許秀瓊，劉 劼，吳立煬，葉 健，查云峰，王福廣，孫柏林，盧受昇

（廣東省動物疫病預(yù)防控制中心，廣東省動物衛(wèi)生檢疫所，廣東廣州 510230）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，臨床上以高熱、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)出血和高死亡率為特征，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1]。2018 年8 月我國首次報道ASF 疫情[2]。目前該病尚缺乏有效的預(yù)防疫苗和針對性治療藥物，因此精準剔除陽性動物尤為重要。熒光PCR 檢測方法具有敏感、快速、靈敏等優(yōu)點，檢出下限為6 個質(zhì)?？截惢?.1～1.0 TCID50/mL[3-4]，是實現(xiàn)精準剔除的最佳方法。但近年新出現(xiàn)的ASFV變異毒株具有排毒量低、不易檢測等特點[5]，這對試劑盒的敏感性和特異性提出了更高要求。

本試驗選取了6 個廠家的ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒，參照OIE《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》（2018 年版）[3]1.1.6 章推薦的程序要求，對其特異性、敏感性和重復(fù)性進行了比較分析，以期了解各個試劑盒的性能特點及差異。

1 材料與方法

1.1 樣品

ASF 陽性樣品，包括血清、全血及組織；ASF陰性樣品，包括組織和血清；ASFV 核酸標準物質(zhì)和特異性對照，包括疫苗和抗原。ASF陰、陽性樣品，由市級動物疫病預(yù)防控制中心實驗室初步檢測，再由廣東省動物疫病預(yù)防控制中心復(fù)檢確定，詳見表1。

表1 樣品類型、數(shù)量及來源 單位：份

1.2 設(shè)備與試劑

本次試驗使用的熒光PCR 儀為羅氏LC480，所有儀器均已通過計量校準；試劑盒為6 個廠家的ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒，分別用A、B、C、D、E、F 表示，每個廠家產(chǎn)品各檢測2 個批次；DNA提取試劑盒為廣州達安基因股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 驗證試驗

1.3.1 DNA 提取及PCR 檢測 DNA 提取按照達安基因核酸提取純化試劑盒（磁珠法）說明書進行，熒光PCR 檢測按照6 個廠家相應(yīng)的試劑盒說明書進行。

1.3.2 分析特異性（analytical specificity，ASp）使用72 份ASF 陽性樣品、6 份ASF 陰性組織樣品、2 份ASF 陰性血清樣品，評價檢測試劑盒的包含性。使用2 份豬繁殖與呼吸綜合征疫苗、2 份豬瘟兔化弱毒株疫苗、2 份口蹄疫（A、O、Asia I）抗原混合物、2 份偽狂犬病毒核酸標準物質(zhì)，評價試劑盒的排他性。結(jié)合統(tǒng)計學中的診斷特異性（diagnostic specificity，DSp）、診斷敏感性（diagnostic sensitivity，DSe）、Youden 指數(shù)、受試者工作特征曲線（receiver operating charaCteristic curve，ROC 曲線）等統(tǒng)計學方法[6]，綜合評價試劑盒的分析特異性。計算公式[6]：

式中a為真陽性數(shù)，b為假陽性數(shù)，c為真陰性數(shù)，d為假陰性數(shù)。

1.3.3 分析敏感性（analytical sensitivity，ASe）使用終點稀釋法，將ASFV 核酸標準物質(zhì)進行10倍梯度稀釋，得到稀釋度依次為100～10-7的8 份樣品，對每份樣品進行3 次重復(fù)檢測，以確定試劑盒的最低檢出限（LOD）。繪制標準曲線，計算核酸含量（copies/μL），綜合評價試劑盒的分析敏感性。

1.3.4 重復(fù)性（repeatability）選取稀釋度為10-1和10-3的ASFV 核酸標準物質(zhì)，由兩名實驗人員使用各試劑盒的批內(nèi)及批間產(chǎn)品，對每個稀釋度樣品進行5 次重復(fù)檢驗，根據(jù)檢測結(jié)果計算變異系數(shù)（CV），評價試劑盒的重復(fù)性。

1.3.5 統(tǒng)計學分析 使用Microsoft Excel 和SPSS 26.00，對上述結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析特異性

樣品盤包括88 份樣品，其中ASF 陽性樣品72份、ASF陰性樣品16份。診斷特異性結(jié)果顯示，B、C、D、E、F 試劑盒的特異性均達到了100%，僅有A 試劑盒為87.50%；診斷敏感性從高到低依次為E ＞A/B ＞F ＞C/D；Youden 指數(shù)從高到低依次為E ＞B ＞F ＞C/D ＞A。具體結(jié)果見表2。

表2 各試劑盒分析特異性結(jié)果

利用SPSS 軟件繪制ROC 曲線并計算ROC曲線下區(qū)域面積（AUC）。當AUC ＞0.9 時，代表檢測結(jié)果準確性高，AUC 越大，試劑盒的準確性越高[6]。如圖1 和表3 所示：有5 個試劑盒的AUC ＞0.9，說明大部分受測試劑盒準確性較高，AUC 從大到小依次為E ＞B ＞F ＞C/D ＞A，與Youden 指數(shù)結(jié)果一致。

表3 各試劑盒AUC 結(jié)果

2.2 分析敏感性

對8 個稀釋度（100～10-7）的ASFV 核酸標準物質(zhì)，分別進行3 次重復(fù)檢驗，根據(jù)結(jié)果繪制標準曲線。結(jié)果（圖2）顯示，受測試劑盒A、B、C、D、E、F 的標準曲線斜率分別為-3.57、-3.67、-3.33、-3.63、-3.36、-3.63，線性回歸系數(shù)分別為0.993 0、0.999 2、0.985 0、0.999 6、0.998 0、0.999 2，均較理想。A、B、E、F 的LOD 均為10-1～100copies/μL，C 為100～101copies/μL，D 為101～102copies/μL，由高到低依次為A/B/E/F ＞C ＞D，說明受測試劑盒的LOD 均能達到10-1～102copies/μL。

