孔令梅, 石燕燕, 唐瑩, 田蕾

1錦州市中心醫(yī)院消化內科(遼寧錦州 121000)； 2錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內科(遼寧錦州 121000)

結腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，直腸與乙狀結腸交界部位為主要發(fā)病位置[1-2]。結腸癌主要發(fā)病群體為中老年人群，具有發(fā)病率高、治療難度大、預后差的特點，據(jù)世界衛(wèi)生組織調查數(shù)據(jù)顯示，結腸癌發(fā)病率位居所有胃腸組織惡性腫瘤前3位，引起廣大專家學者的關注[3-4]。結腸癌患者患病前期無明顯臨床癥狀，難以被察覺，因此早期確診率較低，確診時病情惡化程度較高，導致預后較差，因此結腸癌早期檢查、診斷至關重要[5-6]。許多專家學者致力于結腸癌發(fā)病機制的研究，以期通過探尋新的腫瘤標志物，從而對結腸癌診斷及靶向治療進行研究[7]。本研究檢測結腸癌組織中基質金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14，MMP-14)、熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)、微小RNA-26a(microrna-26a，miR-26a)表達，從而探究三者表達與結腸癌臨床病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年6月至2021年6月于我院進行手術治療的結腸癌患者50例，年齡53～66歲，平均(59.5±5.2)歲，其中包括腺癌、黏液細胞癌各25例，腫瘤組織位于左半結腸26例，位于右半結腸24例，病理分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期患者24例，Ⅲ期患者5例，Ⅳ期患者4例；癌組織分化程度：高分化24例，中分化19例，低分化7例。本研究所有患者均知情同意，獲我院倫理委員會批準(2020MY04-2)。

納入標準：均符合結腸癌診斷標準[8]，均為首次確診，并進行根治手術手術治療，病歷資料齊全。

排除標準：(1)接受過放療、化療者；(2)手術禁忌證患者；(3)高血壓、心臟病患者；(4)合并其他惡性腫瘤者；(5)血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病患者；(6)溝通障礙者。

1.2 標本采集 收集結腸癌患者手術切除癌組織、距癌組織5 cm癌旁組織標本，將收集的組織標本切小塊(4 mm×4 mm×2 mm)，使用甲醛溶液浸泡、固定，脫水后石蠟包埋，4 μm厚度切片，做免疫組化標記。

1.3 指標檢測

1.3.1 免疫組化染色 切片脫蠟、水化處理，置入煮沸的檸檬酸修復液(高壓鍋)中2 min,降溫、自然冷卻至常溫，PBS液清洗3次后加入POD阻斷劑，30 min后再次使用PBS液清洗，添加一抗后過夜保存。取出后將一抗吸除，再次使用PBS液清洗，常溫環(huán)境下添加二抗并完全覆蓋，30 min后再次使用PBS液清洗，DAB染色后顯微鏡觀察，蘇木精染核，反藍、脫水處理后封片。

1.3.2 Western blot法檢測MMP-14、HSP27表達 待測標本中加入裂解液，提取總蛋白，定量、煮沸后進行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉膜、室內封閉，2 h后添加一抗(1∶2 000)過夜孵育，次日使用Western液清洗3次，之后添加二抗(1∶5 000)孵育，1 h后取出并再次使用Western液清洗3次，顯色、曝光、成像，檢測條帶灰度值，檢測MMP-14、HSP27相對表達量。

1.3.3 RT-PCR檢測miR-26a表達 使用Trizol法提取總RNA，逆轉錄處理，并進行擴增處理。miR-26a引物序列：上游：5′-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3′，下游：5′-CUAUCCUGAAUUACUUGAAUU-3′。反應條件：預變性處理10 min、變形處理10 s(95℃)，退火25 s(63℃)，延伸10 s(72℃)，進行42個循環(huán)，2-ΔΔCt方法計算miR-26a表達量。

2 結果

2.1 結腸癌癌旁組織、癌組織MMP-14、HSP27、miR-26a表達比較 與癌旁組織比較，癌組織MMP-14、HSP27表達較高，miR-26a表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1和圖1、2。

表1 結腸癌癌旁組織、癌組織MMP-14、HSP27、miR-26a表達比較

2.2 結腸癌患者MMP-14、HSP27、miR-26a表達與一般資料關系 不同性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤類型結腸癌患者MMP-14、HSP27、miR-26a表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

注：A:MMP-14; B:HSP27; C:miR-26a

注：A:MMP-14; B:HSP27; C:miR-26a

表2 結腸癌患者MMP-14、HSP27、miR-26a表達與一般資料的關系

2.3 結腸癌患者MMP-14、HSP27、miR-26a表達與病理特征關系 與腫瘤最大徑≤3 cm患者相比，腫瘤最大徑>3 cm患者MMP-14、HSP27表達較高，miR-26a表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Ⅰ+Ⅱ期相比，Ⅲ+Ⅳ期患者MMP-14、HSP27表達較高，miR-26a表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與無淋巴結轉移患者相比，有淋巴結轉移患者MMP-14、HSP27表達較高，miR-26a表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與高分化患者相比，中、低分化患者MMP-14、HSP27表達較高，miR-26a表達較低；與中分化患者相比，低分化患者MMP-14、HSP27表達較高，miR-26a表達較低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 結腸癌組織中MMP-14、HSP27、miR-26a表達相關性 結腸癌組織中MMP-14、HSP27呈正相關(r=0.455，P=0.001)；結腸癌組織中MMP-14、miR-26a呈負相關(r=-0.673，P=0.001)；結腸癌組織中HSP27、miR-26a呈負相關(r=-0.548，P=0.001)。見圖3。

