寇美玲，謝佳芮，苗海生

（云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224）

阿卡斑病毒（Akabane virus，AKAV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyavirus）辛波（Simbu）血清群，是一種通過庫蠓、蚊蟲等節(jié)肢動物傳播的蟲媒病原，最易感染妊娠期的牛和羊，也可感染馬、豬和駱駝[1-5]，廣泛流行于亞洲、大洋洲和非洲的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)[6]，可導致妊娠母畜流產、早產，產死胎，并可通過胎盤垂直傳播，侵害胚胎中樞神經系統，導致新生牛羊出現積水性無腦癥和先天性關節(jié)彎曲等癥狀，對牛羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構成較大威脅。1959 年AKAV 首次在日本群馬縣赤羽村被發(fā)現，隨后在澳大利亞、韓國、南非和以色列等國家被相繼報道發(fā)現[4-5，7-8]。近年來，我國云南、廣西、廣東、貴州、四川等省（自治區(qū)）也有AKAV 相關血清學調查、病毒核酸檢測的報道，提示這些地區(qū)的家畜中可能有AKAV 流行[9-12]。

云南省位于我國西南部，有多個縣市與老撾、緬甸、越南等國家接壤且缺乏自然屏障，接壤縣市之間貿易往來頻繁，每年有大量家畜通過邊境縣市進入我國境內，且邊境縣市大多屬于熱帶、亞熱帶氣候，溫差小，雨量充沛，適宜媒介昆蟲的生長繁殖，更有利于AKAV 傳播，因此防控邊境地區(qū)AKAV感染對于保障云南省家畜養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。為了解云南省邊境地區(qū)牛群的AKAV 感染情況，本研究采用C-ELISA 方法對采自云南省邊境縣市的牛血清樣品進行AKAV 抗體檢測，并對不同來源、不同年份、不同品種、不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)方式牛群的抗體陽性率進行統計分析，初步評估云南省邊境地區(qū)牛群AKAV 流行風險，以期為云南省邊境地區(qū)AKAV 感染相關防控政策的研究與制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019—2020 年，每年的1—9 月從云南省邊境地區(qū)10 個縣市（芒市、瑞麗、景洪、勐海、勐臘、富寧、孟連、西盟、江城、滄源）197 個場點采集牛血清樣品4 437 份，其中入境牛2 644 份、本地牛610份，其余1 183份背景信息不詳。在每個縣市，按照采樣點所屬地理位置劃定區(qū)域，將區(qū)域內養(yǎng)殖場、活畜交易市場和散養(yǎng)戶編號，根據所在區(qū)域實際情況，按比例隨機抽取養(yǎng)殖場1～4 個、活畜交易市場1～2 個、散養(yǎng)戶1～20 個；場戶內根據存欄量，以頸靜脈采血方式，按比例隨機采集牛血清樣品。采樣地點選擇雨量多、日照長、濕度大，適于媒介昆蟲生長和繁殖的熱帶、亞熱帶地區(qū)。具體采樣信息見表1。

表1 2019—2020 年云南省邊境地區(qū)10 個縣市采樣場戶數

1.2 主要試劑

AKAV C-ELISA 檢測試劑盒[13]、PBSTM（磷酸鹽緩沖液+Tween 20+脫脂奶粉），為云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室制備；脫脂奶粉，購自BD difco 公司；PBS 干粉、Tween 20，均購自云南豐科生物科技有限公司。

1.3 血清抗體檢測

利用云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室研制的AKAV C-ELISA 檢測試劑盒，對樣品進行血清抗體檢測。取出試劑盒提供的ELISA 板，各加入12 μL 待檢血清以及陰陽性對照血清到相應檢測孔和對照孔，每孔加入50 μL 1/100 稀釋的豚鼠競爭抗體，震蕩混勻，37 ℃溫育1 h；PBST 洗板3 次，吸水紙上拍干；每孔加入50 μL 1/1 000 稀釋的兔抗豚鼠HPR，37 ℃溫育30 min；洗板5～6次拍干，加入TMB 顯色液50 μL/孔，37 ℃避光溫育10 min；加入終止液50 μL/孔，用ELISA 讀板儀450 nm 波長測定樣本和對照的吸光值A450。試劑盒質控標準：兩個陽性對照孔A450≥0.8，兩個陰性對照孔A450≤0.3。判定標準：按照抑制率（PI）=（1-樣品血清A450/陰性對照A450平均值）×100%；抑制率≥40% 時判為陽性，＜40%時判為陰性。

1.4 統計分析

將各地檢測的AKAV 抗體陽性率，采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 地區(qū)分布

地區(qū)統計結果（表2）顯示：在邊境地區(qū)10 個縣市采集的4 437 份牛血清樣品中，共檢出1 367 份抗體陽性血清樣品，平均抗體陽性率為30.81%；10 個縣市均檢測到抗體陽性樣品，其中勐臘、滄源、富寧、江城、景洪等縣市抗體陽性率較高，每年的抗體陽性率和場戶陽性率均在30%以上，而瑞麗、西盟較低，均在25%以下，差異存在統計學意義（P＜0.05）。結果表明，云南省邊境地區(qū)存在一定范圍的牛AKAV 感染，且地區(qū)間存在一定差異。

2.2 時間分布

2019 年平均抗體陽性率為27.88%，2020 年為32.14%，呈現增高趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），每個地區(qū)的抗體陽性率均呈現增高趨勢（表2），但除富寧縣2019、2020 年抗體陽性率差異顯著（P＜0.05）外，其余縣市差異均不顯著（P＞0.05）。2019 年平均場戶陽性率為38.81%，2020年為36.92%，呈現降低趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），大多數縣市的場戶陽性率也表現降低趨勢。

