武莉莉, 張敏△, 陳延偉, 關弘, 修英杰

深圳市第二人民醫(yī)院 1呼吸與危重癥醫(yī)學科， 2病理科(廣東深圳 518035)

支氣管哮喘是一種復雜的、持續(xù)的慢性氣道炎癥性疾病，其主要發(fā)病機制是TH1/TH2炎癥細胞因子比例失衡。白藜蘆醇(resveratrol, RV) (E)-3，5，4-三羥基二苯乙烯，又稱為芪三酚，是一種植物抗毒素，廣泛存在于葡萄、花生、桑椹等食物中，具有抗炎、抗氧化、調節(jié)免疫等生理作用。有研究[1-2]表明，白藜蘆醇可以有效抑制病毒和細菌或過敏原誘導的氣道炎癥，但其作用機制尚不完全明確。2020年3月1日至2020年4月30日，本研究觀察白藜蘆醇對OVA誘導哮喘小鼠氣道炎癥、氣道黏液分泌及JAK-STAT6信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗材料詳見表1。本研究已經(jīng)通過實驗動物福利和倫理審查(批準文號：TOP-IACUC-2020-07-0014)。

表1 實驗材料及型號

1.2 哮喘小鼠模型建立 購入SPF級雌性BALB/c 小鼠18 只，6～8周齡大小，體重18～22 g，于動物房適應性飼養(yǎng)1周。隨機分為3組：A組：對照組；B組：哮喘組；C組：哮喘經(jīng)白藜蘆醇治療組；每組6只。B組與C組小鼠于第0、7、14天分別腹腔內注射10%卵清蛋白(OVA)0.2 mL/只致敏，在實驗第21天，用1%OVA溶液霧化，每天30 min，連續(xù)1周，當出現(xiàn)打噴嚏、抓耳、煩躁不安、呼吸困難、肌肉痙攣等表現(xiàn)時為陽性反應。A組腹腔注射同等量生理鹽水，并用生理鹽水霧化。

1.3 給藥方法 在實驗第21天開始灌胃給藥，每次霧化吸入激發(fā)前半小時灌胃藥物干預，C組小鼠灌胃100 mg/kg的白藜蘆醇溶液，0.1 mL/10 g體重；A組和B組小鼠給予生理鹽水灌胃，0.1 mL/10 g體重，每組小鼠連續(xù)灌胃1周。

1.4 取材與檢測

1.4.1 肺組織蘇木素/伊紅染色(hematoxylin and eosin stain, HE)及阿新藍/過碘酸雪夫染色(Periodic acid Schiff and Alcian blue stain, AB-PAS)法染色 實驗第28天脫頸處死小鼠，生理鹽水洗去肺組織血漬，將肺組織分成3份，取小鼠右肺組織常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋、切片，做HE染色評價肺組織病理損傷情況，AB-PAS染色評價氣道黏液分泌情況。

1.4.2 IgE、IL-4、IL-13檢測 取小鼠肺組織約1 g加RIPA裂解液，用組織勻漿器研磨后(加蛋白酶抑制劑1∶100 + PMSF 1∶100 + 磷酸酶抑制劑1∶100)冰上裂解30 min，離心后取勻漿上清，按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測上清液中IgE、IL-4、IL-13的含量。

1.4.3 信號傳導及轉錄激活蛋白6(signal transducer and activator of transcription 6,STAT6)、p-STAT6檢測 取小鼠肺組織行蛋白質印跡法(Western blot)檢測肺組織中STAT6、p-STAT6的表達。用BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)凝膠電泳分離蛋白質30 μg，轉膜、封閉后經(jīng)一抗、二抗孵育；洗滌后按1∶1配制發(fā)光液，覆蓋在膜表面，顯色2 min后曝光，進行圖像采集分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS 19.0。3組之間比較采用方差分析，進一步的兩兩之間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理改變 HE染色后可見A組小鼠氣道黏膜正常，肺泡結構完整，未見明顯炎癥細胞浸潤；B組小鼠氣道黏膜充血水腫，黏膜下及間質血管旁可見大量炎癥細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，伴有小血管擴張，肺泡結構不完整；C組小鼠氣道黏膜水腫及炎癥細胞浸潤程度較B組小鼠明顯減輕(圖1)。

