周林甫, 萬(wàn)群, 趙鋼, 張紅鴨

1西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院(陜西西安 710068)； 2空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(陜西西安 710032)； 3深圳大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(廣東深圳 518055)

結(jié)核病仍然是全世界最致命的感染性疾病之一，被稱(chēng)為繼艾滋病之后的人類(lèi)第二大殺手，系結(jié)核分枝桿菌 (mycobacterium tuberculosis，M.tb) 感染機(jī)體所致，多數(shù)以呼吸系統(tǒng)受累為主，而結(jié)核性腦膜炎 (tuberculous meningitis, TBM) 則是M.tb感染的最嚴(yán)重形式[1]，約占所有結(jié)核病1%～5%[2]。盡管給予積極抗結(jié)核治療，仍有超過(guò)半數(shù)患者最終死亡或遺留嚴(yán)重后遺癥[3]。因腦脊液 (cerebrospinal fluid, CSF) 中M.tb涂片鏡檢、培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測(cè)方法敏感性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力等不足，使TBM早期診斷仍然面臨著很多挑戰(zhàn)[4]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，CSF中M.tb核酸檢測(cè)是當(dāng)前TBM早期診斷方法研究的熱點(diǎn)。然而，由于TBM患者CSF中含有痕量M.tb，并且在標(biāo)本處理、核酸提取及純化等過(guò)程中可能造成核酸產(chǎn)量和質(zhì)量進(jìn)一步下降而影響核酸檢測(cè)效果[5]。即使是近年來(lái)興起的下一代測(cè)序技術(shù) (next-generation sequencing, NGS) 與芯片技術(shù)等高通量分析方法也往往受限于樣品量過(guò)少而無(wú)法更好地發(fā)揮作用[6]。因此，如何獲得足量的病原體基因組DNA是M.tb核酸檢測(cè)是能否成功的關(guān)鍵。多重置換擴(kuò)增 (multiple displacement amplification, MDA) 技術(shù)是基于噬菌體29 (Phi 29) 高保真DNA聚合酶等溫PCR反應(yīng)的全基因組擴(kuò)增 (whole genome amplification, WGA) 方法，它可以高保真地將微小數(shù)量的DNA成指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，并可以達(dá)到最佳基因組覆蓋率和最低的擴(kuò)增偏差[7-8]。近年來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物基因檢測(cè)、胚胎疾病診斷、臨床標(biāo)本病原體鑒定、法醫(yī)學(xué)鑒定及環(huán)境樣本微生物多樣性的相關(guān)研究中[9-12]。無(wú)論是面對(duì)痕量生物標(biāo)本還是殘留組織，甚至是單細(xì)胞，該方法均可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA擴(kuò)增富集，進(jìn)而為之后的基因組研究提供充足的DNA模板[9]。然而，有關(guān)應(yīng)用MDA技術(shù)檢測(cè)CSF中M.tb核酸的研究卻鮮有報(bào)道。因此，我們于2015年12月至2017年4月開(kāi)展本研究,基于MDA-PCR技術(shù)擬建立對(duì)CSF中痕量M.tb核酸檢測(cè)的新方法，并通過(guò)對(duì)模擬TBM患者CSF標(biāo)本檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證該方法的可行性及可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株M.tb標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Ra (ATCC25177)，綠膿桿菌 (P.aeruginosa) 標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC27853)，金黃色葡萄球菌 (S.aureus) 標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC25923)，大腸埃希菌 (E.coli) 標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC25922)，肺炎克雷伯菌 (K.pneumoniae) 標(biāo)準(zhǔn)菌株 (ATCC 35657)，鮑曼不動(dòng)桿菌 (A.baumannii) 標(biāo)準(zhǔn)菌株 (BAA-74)，均由空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院檢驗(yàn)科保存?？ń槊?(BCG) 購(gòu)自上海市生物制品研究所。

1.1.2 質(zhì)粒與細(xì)胞系 大腸桿菌 (E.coli) 細(xì)胞由本室保存，pGEM-T載體購(gòu)于Promega公司。

1.1.3 主要試劑與儀器 普通PCR儀 (德國(guó)Eppendof公司)；凝膠電泳儀 (美國(guó)CLP公司)；核酸蛋白檢測(cè)儀 (德國(guó)Eppendof公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱 (博泰儀器公司(上海))；生物電泳成像分析系統(tǒng) (上海復(fù)日科技公司)；BACT-MGIT 960全自動(dòng)培養(yǎng)儀 (美國(guó)BD公司)；QIAamp DNA Mini Kit基因組DNA提取試劑盒 (德國(guó)QIAGEN公司)；瓊脂糖凝膠膠回收純化試劑盒 (美國(guó)OMEGA公司)；Premix TaqTM(大連TaKaRa公司)；溶菌酶 (美國(guó)Sigma公司)；質(zhì)粒提取試劑盒 (美國(guó)OMEGA公司)；REPLI-g全基因組擴(kuò)增試劑盒 (德國(guó)QIAGEN公司)。