2.3 群間分布

2.3.1 不同來源 不同來源樣品統計結果（表3）顯示：每年的入境?？贵w陽性率均顯著高于本地牛（P＜0.05），且入境牛、本地牛以及來源不詳牛的抗體陽性率均呈增加趨勢。

表3 不同來源牛AKAV 血清抗體檢測結果統計

2.3.2 不同場戶 不同場點統計結果（表4）顯示：每年的養(yǎng)殖場抗體陽性率均高于散養(yǎng)戶和交易市場，但差異不顯著（P＞0.05）；每年均從3 個活畜交易市場中檢出陽性樣品，場戶陽性率均為100%，與養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶差異存在統計學意義（P＜0.05）。

表4 不同場點AKAV 血清抗體檢測結果統計

2.3.3 不同飼養(yǎng)方式 不同飼養(yǎng)方式的統計結果（表5）顯示：舍飼牛群的AKAV 抗體陽性率最高，系牧飼養(yǎng)次之，半放牧半舍飼最低；舍飼與其他飼養(yǎng)方式相比，抗體陽性率差異存在統計學意義（P＜0.05）。

表5 不同飼養(yǎng)方式牛群的AKAV 抗體檢測結果統計

2.3.4 不同品種 不同品種的統計結果（表6）顯示：不同品種牛均可感染AKAV，2019、2020 年黃?？贵w陽性率分別為30.03%，34.03%，水牛分別為10.89%、17.20%，黃牛顯著高于水牛（P＜0.05）。

表6 不同品種牛的AKAV 抗體檢測結果統計

3 討論

AKAV 是一種通過媒介昆蟲傳播的病毒，主要造成反芻動物繁殖障礙和先天性畸形。1998 年李其平等[14]從上海市采集蚊、蠓等標本，首次分離到AKAV；2007 年Wang 等[15]對我國24 個省（直轄市）2006—2015 年的血清樣品進行AKAV中和試驗，結果在23 個?。ㄖ陛犑校z測到抗體，牛陽性率為21.3%，羊為12.0%，說明我國牛羊中存在一定的AKAV 感染。我國近年來仍不斷有分離到AKAV 的報道[9-11]。到目前為止，針對AKAV感染沒有有效治療方法，因此開展AKAV 血清學調查對其流行的控制極為重要。

本研究所選的10 個縣市與老撾、越南、緬甸接壤，均處于亞熱帶、熱帶地區(qū)，平均氣溫高，降雨多，適宜蚊、蠓等媒介昆蟲生長繁殖，利于AKAV 傳播，具有地域代表性。由于國內牛、羊等易感動物目前均未接種AKAV 疫苗，田間動物沒有疫苗接種干擾，因此血清學方法對于AKAV 感染的流行病學調查具有重要意義。對比常用的血清學方法，中和試驗重復性誤差大，血凝抑制、瓊脂擴散和補體結合試驗敏感性低[16-17]，而ELISA 方法檢測結果更為準確。本研究對云南省邊境地區(qū)10 個縣市牛群進行AKAV 血清學調查，初步摸清了這些地區(qū)的AKAV 流行本底，揭示了云南省邊境地區(qū)牛群存在不同程度的AKAV 感染。10 個邊境縣市的AKAV 抗體陽性率存在一定差異，也可能與采集血清樣品的時間、樣本數量及場戶等差異有關。對本地和入境牛的檢測結果進行統計發(fā)現，入境牛AKAV 抗體陽性率明顯高于本地牛，提示與其接壤國家的邊境地區(qū)AKAV 流行可能較為嚴重，對我國本地牛群威脅較大。因此，應加強海關檢疫，在鄰近地帶，定期進行防蟲、殺蟲，切斷AKAV 傳播途徑。

養(yǎng)殖場的抗體陽性率高于散養(yǎng)戶和交易市場，這可能與大部分養(yǎng)殖場采取舍飼的飼養(yǎng)方式有關?；钚蠼灰资袌鰞赡陜染鶛z測到抗體陽性，場戶陽性率達到100%，病毒擴散風險較高，因此應加強流通監(jiān)管。舍飼牛群抗體陽性率明顯高于半放牧半舍飼和系牧飼養(yǎng)方式牛群，其原因可能是密集型飼養(yǎng)更易于牛群間相互感染，且舍飼下牛群運動相對較少，對病毒的抵抗力較弱。黃牛和水牛均可感染AKAV，但黃牛的抗體陽性率明顯高于水牛，但由于水牛樣品采集數量相對較少，牛品種與AKAV感染之間的關聯性需要進一步加大樣本量來驗證。研究發(fā)現，AKAV 感染有加重的趨勢，需要加強監(jiān)測和控制。

本研究對云南省邊境地區(qū)進行了牛AKAV 血清學調查，初步探究了邊境地區(qū)牛群AKAV 感染的分布情況及其特點，為今后本病防控提供了重要的流行病學依據。

4 結論

對云南省10 個邊境地區(qū)進行牛AKAV 血清學調查發(fā)現，云南省邊境地區(qū)存在一定的AKAV 感染且有加重趨勢，入境牛感染顯著高于本地牛。提示相關部門需重視對邊境地區(qū)AKAV流行的控制，持續(xù)開展血清學調查和監(jiān)測，加強境外牛群入境檢疫，降低AKAV 從邊境地區(qū)向內地擴散的風險。