3 討論

近年來隨著社會的不斷發(fā)展，人們生活方式改變，飲食習慣、結構也隨之改變，致使我國結腸癌發(fā)病率一直居高不下。據(jù)相關流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，我國新增結腸癌病例數(shù)呈逐年遞增趨勢，且患者預后較差，術后5年生存率較低[9-10]。目前臨床醫(yī)學尚未將結腸癌的發(fā)病趨勢研究透徹，許多專家學者開始嘗試使用基礎醫(yī)學、病理研究等渠道探究結腸癌發(fā)病機制，對結腸癌診斷、治療靶點進行研究[11-12]。

表3 結腸癌患者MMP-14、HSP27、miR-26a表達與病理特征的關系

MMP-14為MMP家族的重要組成成員，具有降解細胞外基質成分、基底膜、細胞因子及激活其他多種MMP的作用[13]。有研究表示，MMP-14能夠激活MMP-2、MMP-13等因子，從而促進腫瘤組織浸潤性生長、轉移的作用[14]。還有研究表示，MMP-14能夠促進VEGF等因子表達，具有促進腫瘤組織新生血管形成的作用，從而在腫瘤組織不斷生長過程中發(fā)揮重要作用[15]。大量實驗研究結果顯示，MMP-14在胃癌、子宮內膜癌等多種惡性腫瘤中表達出現(xiàn)明顯異常，與惡性腫瘤患者臨床特征具有一定相關性，參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但是關于MMP-14在結腸癌組織中表達意義的研究還相對較少[16-17]。本研究結果顯示，結腸癌組織中MMP-14表達相對較高，說明MMP-14在結腸癌中呈現(xiàn)異常高表達，為進一步探究MMP-14表達變化是否與結腸癌患者病理特征具有相關性，本研究對不同病理特征結腸癌患者MMP-14表達進行對比，結果顯示，腫瘤較大、Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化結腸癌組織中MMP-14表達相對較高，說明MMP-14的異常表達與結腸癌患者臨床病理特征密切相關，因此本研究推測MMP-14表達變化參與結腸癌的發(fā)生演進，可能成為結腸癌診斷、治療的重要靶點。

圖3 結腸癌組織中MMP-14、HSP27、miR-26a表達的相關性

Hsp家族在機體病理、生理變化過程中具有重要作用，參與大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究表示，HSP27為Hsp家族的重要成員，在細胞增殖、周期分布等生物學行為中發(fā)揮重要作用[18]。還有研究表示，HSP27在肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤中表達出現(xiàn)明顯異常，在惡性腫瘤發(fā)生演進過程中發(fā)揮重要作用[19-20]。本研究結果顯示，結腸癌組織中HSP27表達較高，并且腫瘤較大、Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化結腸癌組織中HSP27表達較高，說明HSP27在結腸癌組織中呈現(xiàn)異常高表達，并且其表達變化與患者臨床病理特征具有密切聯(lián)系，參與結腸癌的發(fā)生演進，將來有機會作為結腸癌診斷、治療、療效評價的靶點。

微小RNA(miRNA)具有抑癌、促癌等特性，在細胞增殖、凋亡、周期分布等生物學行為中至關重要。miR-26a為miRNA家族的重要組成成員，有研究顯示，miR-26a在胃癌、肺癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常表達[21-22]，但是關于miR-26a表達變化與結腸癌發(fā)生演進關系的研究還相對較少。本研究顯示，miR-26a在結腸癌組織中呈異常低表達，并且腫瘤較大、Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化結腸癌組織中miR-26a表達相對較低，說明miR-26a表達與結腸癌病理特征具有一定相關性，參與結腸癌的發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，結腸癌組織中MMP-14、HSP27呈正相關；MMP-14、miR-26a呈負相關；HSP27、miR-26a呈負相關。由此本研究推測，MMP-14、HSP27、miR-26a三者的表達變化是結腸癌早期檢查、診斷重要指標，且三者可能共同參與結腸癌的發(fā)生發(fā)展、演進。

綜上所述，MMP-14、HSP27、miR-26a在結腸癌組織中呈現(xiàn)異常表達，三者表達變化與結腸癌組織大小、病理分期、淋巴結轉移、組織分化等臨床病理特征密切相關，并且三者在結腸癌組織中的表達之間具有相關性，在結腸癌發(fā)生演進過程中共同發(fā)揮重要作用。本研究也有不足之處，選取病例數(shù)較少，且并未對MMP-14、HSP27、miR-26a表達變化與結腸癌患者預后相關性進行研究，下一步研究需增加樣本量，探究三者表達變化與結腸癌患者預后相關性。

利益相關聲明：本文無任何利益沖突。

作者貢獻說明：孔令梅：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫，論文修改；田蕾：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核；唐瑩：資料搜集整理；石燕燕：進行統(tǒng)計學分析。