薛 文，秦 菊，努爾買(mǎi)買(mǎi)提·阿穆提，馬曉艷，蘇曉慧，阿依吐拉·肉孜，李雷斌，陳玲玲，古麗曼·木哈買(mǎi)提拜，王 文

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830011；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾 843300；3.中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618；4.廣西大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，廣西南寧 530005）

馬傳染性貧血（equine infectious anemia，EIA），簡(jiǎn)稱(chēng)馬傳貧，是由馬傳染性貧血病毒（EIAV）引起馬屬動(dòng)物的一種以反復(fù)發(fā)熱、貧血和持續(xù)病毒血癥為特征的傳染性疾病，我國(guó)將其列為二類(lèi)動(dòng)物疫病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為須通報(bào)動(dòng)物疫病[1]。《馬傳染性貧血檢疫技術(shù)規(guī)范》（SN/T 2717—2010）規(guī)定EIAV 的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法為病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（AGID）。AGID 方法簡(jiǎn)便特異，是國(guó)際貿(mào)易中指定的診斷方法，但是瓊脂濃度及溫度會(huì)對(duì)瓊脂板質(zhì)量產(chǎn)生影響，同時(shí)技術(shù)人員的不當(dāng)操作也可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果[2-3]。相比之下，ELISA 方法簡(jiǎn)單靈敏，適合樣本的高通量檢測(cè)，是EIAV 初篩的常用方法。

1963 年，新疆首次確診EIA 疫情，通過(guò)采取綜合性防制、檢疫凈化、免疫、全面檢疫凈化和達(dá)標(biāo)考核驗(yàn)收等處置措施[4]，疫情得到有效控制。近年來(lái)，新疆各地傳統(tǒng)民族馬術(shù)活動(dòng)和以馬術(shù)體育競(jìng)賽、騎馬旅游、民族馬術(shù)演出為主題的節(jié)慶活動(dòng)開(kāi)展日益頻繁，做好EIA 的監(jiān)測(cè)與防控工作至關(guān)重要。2018 年開(kāi)始，新疆全區(qū)推廣使用ELISA 方法初篩結(jié)合AGID 方法確診的方式開(kāi)展EIAV 監(jiān)測(cè)，切實(shí)加快了EIA 的消滅進(jìn)程。為了保障新疆現(xiàn)代馬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，本試驗(yàn)篩選了市面上4 種商品化ELISA 試劑盒和3 種AGID 試劑盒進(jìn)行比對(duì)分析，旨在為選擇更有效的EIAV 檢測(cè)試劑提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 馬血清樣本

1 份EIAV 強(qiáng)陽(yáng)性血清及28 份臨床馬血清，均為本實(shí)驗(yàn)室集中監(jiān)測(cè)保留樣本，-20 ℃保存。

1.2 檢測(cè)試劑盒

ELISA 檢測(cè)試劑盒：A（批號(hào)P200601-004）、B（批號(hào)20200812-0031）、C（批號(hào)GS456）、D（批號(hào)G58）；AGID 檢測(cè)試劑盒：A（批號(hào)P200301-001）、B（批號(hào)20200402）、C（批號(hào)HR798）。

1.3 主要儀器

全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Multiscan GO/美國(guó)Thermo 公司；高速自動(dòng)化洗板機(jī)，Hydrospeed/帝肯公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，DHP-9082PY/上海一恒科技有限公司；單道微量移液器，Brand 公司。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 靈敏性試驗(yàn) 用3 種商品化AGID 試劑盒和4 種ELISA 試劑盒分別檢測(cè)EIAV 強(qiáng)陽(yáng)性血清，將被檢測(cè)血清從1:2 倍比稀釋至1:2 048，每個(gè)稀釋度做2 個(gè)重復(fù)。AGID 試劑盒檢測(cè)步驟依據(jù)《馬傳染性貧血病瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)方法》（NY/T 569—2002）和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性對(duì)照參考線(xiàn)延伸到樣品孔，無(wú)彎曲或具有遠(yuǎn)離抗原孔并朝向陽(yáng)性對(duì)照血清的略微彎曲，判定為陰性；陽(yáng)性對(duì)照參考線(xiàn)與樣品和抗原之間的線(xiàn)連成一條連續(xù)的沉淀線(xiàn)，判定為強(qiáng)陽(yáng)性；對(duì)照沉淀線(xiàn)跑入樣品孔，且出現(xiàn)彎曲、方向朝向中心抗原孔的沉淀線(xiàn)，但在樣品孔和抗原孔之間未形成連續(xù)的線(xiàn)，判定為弱陽(yáng)性。ELISA 試劑盒具體操作步驟和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（表1）。

