南曉晶, 楊舒煒

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1檢驗(yàn)科， 2內(nèi)分泌科(浙江杭州 310009)

自身免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis，AIT)是器官特異性自身免疫疾病，在臨床上較為常見(jiàn)，臨床主要表現(xiàn)為咽部不適、吞咽困難、頸部壓縮等癥狀，且甲狀腺淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)程度不同可導(dǎo)致甲狀腺功能喪失與萎縮，且該病的發(fā)病率受多種因素的影響逐年增加，故尋找該病有效的治療方式相當(dāng)重要[1-2]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(experimental autoimmune thyroiditis，EAT)的動(dòng)物模型病理基礎(chǔ)與臨床表現(xiàn)與人類AIT相同，主要用于AIT研究[3-4]。大黃素為蒽醌類衍生物，是中藥大黃莖與干燥根中的有效成分，具有免疫抑制的作用。含有pyrin結(jié)構(gòu)域的蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)在疾病的發(fā)生中具有重要作用，NLRP3/Caspase-1可通過(guò)破壞環(huán)境刺激物、晶體物質(zhì)與病原微生物所激活，參與AIT的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體免疫，有研究顯示，NLRP3通路的激活與AIT相關(guān)?；谏鲜霰尘?，積極尋找此病的發(fā)生機(jī)制對(duì)臨床上治療的研究具有重要的意義。2020年6—12月，本研究分析大黃素調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路對(duì)EAT大鼠的免疫調(diào)節(jié)作用，以明確大黃素與EAT大鼠的關(guān)系，為臨床上AIT的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級(jí)6～8周齡SD大鼠60只，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014，體重(221.05±22.61)g，在相對(duì)濕度為29%～35%、溫度為21～24℃下飼養(yǎng)1周，每天光照24 h，明暗周期為12 h。本實(shí)驗(yàn)操作均嚴(yán)格參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，且獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意(ZSLL-KY-2021-036-01)。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模 60只中選取12只作為對(duì)照組，其余48只大鼠參照侯麗萍等[6]報(bào)道的EAT的建立方法構(gòu)建模型，將10 mg pTG(美國(guó)Sigma公司)與5 mL PBS進(jìn)行融合，并與5 mL CFA(美國(guó)Sigma公司)進(jìn)行混合，乳化后制作抗原含量為1 g/L的pTG乳化劑，將乳化劑按照1 mL/kg體重注射于對(duì)48只大鼠足墊及背部皮下，每周注射1次，連續(xù)注射2周，此為初次免疫，2周后為加強(qiáng)免疫，將pTG與IFA(美國(guó)Sigma公司)混合、乳化制成乳化劑備用，按照1 mL/kg體重注射于大鼠皮下多點(diǎn)，每周注射1次，連續(xù)注射4周，大鼠造模期間注意避光，飲用0.05%碘化鉀水。加強(qiáng)免疫后2周，取1只建模大鼠的眶靜脈血，檢測(cè)TPOAb水平，TPOAb滴度≥60 IU/mL為建模成功，建模成功后大鼠死亡8只，將剩余40只大鼠隨機(jī)分為模型組、大黃素低劑量組、大黃素中劑量組、大黃素高劑量組各10只。

1.2.2 給藥干預(yù) 建模成功后，開(kāi)始給藥。對(duì)照組模型組與給予5 mg/kg生理鹽水進(jìn)行灌胃，大黃素低劑量組給予生理鹽水+15 mg/kg大黃素，大黃素中劑量組給予生理鹽水+75 mg/kg大黃素，大黃素高劑量組給予生理鹽水+150 mg/kg大黃素。連續(xù)灌胃4周。

1.3 指標(biāo)觀察

1.3.1 樣本采集 采集大鼠眶靜脈血4 mL，以離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，分離大鼠頸部皮膚及肌肉層，顯露出甲狀腺軟骨側(cè)后方兩葉甲狀腺，取出氣管與甲狀腺，使用冷生理鹽水進(jìn)行沖洗，并吸干。

