陳如壽, 鐘佳芳, 石挺麗, 吳吉芳, 王婧婧, 顏禮完

三亞中心醫(yī)院(海南省第三人民醫(yī)院) 1檢驗(yàn)科， 2耳鼻喉科， 3醫(yī)院感染管理科(海南三亞 572000)

目前，海南的類鼻疽患者越來(lái)越多[1]，類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia. pseudomallei, BP)感染所致肺部感染及其他部位的慢性感染極易漏診，導(dǎo)致不能得到有效治療，而醫(yī)生能得到微生物室快速鑒定報(bào)告，患者就會(huì)得到快速診斷及精準(zhǔn)治療，還能給重癥感染者爭(zhēng)取最佳治愈機(jī)會(huì)和時(shí)間，并降低病死率、提高治愈率。而傳統(tǒng)的生化鑒定方法耗時(shí)較長(zhǎng)，鑒定準(zhǔn)確率低，易出現(xiàn)錯(cuò)誤鑒定結(jié)果[2]，常導(dǎo)致不能及時(shí)、快速準(zhǔn)確鑒定。而細(xì)菌基因測(cè)序設(shè)備貴、操作復(fù)雜、成本高，用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)技術(shù)可以解決BP的快速鑒定，只要建立菌株標(biāo)準(zhǔn)化圖譜，可實(shí)現(xiàn)快速鑒定[3]。但目前，國(guó)內(nèi)使用的MALDI-TOF MS因缺乏BP鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)而未能應(yīng)用于臨床。因此，本研究針對(duì)BP難鑒定的問(wèn)題，通過(guò)收集2019年1月至2020年12月臨床分離株構(gòu)建了適合海南本地區(qū)應(yīng)用的海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源 質(zhì)譜儀校準(zhǔn)使用的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌(ATCC 8739)由法國(guó)生物梅里埃公司提供。建庫(kù)及驗(yàn)證菌株：收集建庫(kù)菌10株及驗(yàn)證菌30株[4]共40株BP，均分離自2019年1月至2020年12月住院患者標(biāo)本(痰、膿性分泌物及血液等)。并經(jīng)過(guò)生化儀器(VITEK-2 Compact)鑒定篩選，再將全部菌株送給金域檢驗(yàn)公司經(jīng)16S基因測(cè)序[4]確認(rèn)，全部準(zhǔn)確鑒定為BP。其他伯克霍爾德菌20株也同樣經(jīng)16S基因測(cè)序[4]確認(rèn)。本研究課題(論文)已獲得三亞中心醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 哥倫比亞血平板及巧克力平板(廣州迪景)。革蘭陰性桿菌生化(GN)鑒定卡試劑盒、靶板、基質(zhì)液(α-氰基-4羥基肉桂酸)均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.2.2 儀器 VITEK-2 Compact，MALDI-TOF MS為法國(guó)生物梅里埃公司(VITEK MS v4.16)。16S基因測(cè)序分析儀器及試劑由金域檢驗(yàn)公司檢測(cè)提供。

1.3 方法

1.3.1 菌株保藏 建庫(kù)及驗(yàn)證使用的BP，先使用菌株保存管于-80℃冰箱凍存，備用。

1.3.2 菌株鑒定 將臨床收集得到40株BP，通過(guò)傳統(tǒng)革蘭染色、菌落形態(tài)特征、生化反應(yīng)鑒定(VITEK-2 Compact)、16S rRNA基因測(cè)序確定至種水平。菌株測(cè)序送金域檢驗(yàn)公司進(jìn)行。全部菌株經(jīng)準(zhǔn)確鑒定為BP，性狀穩(wěn)定，符合建庫(kù)要求。用于驗(yàn)證的其他伯克霍爾德菌20株：多噬伯克霍爾德菌(B.multivorans)13株、新洋蔥伯克霍爾德菌(B.cenocepacia)4株、洋蔥伯克霍爾德菌(B. cepacia)2株和唐菖蒲伯克霍爾德菌(B.gladioli)1株，經(jīng)基因測(cè)序鑒定符合驗(yàn)證要求。