表1 4 種ELISA 試劑盒檢測(cè)原理和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 臨床樣品檢測(cè) 以28 份臨床馬血清作為樣品盤(pán)，分別用4 種商品化ELISA 試劑盒和AGID試劑盒B 進(jìn)行抗體檢測(cè)，以AGID 結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)計(jì)算符合率、Kappa 值、敏感性、特異性和約登指數(shù)，綜合評(píng)價(jià)4 種ELISA 試劑盒的檢測(cè)效果。具體操作步驟和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)同1.4.1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

以AGID 試驗(yàn)數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算4 種ELISA試劑盒的敏感性、特異性和符合率。敏感性=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%；特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）×100%；符合率=（真陽(yáng)性+真陰性）/樣本數(shù)量×100%。根據(jù)Kappa值評(píng)價(jià)試劑盒的一致性：Kappa 值＜0，代表一致性極差；0～0.2，代表一致性微弱；＞0.2～0.4，代表一致性弱；＞0.4～0.6，代表一致性中度；＞0.6～0.8，代表一致性高度；＞0.8～1.0，代表一致性極強(qiáng)。約登指數(shù)=敏感性+特異性-1。

2 結(jié)果

2.1 靈敏性試驗(yàn)

A、B、C、D 4 種ELISA 檢測(cè)試劑盒呈陽(yáng)性反應(yīng)的終點(diǎn)效價(jià)分別為1:1 024、1:256、1:32、1:128，A、B、C 3 種AGID 試劑盒呈陽(yáng)性反應(yīng)的終點(diǎn)效價(jià)均為1:16（表2）。

表2 ELISA 方法和AGID 方法的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 臨床樣品檢測(cè)

使用AGID 試劑盒B 和4 種ELISA 試劑盒分別對(duì)28 份田間馬血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示，ELISA 與AGID 檢測(cè)結(jié)果存在一定差異，且4 種ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果也不完全一致。28 份血清中，AGID 試劑盒B 檢測(cè)出陽(yáng)性血清12 份，4 種ELISA 試劑盒分別檢測(cè)出陽(yáng)性血清12、14、11、9 份。在AGID 試劑盒B 檢測(cè)出的12 份陽(yáng)性血清中，ELISA 試劑盒A、B 的檢測(cè)結(jié)果也為陽(yáng)性，試劑盒C 檢出1 份陰性，試劑盒D 檢出3 份陰性；在AGID試劑盒B檢測(cè)出的16份陰性血清中，ELISA 試劑盒A、C、D 的檢測(cè)結(jié)果也全部為陰性，僅試劑盒B 檢出2 份陽(yáng)性。

表3 AGID 試劑盒B 與4 種ELISA 試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 4 種ELISA 試劑盒綜合評(píng)價(jià)

28 份田間馬血清的檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示，ELISA 試劑盒A 與AGID 試劑盒B 檢測(cè)結(jié)果完全一致，符合率為100%（28/28），其他3 種ELISA試劑盒與AGID 試劑盒B 的總體符合率分別為92.86%（26/28）、96.43%（27/28）、89.29%（25/28）。根據(jù)Kappa 一致性檢驗(yàn)，4 種ELISA 試劑盒與AGID 試劑盒 的Kappa 值分別為1.000、0.857、0.926、0.774。

以AGID 結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，4 種ELISA 試劑盒的敏感性分別為100%（12/12）、100%（12/12）、91.67%（11/12）、75.00%（9/12），特異性分別為100%（16/16）、87.50%（14/16）、100%（16/16）、100%（16/16），約登指數(shù)分別為1.00、0.88、0.91、0.75。本試驗(yàn)中ELISA 試劑盒B 的敏感性（100%）高于試劑盒C（91.70%），而特異性（87.50%）低于試劑盒C（100%），試劑盒的敏感性和特異性有差異，因而需要通過(guò)約登指數(shù)進(jìn)行比較。對(duì)4種ELISA 試劑盒的約登指數(shù)比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒A效果最佳，其他依次是試劑盒C、B、D（表4）。

