郭亞男，楊春蓮，謝文青，趙永紅，擺世林，梁小軍

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川750002；2.固原市畜牧技術(shù)推廣服務(wù)中心，寧夏 固原 756000；3.海原縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，寧夏 海原 755299；4.海原縣國(guó)有林場(chǎng)和草原建設(shè)服務(wù)中心，寧夏 海原 755299；5.寧夏向豐農(nóng)牧業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司，寧夏 西吉756200)

目前在我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平不斷向前發(fā)展的大背景下，大規(guī)模牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到進(jìn)一步發(fā)展，已經(jīng)成為基層地區(qū)農(nóng)民群眾發(fā)家致富的一種主要途徑。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷增加，面臨的病毒性、細(xì)菌性、寄生蟲(chóng)性等疾病愈來(lái)愈多，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成的損失也越來(lái)越多，直接威脅到養(yǎng)殖場(chǎng)種群的穩(wěn)定和擴(kuò)繁，進(jìn)而影響?zhàn)B牛產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

在養(yǎng)殖中新生犢牛常見(jiàn)的傳染性疾病，主要包括消化道疾病和呼吸系統(tǒng)疾病[1]。因新生犢牛適應(yīng)環(huán)境的能力不足，免疫系統(tǒng)不夠強(qiáng)大，呼吸道疾病成為犢牛養(yǎng)殖中的棘手問(wèn)題，該疾病病因復(fù)雜，傳染性強(qiáng)，且具有一定的潛伏期，不易被發(fā)現(xiàn)，對(duì)肉牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，因此通過(guò)對(duì)疾病流行情況的檢測(cè)和診斷，對(duì)疾病的防治尤為重要[2-4]。牛呼吸道疾病通常由多種病原體混合感染導(dǎo)致，包括病毒、細(xì)菌、支原體，常見(jiàn)的病原主要包括支原體、結(jié)核桿菌、巴氏桿菌、呼吸道合胞體病毒、牛傳染性鼻氣管炎、牛副流感病毒、牛病毒性腹瀉病毒等[5]。呼吸道疾病在養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)病相對(duì)較高，一旦發(fā)生流行，將會(huì)對(duì)整個(gè)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的威脅。隨著牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷向前推進(jìn)，單一病原引發(fā)的牛呼吸道疾病的發(fā)生率呈現(xiàn)逐年下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為多種病原混合感染繼發(fā)感染，使患病病例的臨床癥狀不斷向復(fù)雜化方向轉(zhuǎn)變，給疾病的診斷和防控工作帶來(lái)很多困難[6]。

本研究采用病原分子診斷技術(shù)，針對(duì)固原2個(gè)肉牛養(yǎng)殖區(qū)開(kāi)展為期3年的犢牛呼吸道疾病流行病學(xué)調(diào)查，旨在掌握目前犢牛呼吸道疾病的發(fā)病及流行情況，為針對(duì)性的實(shí)施疾病防控措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

RNAiso Plus、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2、Premix TaqTM、DL2000TMMarker等均購(gòu)自TaKaRa公司；RNA專(zhuān)用氯仿、RNA專(zhuān)用75%乙醇、異丙醇等購(gòu)自上海生工公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司D2500-01。

1.2 引物設(shè)計(jì)和合成

采用寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所動(dòng)物疫病研究室前期已建立的牛多病原PCR診斷技術(shù)方法。不同病原引物序列均由上海生工合成。

2 方法

2.1 樣品采集

用無(wú)菌長(zhǎng)棉簽采集患牛鼻腔深部分泌物置于裝有2 mL滅菌生理鹽水中試管中，冷藏條件下保存。固原市楊坪村2019—2021年共計(jì)采集呼吸道鼻拭子661份，其中2019年共采集犢牛呼吸道樣品182份；2020年共采集犢牛呼吸道樣品204份；2021年共采集犢牛呼吸道樣品275份。固原市馬溝村2019—2021年共計(jì)采集呼吸道鼻拭子736份，其中2019年共采集犢牛呼吸道樣品224份；2020年共采集犢牛呼吸道樣品250份；2021年共采集犢牛呼吸道樣品262份。