1.3.3 菌株前處理方法 將10株BP用血平板置35℃、24 h培養(yǎng)生長(zhǎng)的菌苔，用接種環(huán)挑取純的、單個(gè)的、適量菌苔，輕輕涂于靶板上。也可先將血平板35℃、24 h培養(yǎng)的大腸埃希菌(ATCC8739)涂于靶板質(zhì)控孔當(dāng)中。

1.3.4 菌株準(zhǔn)備 建庫(kù)使用菌株均采用新鮮培養(yǎng)24～48 h[4-5]的單個(gè)菌落。將10株BP先進(jìn)行復(fù)蘇，分別接種于2個(gè)血平板和2個(gè)巧克力平板上。將接種好的1個(gè)血平板置35℃恒溫箱培養(yǎng)和1個(gè)巧克力平板置5% CO2、35℃恒溫箱培養(yǎng)[4]；將1個(gè)血平板和1個(gè)巧克力平板置25℃培養(yǎng)恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)[4]。均培養(yǎng)24 h至肉眼可見(jiàn)菌落時(shí)，取出進(jìn)行第1次涂靶板打點(diǎn)采集圖譜[4]。次日，將上述培養(yǎng)至48 h的血平板和巧克力平板菌株又取出，再取菌苔進(jìn)行第2次涂靶板、打點(diǎn)、采集圖譜[4]。并將血平板35℃、24 h培養(yǎng)的大腸埃希菌涂于靶板質(zhì)控孔當(dāng)中用于質(zhì)量控制[5]。驗(yàn)證使用菌株：用經(jīng)血平板35℃、24 h培養(yǎng)得到的單個(gè)菌落，進(jìn)行驗(yàn)證使用[4]。

1.3.5 靶板點(diǎn)樣的準(zhǔn)備 從培養(yǎng)基上挑取合適的菌量轉(zhuǎn)移至靶板上相應(yīng)靶點(diǎn)位置，用一次性接種環(huán)輕輕涂抹，使菌苔在靶點(diǎn)上形成一層均勻薄膜，覆蓋靶點(diǎn)整個(gè)區(qū)域。先將大腸埃希菌涂點(diǎn)在靶板相應(yīng)孔位，再進(jìn)行其他菌株的涂點(diǎn)。涂點(diǎn)是要均勻，菌量適量。待涂點(diǎn)細(xì)菌自然晾干后，立即滴加1 μL基質(zhì)液，再等待自然晾干。靶板點(diǎn)樣準(zhǔn)備完成，立即用VITEK MS進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)[5]。將10株BP經(jīng)35℃和25℃不同溫度培養(yǎng)的血平板和巧克力平板的菌苔平行涂3個(gè)靶點(diǎn)[4]，共涂了120個(gè)靶點(diǎn)。次日，繼續(xù)將以上培養(yǎng)48 h的平板菌苔，重復(fù)以上操作進(jìn)行涂點(diǎn)，再次獲得120個(gè)靶點(diǎn)。

1.3.6 譜圖采集 涂好及加基質(zhì)液的靶板，自然晾干后，及時(shí)上機(jī)檢測(cè)。質(zhì)譜儀器經(jīng)自動(dòng)校準(zhǔn)合格后，自動(dòng)采集圖譜，設(shè)置激光照射次數(shù)為100次，相對(duì)分子量在2 000～20 000 Da。將涂好的每個(gè)靶點(diǎn)采集1遍；2次采集打點(diǎn)一共獲得了240張合格的圖譜。

1.3.7 建立超級(jí)圖譜(SuperSpectrum)的篩選 按以下參數(shù)選擇建立超級(jí)圖譜：(1)菌種間重復(fù)(duplicates)質(zhì)譜的相似性要>70.0%。(2)相同菌種質(zhì)譜的相似性要>65.0%。(3)峰的數(shù)量(data count)要求在80～230之間，<80不能用于建立超級(jí)圖譜。(4)相同質(zhì)譜數(shù)量要求在50～70之間。將采集得到的240張圖譜，按以上要求選擇得到了高質(zhì)量合格圖譜109張，得到峰的數(shù)量為535個(gè)，可用于創(chuàng)建超級(jí)圖譜。再選擇菌株共有的峰(consensus spectra)即最特征性的峰：即每種質(zhì)量峰至少80%的菌株都擁有，一般保留35～49個(gè)峰[4]。而本研究從535個(gè)不同質(zhì)量的峰中經(jīng)過(guò)選擇，最終保留34個(gè)特征性峰，將特征峰與數(shù)據(jù)庫(kù)中所有細(xì)菌質(zhì)譜進(jìn)行比較，其比較結(jié)果符合建庫(kù)條件。