本研究已經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò) (KY20163367-1號(hào))。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 運(yùn)用Oligo 6.5軟件對(duì)從GenBank中獲取的M.tb復(fù)合群的特異性插入序列 (IS6110和IS1081) 進(jìn)行分析比對(duì)并設(shè)計(jì)特異性引物 (表1)，交由上海生工進(jìn)行合成。

表1 引物序列

1.2.2 BCG基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增 BCG基因組DNA的提取按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系 (25 μL) 組成如下: DNA模板 1 μL, 上下游引物各1 μL (10 μmol/μL), Premix TaqTM12.5 μL, 加無(wú)菌去離子水補(bǔ)至25 μL。 PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性10 min, 然后95℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 60 s, 共35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 首先按照試劑盒說(shuō)明書(shū)回收、純化BCG基因組DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將回收產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，制備感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化，最后將重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選與鑒定。

1.2.4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備 根據(jù)Plasmid Mini kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒DNA，制備系列稀釋的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。將新提取的質(zhì)粒DNA按照以下公式進(jìn)行定量：copies/μL = (6.02×1023copies/mol)×(con ng/μL) ×10-9/ (MW g/mol)，計(jì)算質(zhì)粒DNA的總拷貝數(shù)，然后將其系列稀釋至105、 104、 103、 500、 250、 125、 75、 25、 10 copies /μL。

1.2.5 ST-PCR及MDA-PCR擴(kuò)增反應(yīng) 以質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板分別進(jìn)行ST-PCR及MDA-PCR檢測(cè)，分析兩種方法對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)下限。根據(jù)REPLI-g試劑盒 (QIAGEN)說(shuō)明，應(yīng)用Phi 29 DNA聚合酶 (New England BioLabs) 對(duì)系列稀釋的質(zhì)粒DNA樣品進(jìn)行MDA反應(yīng)，隨后以MDA擴(kuò)增產(chǎn)物(MDA-Products) 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后將MDA-Products經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定分析。MDA-PCR反應(yīng)體系：MDA-products 1 μL, 上下游引物各1 μL (10 μmol/μL), Premix TaqTM12.5 μL, 加無(wú)菌去離子水補(bǔ)至25 μL。 PCR反應(yīng)條件: 95℃ 預(yù)變性10 min, 然后 95℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 60 s, 共35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10 min, 4℃保存。

1.2.6 MDA-PCR的敏感度及特異度分析 先將新鮮制備的系列稀釋的質(zhì)粒DNA進(jìn)行MDA擴(kuò)增，然后以MDA-Product為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評(píng)估MDA-PCR方法對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)敏感度。以綜合性醫(yī)院患者感染常見(jiàn)細(xì)菌 (P.aeruginosa,S.aureus,E.coli,K.pneumoniae,A.baumannii) 標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板分別進(jìn)行MDA-PCR檢測(cè)，觀(guān)察是否有非特異性反應(yīng)發(fā)生，評(píng)估MDA-PCR檢測(cè)方法的特異度。

1.2.7 MDA-PCR對(duì)模擬TBM患者CSF標(biāo)本的檢測(cè) 首先將Bactec MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)的M.tbH37Ra按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄟM(jìn)行計(jì)數(shù)，以0.5麥?zhǔn)蠁挝坏腗.tb菌懸液為原液，用生理鹽水將其10倍系列稀釋成以下陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品：107、 106、 105、 104、 103、 102、 101、 1 cfu/mL，85℃水浴30 min滅活，1 mL/管分裝，于-20℃保存。然后將制備的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品分別與非感染患者CSF混勻作為模擬TBM檢測(cè)標(biāo)本。最后以CSF標(biāo)本中提取的M.tbH37Ra基因組DNA為模板，分別進(jìn)行ST-PCR及MDA-PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 引物驗(yàn)證及重組質(zhì)粒DNA鑒定 針對(duì)IS6110和IS1081基因序列設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物分別對(duì)BCG基因組DNA擴(kuò)增出245 bp、310 bp的目的條帶 (圖1)。另外，分別以?xún)煞N重組質(zhì)粒DNA為模板，均可實(shí)現(xiàn)對(duì)IS6110和IS1081基因的有效擴(kuò)增，無(wú)非特異性反應(yīng)發(fā)生。PCR回收產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示兩種重組質(zhì)粒DNA (6110和1081) 的擴(kuò)增序列均與預(yù)期結(jié)果一致。