2.3 重復(fù)性比較

對10-1和10-3兩種稀釋度的ASFV 核酸標準物質(zhì)進行檢測發(fā)現(xiàn)（表4），檢測高濃度樣品時，試劑盒的重復(fù)性較好，批內(nèi)及批間的CV 均控制在1.5%以內(nèi)。在檢測低濃度樣品時，試劑盒的重復(fù)性較差，因此僅對檢出率達到80%以上的試劑盒進行CV 分析，結(jié)果批內(nèi)CV 為2.25%～6.12%，批間CV 為2.93%和4.93%，批內(nèi)、批間差異均較大。

3 討論

ASF 疫情發(fā)生后，養(yǎng)豬從業(yè)者的生物安全意識普遍增強，生物安全措施不斷得到改進和完善。但由于病毒污染面廣，且田間毒株不斷發(fā)生變異，使得ASF 流行情況復(fù)雜多變[1]，尤其是弱毒株的感染，隱蔽性強，嚴重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)。在缺乏有效疫苗和針對性治療手段時，精準剔除陽性動物十分重要，而實現(xiàn)精準剔除的前提是應(yīng)用快速、準確的診斷方法，而具有特異性強、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點的熒光PCR 檢測技術(shù)是最佳選擇。該技術(shù)被認為是迄今為止最靈敏可靠的方法之一[7]，因此對熒光PCR 試劑盒的性能進行綜合評價就顯得尤為重要。本試驗通過對6 個廠家ASFV 熒光PCR 檢測試劑盒的敏感性、特異性、重復(fù)性等指標進行比較，綜合評估了各試劑盒的性能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各試劑盒的的特異性、敏感性表現(xiàn)均較好，可滿足基本檢測需求，但重復(fù)性差異較大。

特異性方面，本試驗樣品盤設(shè)置包括臨床組織、血清、全血以及疫苗、抗原等多種類型樣品，對試劑盒的包含性和排他性開展評價，以期為試劑盒適用性提供更加真實可靠的數(shù)據(jù)[8-9]。綜合評價結(jié)果顯示，部分試劑盒對臨床樣品漏檢的比例較大，且出現(xiàn)假陽性情況。原因可能有兩點：一是制造商選取的參考毒株或供驗證的備選毒株代表性不強，與當前流行毒株差異較大；二是反應(yīng)條件優(yōu)化程度不夠，或者引物探針特異性不強，影響了試劑盒的特異性。ASFV 基因組易發(fā)生變異，且各國流行情況不同[10]，因此制造商應(yīng)結(jié)合使用地的實際情況進行試劑盒的設(shè)計和生產(chǎn)，避免影響其特異性。

敏感性方面，熒光PCR 的線性檢測范圍為0～1011copies/mL[11]，受測試劑盒總體符合檢測線性范圍要求，但試劑盒間的敏感性差異可達百倍。影響敏感性的因素可能有以下幾種：（1）Taq酶的選取。熱啟動Taq酶、高保真酶等可以有效提高擴增效率。（2）引物的優(yōu)化程度。應(yīng)盡可能減少引物二聚體對反應(yīng)體系的影響。（3）反應(yīng)條件優(yōu)化程度。循環(huán)數(shù)、溫度盡可能達到最優(yōu)反應(yīng)條件。（4）Mg2+濃度以及DNA的完整性和合適的模板濃度等。

重復(fù)性方面，當樣品的稀釋倍數(shù)越高，Ct 值越接近臨界值時，試劑盒的重復(fù)性越低。對稀釋倍數(shù)高，Ct 值接近臨界值的樣品，建議增加檢測次數(shù)，提高結(jié)果準確性。試劑盒在檢測高濃度樣品時，重復(fù)性均較好，且批內(nèi)重復(fù)性較批間重復(fù)性好。重復(fù)性是驗證試劑盒質(zhì)量的重要手段，也是試劑盒在實際應(yīng)用中的價值體現(xiàn)[12]。檢測發(fā)現(xiàn)，試劑盒的重復(fù)性與敏感性關(guān)系密切，敏感性較差的試劑盒，在檢測低濃度樣品時，重復(fù)性也較差。

受測的部分試劑盒沒有設(shè)置內(nèi)參，可能會使檢測結(jié)果的差異變大[13]。另外，部分試劑盒采用病毒的核酸片段作為陽性質(zhì)控品，其質(zhì)量不穩(wěn)定，使用時易降解，會影響試驗的準確性，且該質(zhì)控品未與樣品同步進行核酸提取，缺乏對核酸提取環(huán)節(jié)的有效評估，裝甲病毒（假病毒）質(zhì)控品的研究有望彌補這一缺陷[9]。

本試驗評價了6 種ASFV 商品化熒光PCR檢測試劑盒，但仍有需進一步完善的地方，如增加對人工攻毒動物的檢測，因為不同感染時期的檢測結(jié)果，對試劑盒診斷適用性方面的評估也非常具有參考價值[9]。各個實驗室可根據(jù)自身用途和實際情況，在保證試劑盒重復(fù)性的前提下，靈活選擇特異性和敏感性適合的試劑盒。本研究使用的評價方法對其他病毒熒光PCR 檢測試劑盒的評價也具有參考意義。