1.3.8 建立超級(jí)圖譜(SuperSpectrum)庫(kù) 創(chuàng)建超級(jí)圖譜要符合2個(gè)條件：(1)特征峰的權(quán)重之和≤1 400。而本研究結(jié)果為1 394，滿足該條件。(2)非建庫(kù)菌(non-targeted speciec)匹配數(shù)權(quán)重之和≤600。而本研究結(jié)果為272，也符合該條件。所以，可保存采集的109張圖譜生成超級(jí)圖譜，并輸入“hainanleibiju”英文名稱并建立新的文件數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“伯克霍爾德菌”節(jié)點(diǎn)，并激活保存。

1.3.9 數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定驗(yàn)證 用30株經(jīng)16S基因測(cè)序?yàn)锽P的收集菌株及屬內(nèi)其他菌種20株[6]。用哥倫比亞血平板經(jīng)35℃、24 h培養(yǎng)，取單個(gè)純菌落進(jìn)行涂靶，晾干后加1 μL基質(zhì)液，再次晾干。使用VITEK MS采集圖譜，用自建庫(kù)和VITEK MS v4.16(RUO)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證鑒定，記錄鑒定結(jié)果和可信度(%)并進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，率的比較采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自建數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定準(zhǔn)確率的驗(yàn)證 結(jié)果顯示，本自建庫(kù)與VITEK MS v4.16(RUO)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定結(jié)果比較，用于驗(yàn)證的30株BP自建庫(kù)鑒定結(jié)果均為“hainanleibiju”(圖譜見(jiàn)圖1)，鑒定可信度為：29株99.9%、1株為98.6%；鑒定準(zhǔn)確率為100.0%。VITEK MS v4.16(RUO)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定結(jié)果的可信度： 16株為BP可信度在75.0%～87.5%之間，1株BP為95.0%，13株可信度為0.0%(無(wú)鑒定結(jié)果)；鑒定準(zhǔn)確率為56.67%。結(jié)果為自建庫(kù)鑒定準(zhǔn)確率為100.0%(30/30)，高于VITEK MS v 4.16(RUO)數(shù)據(jù)庫(kù)的56.67%(17/30)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=11.08，P<0.005)。見(jiàn)表1。

注：峰圖的橫坐標(biāo)是指Mass(峰的質(zhì)量大小)，檢測(cè)范圍是2 000～20 000 Da；縱坐標(biāo)是指Intensity(峰的強(qiáng)度)，范圍在0～100%之間。上述峰圖可以得知存在2 697、4 366、4 451、4 769、5 612、6 316、7 274、9 067、9 230等質(zhì)量峰

表1 自建庫(kù)與VITEK MS v4.16數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定結(jié)果比較

2.2 同屬菌種驗(yàn)證 用自建庫(kù)進(jìn)行屬內(nèi)菌種20株進(jìn)行鑒定驗(yàn)證，菌株經(jīng)VITEK MS與基因測(cè)序鑒定結(jié)果[6]一致相同。驗(yàn)證菌株為：多噬伯克霍爾德菌13株、新洋蔥伯克霍爾德菌4株、洋蔥伯克霍爾德菌2株和唐菖蒲伯克霍爾德菌1株。經(jīng)自建庫(kù)鑒定證實(shí)所有菌株鑒定結(jié)果均沒(méi)有錯(cuò)誤鑒定為“hainanleibiju”。本研究自建庫(kù)可以用于準(zhǔn)確鑒定“海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌”。