注：M: DNA marker DL500；1、3泳道：BCG基因組DNA模板；2、4泳道：滅菌去離子水(陰性對(duì)照)

2.2 MDA-PCR方法的檢測(cè)敏感度分析 采用IS6110引物時(shí)ST-PCR方法對(duì)質(zhì)粒DNA樣品的最低檢測(cè)下限為103拷貝，而MDA-PCR方法對(duì)質(zhì)粒DNA樣品的最低檢測(cè)下限為10拷貝，后者的檢測(cè)敏感度較前者提高了100倍。采用IS1081引物時(shí)，ST-PCR方法與MDA-PCR的最低檢測(cè)下限分別為103、25拷貝。見(jiàn)表2。

表2 ST-PCR及MDA-PCR對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果

2.3 MDA-PCR方法的特異度分析 分別采用IS6110和IS1081引物時(shí)，MDA-PCR方法對(duì)M.tbH37Ra基因組DNA擴(kuò)增出目的條帶，而對(duì)其他5種細(xì)菌基因組DNA均未擴(kuò)增出目的條帶，并且無(wú)非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。見(jiàn)表3。

表3 MDA-PCR方法對(duì)細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果

2.4 MDA-PCR方法對(duì)模擬TBM患者CSF標(biāo)本的檢測(cè) 采用IS6110引物時(shí)，ST-PCR (圖2-A) 對(duì)模擬標(biāo)本中M.tb的最低檢測(cè)下限為104CFU，而MDA-PCR方法 (圖2-B) 對(duì)模擬標(biāo)本中M.tb的最低檢測(cè)下限為1 CFU。采用IS1081引物時(shí)，ST-PCR (圖3-A) 對(duì)模擬標(biāo)本中M.tb的最低檢測(cè)下限為105CFU，而MDA-PCR方法對(duì)模擬標(biāo)本中M.tb的最低檢測(cè)下限為1 CFU (圖3-B)。

3 討論

本研究旨在應(yīng)用MDA-PCR技術(shù)建立檢測(cè)CSF中痕量M.tb核酸的新方法，為達(dá)到對(duì)整個(gè)M.tb復(fù)合群的覆蓋提高檢出率，選擇將IS6110和IS1081序列均作為目的檢測(cè)基因。IS6110序列是M.tb基因組中一個(gè)多拷貝基因，在M.tb復(fù)合群基因組可表達(dá)6～20個(gè)拷貝，擴(kuò)增效率及敏感性高，但在某些臨床分離株基因組中可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)缺失[13]。Collins等[14]在牛型M.tb基因組中發(fā)現(xiàn)了IS1081序列，該序列可在所有M.tb復(fù)合群基因組中穩(wěn)定表達(dá)5～7個(gè)拷貝。Boyle等[15]以IS6110和IS1081為檢測(cè)基因應(yīng)用重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA) 技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的檢測(cè)。國(guó)內(nèi)學(xué)者李自慧等[16]也曾建立基于IS6110和IS1081序列的微滴數(shù)字PCR反應(yīng)體系用于肺結(jié)核患者痰和血漿標(biāo)本的篩查，均達(dá)到了良好結(jié)果。

注：A：ST-PCR擴(kuò)增IS6110基因，1～6號(hào)泳道：依次為105、104、103、102、101、1 cfu/mL 的H37Ra基因組DNA；7號(hào)泳道：無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照；B：MDA-PCR擴(kuò)增IS6110基因，1～6號(hào)泳道：依次為105、104、103、102、101、1 cfu/mL 的H37Ra基因組DNA的MDA擴(kuò)增產(chǎn)物；7號(hào)泳道：無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照

注：A:ST-PCR擴(kuò)增IS1081基因，1～6號(hào)泳道：依次為105、104、103、102、101、1 cfu/mL 的H37Ra基因組DNA；7號(hào)泳道：無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照；B:MDA-PCR擴(kuò)增IS1081基因，1～6號(hào)泳道：依次為105、104、103、102、101、1 cfu/mL 的H37Ra基因組DNA的MDA擴(kuò)增產(chǎn)物；7號(hào)泳道：無(wú)菌去離子水為陰性對(duì)照

