理?xiàng)l件下與OC上的受體結(jié)合，通過干擾RANKL對(duì)OC的效應(yīng)，抑制OC激活，保護(hù)骨組織。又能在病理?xiàng)l件下促進(jìn)RANKL表達(dá)，加速骨吸收[17]。筆者對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者炎性細(xì)胞因子：IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量變化進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果顯示：與健康對(duì)照組比較，A組和B組患者血清中IL-6與TNF-α含量升高(P<0.05)，且A組患者的各項(xiàng)指標(biāo)高于B組(P<0.05)，而3組患者血清中IFN-γ含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這說明，免疫細(xì)胞所分泌的如IL-6、TNF-α類型的細(xì)胞因子與老年OP合并髖部骨折也具有一定關(guān)聯(lián)性，推測(cè)有關(guān)細(xì)胞因子指標(biāo)也能反映人體內(nèi)骨代謝水平。

在骨代謝的過程中，骨組織不斷進(jìn)行著骨塑建與骨重建，骨代謝生化指標(biāo)能夠很好地反映人體內(nèi)OC與OB的活化程度和骨吸收與骨生成能力。CTX是一種骨吸收標(biāo)志物，由Ⅰ型膠原蛋白降解產(chǎn)生，直接反映OC活性與骨吸收能力[18]。P1NP是一種骨形成標(biāo)志物，由Ⅰ型前膠原在合成過程中產(chǎn)生，直接反映骨膠原的合成能力。人體內(nèi)的Ca與P也與骨轉(zhuǎn)換過程密切相關(guān)[19]。筆者對(duì)老年骨質(zhì)疏松患者骨代謝生化標(biāo)志物：CTX、P1NP、Ca及P的含量變化進(jìn)行了檢測(cè)分析，結(jié)果顯示：與C組比較，A組和B組患者血清中CTX、P1NP含量升高(P<0.05)，且A組患者的各項(xiàng)指標(biāo)高于B組(P<0.05)，而3組患者血清中Ca與P的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這也與李鵬等[20]的研究結(jié)果相一致。說明在OP誘導(dǎo)的老年髖部脆性骨折進(jìn)程中，OC的活性超過OB，破壞了骨代謝的穩(wěn)態(tài)，增加了骨代謝的產(chǎn)物，極大升高了合并髖部骨折的發(fā)生概率。

筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究老年OP合并髖部骨折發(fā)生過程中T淋巴細(xì)胞亞群、炎性細(xì)胞因子水平與骨代謝生化指標(biāo)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)該類患者血清中CD4+與CD8+含量與CTX、P1NP含量呈負(fù)相關(guān)，IL-6、TNF-α含量與CTX、P1NP含量呈正相關(guān)。這說明，老年OP合并髖部骨折發(fā)生過程中，可能由于T淋巴細(xì)胞活化分泌大量炎性細(xì)胞因子，使維持免疫，抑制骨吸收的CD4+與CD8+細(xì)胞大量減少，而在炎性環(huán)境下，促進(jìn)OC分化的相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、TNF-α分泌的增加，加快骨吸收速率，破壞骨代謝穩(wěn)態(tài)，從而使骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)CTX、P1NP升高。

本研究的不足之處有以下幾點(diǎn)：(1)樣本量不足，統(tǒng)計(jì)存在隨機(jī)誤差，可能影響結(jié)果。(2)CD4+細(xì)胞可分化為多種細(xì)胞，其中有報(bào)道認(rèn)為其分泌的Th17能夠刺激骨吸收[21]，CD4+細(xì)胞在OP過程中的變化機(jī)制還未探究明確。(3)骨形成標(biāo)志物P1NP在OP伴骨折的諸多研究中，變化結(jié)果不一致。仍需加大樣本量，進(jìn)一步探索。

綜上所述，老年OP合并髖部骨折患者血清中CD4+、CD8+分泌減少，IL-6、TNF-α分泌增加。上述指標(biāo)的異常促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化，抑制成骨細(xì)胞的活性，加速骨吸收，影響骨代謝，使老年OP合并髖部骨折的風(fēng)險(xiǎn)增加，其指標(biāo)對(duì)預(yù)測(cè)該類骨折發(fā)生有較大參考意義。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明均不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：戴文昊負(fù)責(zé)提出研究選題、設(shè)計(jì)研究方案、構(gòu)思撰寫論文；劉亦冰、解強(qiáng)負(fù)責(zé)采集統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；常俊杰負(fù)責(zé)完善研究思路、修改論文；高俊、張曦負(fù)責(zé)對(duì)論文批評(píng)性審閱與研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)和材料的支持。