3 討論

近年來(lái)，類鼻疽敗血癥在海南感染病例呈逐年上升趨勢(shì)[1，7]，BP引起敗血癥急性感染在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致患者多臟器衰竭、休克和死亡，如不及時(shí)治療導(dǎo)致病死率高達(dá)25.0%～70.0%[1，7]，已成為海南重要的人畜共患病原菌。其引起的感染表現(xiàn)為“多樣性”，除了常見(jiàn)肺部感染和敗血癥，還引起：肝膿腫、關(guān)節(jié)炎、淋巴結(jié)炎、泌尿道感染、前胸壁膿腫[8]和腮腺炎[9]等。引起的急性重癥或者慢性反復(fù)感染極易誤診和漏診[7，9-10]，值得醫(yī)生關(guān)注。BP感染不同部位治療方案和用藥周期又不同[8]，故微生物室能快速、準(zhǔn)確鑒定BP，可幫助醫(yī)生快速精準(zhǔn)診斷和治療，對(duì)降低重癥病死率有重要臨床意義。而MALDI-TOF MS是目前臨床上能鑒定BP的最快速方法[3]。

本數(shù)據(jù)庫(kù)基于VITEK MS設(shè)備構(gòu)建，因國(guó)內(nèi)MALDI-TOF MS儀器數(shù)據(jù)庫(kù)不能鑒定BP，而類鼻疽病確是海南地區(qū)常見(jiàn)的嚴(yán)重感染性疾病，故需要增加符合區(qū)域特點(diǎn)的菌種數(shù)據(jù)庫(kù)。

臨床菌株驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，本研究自建庫(kù)與VITEK MS v4.16(RUO)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定結(jié)果比較，自建庫(kù)鑒定準(zhǔn)確率100%明顯比VITEK MS v4.16(RUO)數(shù)據(jù)庫(kù)準(zhǔn)確率56.67%要高。使用10株本地區(qū)臨床相關(guān)模式菌株基于MALDI-TOF MS建立了海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌數(shù)據(jù)庫(kù)并用30株臨床模式株BP及20株屬內(nèi)菌株進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，均能將這30株菌準(zhǔn)確鑒定為“hainanleibiju”；也不會(huì)將屬內(nèi)的菌種鑒定為“hainanleibiju”。本次研究沒(méi)有把鼻疽伯克霍爾德菌(B.mallei)加入海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌超級(jí)圖譜中比較，主要考慮為鼻疽伯克霍爾德菌引起的臨床感染更為罕見(jiàn)，并且臨床意義有限。本研究顯示，自建庫(kù)能準(zhǔn)確鑒定海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌，說(shuō)明本自建庫(kù)質(zhì)量達(dá)到較高水平。

本自建庫(kù)對(duì)BP鑒定可信度較高為99.9%，而VITEK MS v4.16(RUO)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定可信度偏低，只有1株可信度較高為95.0%，16株可信度偏低在75.0%～87.5%之間，有13株不能鑒定出來(lái)。這可能與自建庫(kù)使用的菌株均為海南地區(qū)臨床感染致病性模式株有關(guān)，當(dāng)?shù)谺P的蛋白圖譜特征峰表達(dá)更加明顯和接近，更有利于蛋白圖譜結(jié)果比對(duì)。本自建數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌鑒定，具有良好的臨床應(yīng)用前景。同時(shí)也將需要更多的菌株量來(lái)驗(yàn)證和評(píng)價(jià)。

綜上所述，本自建庫(kù)能夠準(zhǔn)確區(qū)分海南病原類鼻疽伯克霍爾德菌，具有高特異度、高敏感度、操作簡(jiǎn)便、鑒定快速等一系列優(yōu)點(diǎn)，能夠快速報(bào)告給醫(yī)生進(jìn)行精準(zhǔn)診斷及治療，可降低感染病死率，符合在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：研究設(shè)計(jì)和論文寫作為陳如壽，研究方案執(zhí)行與實(shí)施為鐘佳芳和王婧婧，質(zhì)譜儀菌株數(shù)據(jù)庫(kù)的建庫(kù)完成為陳如壽和王婧婧，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及論文修改為鐘佳芳和石挺麗，查文獻(xiàn)和病例資料的整理為鐘佳芳和吳吉芳。收集菌株和菌種的保存為顏禮完。