圖1 小鼠肺組織病理學改變 (HE,×200)

AB-PAS染色后可見A組小鼠氣道表面見少許藍染黏液，B組小鼠氣道表面可見藍染黏液呈毯樣分布(紅色箭頭所指)，而C組小鼠氣道黏液分泌情況較B組明顯減輕(圖2)。

圖2 小鼠肺組織AB-PAS染色(×200)

2.2 白藜蘆醇對炎癥細胞因子及IgE的影響

2.2.1 白藜蘆醇對IL-4的影響 3組小鼠肺組織勻漿上清液中IL-4的濃度分別為：A組(26.19±3.63)pg/mL、B組(47.66±4.67)pg/mL、C組(36.99±1.97)pg/mL，3組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=56.07，P<0.000 1)。A組與B組、A組與C組、B組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)。白藜蘆醇治療明顯減低OVA誘導升高的IL-4濃度(圖3)。

2.2.2 白藜蘆醇對IL-13的影響 3組小鼠肺組織勻漿上清液中IL-13的濃度分別為:A組(26.56±3.77)pg/mL、B組(40.92±3.23)pg/mL、C組(34.14±4.13)pg/mL，3組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=22.26，P<0.000 1)。A組與B組、B組與C組、A組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.000 1、P=0.01、P=0.007 8)。白藜蘆醇治療明顯減低OVA誘導升高的IL-13濃度(圖3)。

2.2.3 白藜蘆醇對IgE的影響 3組小鼠肺組織勻漿上清液中IgE的濃度分別為：A組(35.19±3.07)ng/mL、B組(59.55±3.29)ng/mL、C組(47.73±2.93)ng/mL，3組之間差異有統(tǒng)計學意義(F=92.50，P<0.000 1)。A組與B組、B組與C組、A組與C組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)。白藜蘆醇治療明顯減低OVA誘導升高的IgE濃度(圖3)。

注：與A組比較*P<0.01，**P<0.001；與B組比較△P<0.05，△△P<0.001

2.3 白藜蘆醇對JAK-STAT6信號通路的影響 Western blot檢測肺組織中STAT6、p-STAT6的表達，見圖4。3組間STAT6的表達無明顯差異，STAT6/GAPDH的灰度值比較差異無統(tǒng)計學意義(F=3.208，P=0.112 9)(圖5)。OVA誘導明顯增加了p-STAT6的表達，并經(jīng)白藜蘆醇治療后顯著緩解。3組p-STAT6/STAT6的灰度值比較差異有統(tǒng)計學意義(F=12.67，P=0.011)。其中A組與B組、B組與C組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009 9、0.049 8)，而A組與C組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.204 9)(圖5)。提示C組STAT6的磷酸化較B組有減弱，與A組差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 Western blot檢測條帶

注：與B組比較*P<0.05，**P<0.01

3 討論

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，其特征是嗜酸性粒細胞、肥大細胞等氣道浸潤增加、可逆性的氣流受限、呼吸功能降低，炎癥導致支氣管收縮和黏液分泌增加。

白藜蘆醇是一種具有抗炎和抗氧化功能的多酚[3]。既往研究證明，白藜蘆醇可以通過調節(jié)細胞信號轉導過程，從而減少炎癥[4-5]，還能通過多種抗氧化機制發(fā)揮作用，包括抑制炎癥細胞產(chǎn)生活性氧[6]，清除自由基[7]，刺激內源性抗氧化劑的生物合成[8]等。哮喘是氣道的炎癥反應，且氧化應激也為其主要發(fā)病機制之一，因此我們推測白藜蘆醇可能緩解哮喘的氣道炎癥。在本研究中，我們觀察到肺組織病理顯示經(jīng)白藜蘆醇治療后小鼠氣道黏膜水腫、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞浸潤程度較OVA誘導組小鼠明顯減輕，AB-PAS染色見氣道黏膜黏液分泌亦較OVA誘導組小鼠明顯減少，說明白藜蘆醇抑制了OVA誘導的肺組織炎癥細胞、嗜酸性粒細胞浸潤和氣道杯狀細胞的黏液高分泌。