1.3.2 病理組織學(xué)觀察 獲取大鼠甲狀腺組織進(jìn)行切片、脫蠟、脫水操作，并使用HE進(jìn)行染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察其改變。

1.3.3 甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)檢測(cè) 在用藥結(jié)束后抽取眶靜脈血4 mL，以離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80℃保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè) TgAb、IL-4、IFN-γ水平，TgAb、IL-4、IFN-γELISA試劑盒由滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司提供。貨號(hào)為SND-R423。

1.3.4 外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+檢測(cè) 抽取各組大鼠眶靜脈血4 mL，制作單細(xì)胞懸液，加入抗體與溶血素反應(yīng)10 min，以離心半徑5 cm、3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，并加入PBS進(jìn)行清洗，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+CD4+、CD3+CD8+變化。

1.3.5 NLRP3/Caspase-1通路蛋白檢測(cè) 采集大鼠甲狀腺細(xì)胞，冰上溶解25 min，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)NLRP3、ASC、Caspase-1等蛋白含量，提取等量蛋白質(zhì)，然后100℃變性5 min，使用凝膠電泳分離，4℃條件下加入一抗孵育過(guò)夜，洗滌15 min×3次，加入稀釋好的二抗，孵育2 h，洗滌15 min×3次，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 對(duì)照組甲狀腺濾泡大小均勻一致，濾泡細(xì)胞呈單層立方形或高柱形。模型組甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞變扁，間質(zhì)減少，明顯淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。大黃素組甲狀腺濾泡大小不一，少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

注：A:對(duì)照組; B:模型組; C:大黃素低劑量組; D:大黃素中劑量組; E:大黃素高劑量組

2.2 各組TgAb、IL-4、IFN-γ對(duì)比 與對(duì)照組相比，其他4組TgAb、IL-4、IFN-γ水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，大黃素低、中、高劑量組TgAb、IL-4、IFN-γ水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而大黃素中劑量組TgAb、IL-4、IFN-γ水平低于大黃素低、高劑量組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組TgAb、IL-4、IFN-γ對(duì)比

2.3 各組外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+對(duì)比 與對(duì)照組相比，其他4組CD3+CD4+、CD3+CD8+水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，大黃素低、中、高劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而大黃素中劑量組CD3+CD4+、CD3+CD8+水平低于大黃素低、高劑量組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 各組NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)量對(duì)比 與對(duì)照組相比，其他4組NLRP3、ASC、Caspase-1水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，大黃素低、中、高劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大黃素中劑量組NLRP3、ASC、Caspase-1水平低于大黃素低、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

表2 外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+對(duì)比

表3 各組NLRP3/Caspase-1信號(hào)通路蛋白表達(dá)量對(duì)比

圖2 NLRP3/Caspase-1通路蛋白WB圖

3 討論

甲狀腺由濾泡上皮細(xì)胞組成，為人體內(nèi)分泌器官，可調(diào)節(jié)機(jī)體平衡與合成甲狀腺激素[7-8]。AIT是由機(jī)體異常識(shí)別自身抗原使淋巴細(xì)胞侵入甲狀腺組織，使其受損，AIT的發(fā)生多受環(huán)境與遺傳影響，發(fā)病機(jī)制不明確，臨床上AIT的治療多使用中醫(yī)藥、局部免疫調(diào)節(jié)及硒，但其毒性、不良反應(yīng)與復(fù)發(fā)可抑制AIT的治療，故臨床上尋找治療此病的藥物十分重要[9-10]。

大黃素又稱朱砂蓮甲素，從大黃根莖中提取[11]。研究顯示[12-13]，大黃素具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂與調(diào)節(jié)免疫的作用，其免疫保護(hù)作用通過(guò)調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞之間的平衡發(fā)揮作用，大黃素通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟與淋巴結(jié)的活化調(diào)節(jié)免疫抑制。本研究顯示，不同劑量大黃素可降低EAT大鼠中的表達(dá)水平，表明大黃素對(duì)EAT大鼠具有保護(hù)作用。