表4 4 種ELISA 試劑盒綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

本研究的靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 種ELISA試劑盒陽(yáng)性反應(yīng)的終點(diǎn)效價(jià)分別為1:1 024、1:256、1:32、1:128，3 種AGID 法試劑盒均為1:16，說(shuō)明ELISA 試劑盒的檢測(cè)靈敏度普遍高于AGID 試劑盒。郭振梅等[5]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用間接ELISA 方法檢測(cè)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陰性馬血清的復(fù)陽(yáng)率為4.4%（29/649）。張德祿[6]使用間接ELISA 方法復(fù)檢340 份冷凍保存2 個(gè)月左右的瓊擴(kuò)試驗(yàn)陰性血清復(fù)陽(yáng)率為45%（153/340）。以上結(jié)果提示，與AGID 方法相比，ELISA 方法提高了抗體滴度過(guò)低血清樣品的陽(yáng)性檢出率。由于樣本數(shù)量限制，本試驗(yàn)在樣品盤(pán)設(shè)置上，缺少弱陽(yáng)性及陰性樣品，且未對(duì)試劑盒批內(nèi)及批間穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，在實(shí)際應(yīng)用中有必要增加弱陽(yáng)性樣品及陰性樣品，并對(duì)試劑盒的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)測(cè)。

本研究的一致性試驗(yàn)結(jié)果顯示，4 種ELISA試劑盒與AGID 試劑盒檢測(cè)結(jié)果的符合率均能達(dá)到89%以上。王大孝等[7]使用ELISA 和AGID 對(duì)馬血清進(jìn)行比較檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1 298 份健康馬血清符合率為100%（1298/1298），44 份感染馬血清符合率為95.45%（42/44）?？祰^杰[8]使用20 份標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和268 份臨床馬血清進(jìn)行雙抗原夾心ELISA 和AGID 比較試驗(yàn)，符合率為98.96%，與本次試驗(yàn)結(jié)果接近。根據(jù)Kappa 一致性檢驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，Kappa 值越大，代表結(jié)果可靠程度越高。本試驗(yàn)中，ELISA 試劑盒A、B、C 與AGID 試劑盒一致性檢測(cè)結(jié)果均為極強(qiáng)，試劑盒D 與AGID試劑盒一致性檢測(cè)結(jié)果為高度。由此可見(jiàn)，ELISA是EIA 診斷的可靠手段之一。

在4 種ELISA 試劑盒中，試劑盒A、B 的敏感性均達(dá)到100%（12/12），優(yōu)于試劑盒C（91.67%）和試劑盒D（75.00%）；試劑盒A、C、D 的特異性均達(dá)到100%，優(yōu)于試劑盒B（87.50%）。試劑盒A 采用雙抗原夾心方法，使用純化的EIAV p26重組抗原和過(guò)氧化物酶標(biāo)記的重組蛋白p26 結(jié)合物作為雙抗原，有效減少了非特異性抗體干擾，從反應(yīng)機(jī)制上減少了假陽(yáng)性，特異性較間接法（試劑盒D）和競(jìng)爭(zhēng)法（B、C 試劑盒）都高。同時(shí)雙抗原夾心法檢測(cè)總抗體，可有效檢測(cè)弱陽(yáng)性樣品[9]。

考慮到敏感性和特異性權(quán)重不同，本研究引入加權(quán)約登指數(shù)，加權(quán)約登指數(shù)Jω=2×[ω×靈敏性+(1-ω)×特異性]-1（ω為權(quán)重，0 ≤ω≤1）；0 ≤Jω≤1，Jω越接近1，代表真實(shí)性越大[10]。在EIA 凈化早期，預(yù)期流行率較高，應(yīng)盡可能篩選出可疑樣品，即更關(guān)注敏感性，那么可設(shè)定ω＞0.5，隨著ω增大，ELISA 試劑盒B的優(yōu)勢(shì)相對(duì)明顯；當(dāng)處于凈化晚期，預(yù)期流行率很低，應(yīng)避免誤殺造成的經(jīng)濟(jì)損失，即更關(guān)注特異性，那么可設(shè)定ω＜0.5，則ELISA 試劑盒C、D 的優(yōu)勢(shì)愈加明顯。以上結(jié)果提示，在開(kāi)展EIAV 抗體監(jiān)測(cè)時(shí)，應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況合理選擇試劑盒，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前，監(jiān)測(cè)篩查EIAV 陽(yáng)性血清通常使用垂直試驗(yàn)，即經(jīng)ELISA 初篩的陽(yáng)性血清必須通過(guò)AGID 試驗(yàn)確認(rèn)[11]。這種聯(lián)合試驗(yàn)方法可以使兩種方法優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，有效提高試驗(yàn)的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，提升檢測(cè)可靠性，縮短疫區(qū)凈化時(shí)間。當(dāng)ELISA、AGID 的檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)，需要反復(fù)檢測(cè)或者使用免疫印跡法進(jìn)行修正[3]。