在實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)包含兩種目的基因的新鮮質(zhì)粒DNA樣品先進(jìn)行了MDA反應(yīng)，隨后再通過(guò)MDA-PCR檢測(cè)分析該方法的檢測(cè)敏感度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MDA-PCR方法對(duì)MDA預(yù)處理后質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品IS6110、IS1081基因的檢測(cè)敏感度分別是ST-PCR的100、40倍。我們猜測(cè)，通過(guò)MDA反應(yīng)后質(zhì)粒DNA模板數(shù)量得到大量增加，然后再以MDA擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行二次PCR可明顯提高該方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA的檢測(cè)范圍。Dean等[17]曾報(bào)道，使用隨機(jī)引物及Phi 29高保真DNA聚合酶可以使來(lái)自單個(gè)菌落或斑塊的M13或質(zhì)粒DNA模板在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增10 000倍。另外，為驗(yàn)證MDA-PCR方法的特異性，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中分別以M.tb標(biāo)準(zhǔn)株和5種其他細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA為對(duì)照進(jìn)行了MDA-PCR檢測(cè)。分別采用IS6110和IS1081引物時(shí)，該方法僅對(duì)M.tbH37Ra的基因組DNA擴(kuò)增出目的條帶，而對(duì)其他5種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)株的基因組DNA檢測(cè)陰性，并且無(wú)非特異性反應(yīng)發(fā)生。結(jié)果證實(shí)MDA-PCR方法具有較高的檢測(cè)特異性。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，MDA反應(yīng)依靠隨機(jī)引物引發(fā)聚合，導(dǎo)致了DNA擴(kuò)增，同時(shí)可能會(huì)污染DNA[18]。幸運(yùn)的是，本研究中并未發(fā)現(xiàn)MDA-PCR在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。Gonzalez等[19]應(yīng)用MDA技術(shù)富集環(huán)境樣本的基因組DNA模板，通過(guò)MDA-PCR可將基因檢測(cè)敏感度提高10倍。國(guó)內(nèi)學(xué)者陳玲等[20]將MDA技術(shù)應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)微量DNA的檢測(cè)研究，結(jié)果顯示應(yīng)用該方法可將模板DNA總量增加104～106倍。

為進(jìn)一步探索MDA-PCR方法檢測(cè)CSF中M.tb的可行性，我們對(duì)系列稀釋的模擬TBM患者CSF標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果表明，MDA-PCR方法對(duì)模擬TBM患者CSF標(biāo)本中M.tb的最低檢測(cè)下限可達(dá)到1個(gè)CFU，該方法對(duì)CSF中M.tb的檢測(cè)敏感度比ST-PCR高104～105倍，并且具有很好的重復(fù)性和特異性。然而，值得注意的是，雖然MDA-PCR方法對(duì)模擬TBM患者CSF標(biāo)本IS6110和IS1081基因的檢測(cè)敏感度一致，但是ST-PCR方法檢測(cè)2個(gè)基因的敏感度卻存在差異，猜測(cè)這可能與2種基因在M.tb基因組中的表達(dá)量不一致有關(guān)。

Wu等[21]應(yīng)用MDA-PCR對(duì)200份痰標(biāo)本進(jìn)行了IS6110基因的檢測(cè)，該方法診斷肺結(jié)核的敏感性及特異性較普通PCR提高了15%～20%。與之比較，本研究針對(duì)CSF標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)IS6110和IS1081基因?qū)⒂兄谔岣邔?duì)M.tb的檢出率，可盡可能避免假陰性結(jié)果而導(dǎo)致漏診。

本研究雖然基本解決了如何富集CSF中痕量M.tb核酸的問(wèn)題，并初步建立了MDA-PCR檢測(cè)CSF中M.tb核酸的新方法，但是對(duì)臨床確診或疑似TBM患者標(biāo)本未進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，以及與傳統(tǒng)檢測(cè)方法比較分析。因此，在下一步研究中，我們將通過(guò)設(shè)計(jì)臨床試驗(yàn)，納入大樣本量患者，進(jìn)一步探索和評(píng)估該方法在TBM早期診斷中的價(jià)值。

綜上所述，基于MDA技術(shù)建立的檢測(cè)CSF中痕量M.tb核酸的新方法有助于解決TBM核酸診斷面臨的CSF中M.tb數(shù)量或核酸不足的難題，該方法可能提高對(duì)TBM患者CSF標(biāo)本中M.tb的檢測(cè)效率，為T(mén)BM早期診斷提供了一種新的研究策略，具有一定的應(yīng)用前景。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：周林甫負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)及撰寫(xiě)論文；萬(wàn)群負(fù)責(zé)分析數(shù)據(jù)、撰寫(xiě)論文。趙鋼、張紅鴨負(fù)責(zé)指導(dǎo)及論文修改。