CD4+CD8+細(xì)胞為人體重要的免疫細(xì)胞，CD4+主要表達(dá)于輔助T細(xì)胞，是Th細(xì)胞TCR識(shí)別的抗原共同體，參與Th細(xì)胞TCR識(shí)別的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。CD8+表達(dá)于細(xì)胞毒性T細(xì)胞，通過(guò)表面的MHC Ⅰ類分子與其他免疫細(xì)胞MHC Ⅱ類分子相結(jié)合，識(shí)別其他免疫細(xì)胞抗原分子[15]。臨床研究顯示，機(jī)體的免疫保護(hù)作用主要通過(guò)大黃素調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞之間的平衡、分化能力發(fā)揮，且大黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)CD4+/CD8+之間平衡抑制Th1/Th2分化而維持細(xì)胞免疫與體液免疫的正常功能，Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫主要通過(guò)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子進(jìn)行[16]。臨床研究表明[17-18]，IFN-γ為促炎因子，可使B細(xì)胞進(jìn)行分化，誘導(dǎo)其成熟，并促進(jìn)B細(xì)胞記憶，且IFN-γ還可使甲狀腺上皮細(xì)胞HLA-Ⅱ類抗原表達(dá)增強(qiáng)，激活大量單核細(xì)胞，使其進(jìn)入甲狀腺內(nèi)，并使細(xì)胞毒性增強(qiáng)。Th2介導(dǎo)體液免疫通過(guò)分泌IL-4等抗炎細(xì)胞因子進(jìn)行，可使機(jī)體的免疫應(yīng)答受到抑制，且抗炎因子存在于甲狀腺組織浸潤(rùn)的單核細(xì)胞中，其EAT免疫病情的進(jìn)展可使抗炎因子表達(dá)降低[19]。本研究顯示，EAT大鼠中IFN-γ、IL-4表達(dá)升高，大黃素可降低IFN-γ、IL-4在EAT大鼠的表達(dá)含量，且中劑量大黃素對(duì)IFN-γ、IL-4的降低水平高于低劑量與高劑量大黃素，表明大黃素可保護(hù)其EAT大鼠免疫功能，并使Th的細(xì)胞因子分泌及分化受到抑制，減輕EAT大鼠的炎癥反應(yīng)。

NLRP3為胞質(zhì)內(nèi)的模式識(shí)別受體，可與ASC形成炎性小體，使Caspase-1活化，NLRP3通過(guò)激活Caspase-1促使IL-1β形成活性細(xì)胞因子，此在先天免疫中起到關(guān)鍵作用，NLRP3炎性小體由NLRP3、ASC、Caspase-1組成，在AIT中發(fā)揮著重要作用[20]。研究表明[21]，免疫細(xì)胞通過(guò)NLRP3/Caspase-1參加先天免疫應(yīng)答，且NLRP3在AIM2介導(dǎo)的甲狀腺濾泡細(xì)胞與AIT相關(guān)。在本研究中，NLRP3、ASC、Caspase-1在EAT大鼠中表達(dá)升高，對(duì)大鼠使用大黃素后NLRP3、ASC、Caspase-1表達(dá)降低，且中劑量大黃素對(duì)NLRP3、ASC、Caspase-1的降低水平更為顯著，表明大黃素可通過(guò)調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1通路改善EAT。

雖然本研究認(rèn)為大黃素具有改善EAT的作用，作用機(jī)制可能與NLRP3/Caspase-1通路有關(guān)，但此僅為本研究初步結(jié)果，臨床并未有研究分析其關(guān)系，因此本研究上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需后續(xù)研究進(jìn)一步探討驗(yàn)證，為EAT的研究提供新的方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)EAT大鼠做大黃素干預(yù)后，病變明顯被抑制，其作用機(jī)制可能與大鼠的NLRP3/Caspase-1失活相關(guān)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：南曉晶、楊舒煒：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)，提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;楊舒煒：資料搜集整理，論文修改，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。