既往研究顯示，氣道暴露于過敏原后，通過招募和激活包括嗜酸性粒細胞、T細胞、肥大細胞在內的炎癥細胞，釋放IL-4、IL-5、IL-13等TH2型炎癥因子，產(chǎn)生TH2主導的炎癥反應，這些TH2炎癥因子誘導炎癥反應，是哮喘的重要發(fā)病機制[9-12]。另一方面，IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子，進一步激活B淋巴細胞，使之合成特異性IgE，后者結合于肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE受體，當再次接觸變應原后與IgE交聯(lián)，使細胞合成并釋放多種活性介質導致哮喘的臨床癥狀。哮喘經(jīng)治療后IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子濃度減低，IgE合成減少，哮喘癥狀緩解。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇治療后肺組織勻漿上清液中IL-4、IL-13、IgE濃度較OVA誘導組小鼠明顯減輕，說明白藜蘆醇治療可明顯減輕OVA誘導的小鼠氣道炎癥。

JAK是一種非受體型蛋白酪氨酸激酶(PTK)，STAT是一種能與DNA結合的蛋白質獨特家族，包括STAT6在內的7個結構和功能相關的蛋白。STAT6在胞質內作為一種潛伏的單體形式存在。當IL-13 /IL-4與膜受體(IL-4Rα)結合后, 激活JAK2和JAK3，活化的JAKS使胞漿內的STAT6磷酸化并形成二聚體，遷移到細胞核，與IL-4和IL-13反應基因的啟動子結合，啟動轉錄以調節(jié)免疫應答反應[13-14]。因此，IL-4、IL-13是JAK/STAT6 信號通路的上游刺激因子。有證據(jù)[15]表明 JAK/STAT6 信號通路通過促進氣道高反應(AHR)和肺部炎癥在哮喘的發(fā)病機制中起著關鍵作用。p-STAT6代表了JAK/STAT6通路的活化水平，本研究中我們觀察到白藜蘆醇顯著降低了OVA致敏小鼠IL-4和IL-13的水平，且白藜蘆醇治療組小鼠的p-STAT6/STAT6較哮喘組明顯減低，提示白藜蘆醇通過抑制JAK/STAT6通路的上游刺激因子，從而進一步抑制了STAT6的磷酸化，影響了JAK/STAT6通路的表達。

既往研究顯示，JAK/STAT6信號轉導途徑可誘導Th2細胞分化、AHR和IgE合成[16]。本研究中我們觀察到白藜蘆醇抑制了OVA致敏小鼠特異性IgE的表達，推測其可能與抑制JAK/STAT6通路的活化有關。

哮喘患者大量分泌的黏液會加重氣道的阻塞，是哮喘患者致死的一個重要原因。研究[17]顯示IL-13是杯狀細胞化生和黏液分泌的關鍵細胞因子，而JAK-STAT6通路是調控該過程的重要信號通路。當氣道被外源性微生物或抗原攻擊時，誘發(fā)了TH2型變態(tài)反應，IL-13分泌大量增加，JAK-STAT6通路被激活，促進氣道纖毛細胞向杯狀細胞的化生，同時分泌大量黏液。有學者觀察到敲除小鼠體內IL-13基因后其杯狀細胞化生的過程被阻斷，黏液分泌減少[18]。在本研究中，我們觀察到白藜蘆醇治療組小鼠氣道黏液的分泌較哮喘組明顯減輕，同時IL-13分泌減少，STAT6的磷酸化受到抑制，推測其可能是通過減少IL-13的分泌，從而抑制JAK-STAT6通路的活性，以達到抑制杯狀細胞化生和減少黏液分泌的作用。

綜上所述，白藜蘆醇可減少哮喘模型鼠OVA特異性IgE的表達、減輕氣道炎癥反應及黏液高分泌，其機制可能與抑制JAK-STAT6通路的活性有關，提示白藜蘆醇在哮喘治療方面有一定的應用前景，有待進一步的研究和開發(fā)。

利益相關聲明：文章所有作者共同認可文章無相關利益沖突。

作者貢獻說明：數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析、論文撰寫為武莉莉，研究設計和方案指導為張敏，論文修改和審閱為陳延偉，研究方案協(xié)助執(zhí)行和實施為關弘和修英杰。