2.2 DNA/RNA提取

DNA提取：采集鼻拭子的試管使用旋渦振蕩儀振蕩1 min后，12 000 r/min離心2 min，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)菌體沉淀進(jìn)行基因組DNA的提取，-80 ℃保存。

RNA提取：采集鼻拭子的試管使用旋渦振蕩儀振蕩1 min后，3 000 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清12 000 r/min離心30 min，離心后取棄上清，收集沉淀用于RNA提取。根據(jù)RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)操作程序?qū)μ幚順颖綬NA進(jìn)行提取。根據(jù)PrimescriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序?qū)⑻崛〉目俁NA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存。

2.3 PCR擴(kuò)增及序列分析

不同病原體PCR引物和退火溫度如表1所示。PCR反應(yīng)體系為25 μL體系：2×Taq Mix 12.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各0.5 μL，DNA模板2 μL，去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃變性30 s、退火溫度見(jiàn)表1。20 s、72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 不同病原體引物序列、退火溫度及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用不同軟件處理數(shù)據(jù)，用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，采用SAS軟件中的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同年份犢牛呼吸道系統(tǒng)疾病發(fā)情情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2019—2021年楊坪村犢牛呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但不同年份間差異不顯著(P>0.05)。2019年，楊坪村犢牛呼吸系統(tǒng)性疾病發(fā)病率為27.37%；2020年，犢牛呼吸系統(tǒng)性疾病發(fā)病率為26.84%；2021年，犢牛呼吸系統(tǒng)性疾病發(fā)病率為24.12%(表2)。

2019—2021年馬溝村犢牛呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，2021年與2019年相比差異顯著(P<0.05)。2019年，楊坪村犢牛呼吸系統(tǒng)性疾病發(fā)病率為26.20%；2020年，犢牛呼吸系統(tǒng)性疾病發(fā)病率為21.93%；2021年，犢牛呼吸系統(tǒng)性疾病發(fā)病率為19.70%(表2)。

表2 2019—2021年?duì)倥：粑兰膊“l(fā)病率統(tǒng)計(jì)

2.2 犢牛呼吸道疾病6種病原檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)提取呼吸道鼻拭子樣品DNA和RNA，并采用特異性引物進(jìn)行6種病原分子生物學(xué)診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊坪村2019—2021年6種病原平均陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，但不同年份間差異不顯著(P>0.05)。2019年檢測(cè)的6種病原中，平均陽(yáng)性率為18.97%，牛支原體感染率最高，為45.05%；其次是牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性率達(dá)24.73%，牛傳染性鼻氣管炎病毒陽(yáng)性率達(dá)21.98%，多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率達(dá)10.99%，其他2種病原在7%以下。2020年檢測(cè)的6種病原中，平均陽(yáng)性率為18.79%，主要以牛支原體和巴氏桿菌為主。牛支原體感染率最高，為59.80%，其次多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率達(dá)29.41%，其他4種病原陽(yáng)性率均低于7%。2021年檢測(cè)的6種病原中，平均陽(yáng)性率為17.21%，主要以牛支原體和巴氏桿菌為主。牛支原體感染率最高，為45.09%，其次是多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率達(dá)33.45%，其他病原在8%以下(表3)。

表3 楊坪村6種病原發(fā)病情況

馬溝村2019—2021年6種病原平均陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，但不同年份間差異不顯著(P>0.05)。2019年檢測(cè)的6種病原中，平均陽(yáng)性率21.95%，牛支原體感染率最高，為53.57%；其次是多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率達(dá)41.07%，牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性率達(dá)24.73%，其他3種病原在9%以下。2020年檢測(cè)的6種病原中，平均陽(yáng)性率為21.00%，牛支原體感染率最高，為59.80%；其次是多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率達(dá)33.60%，牛病毒性腹瀉病毒陽(yáng)性率達(dá)13.60%，其他3種病原在10%以下。2021年檢測(cè)的6種病原中，平均陽(yáng)性率為17.24%，牛支原體感染率最高，為61.07%，其次是多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率達(dá)22.90%，其他病原在7%以下(表4)。

表4 馬溝村6種病原發(fā)病情況

3 討 論

通過(guò)對(duì)寧夏固原地區(qū)2個(gè)示范村楊坪村和馬溝村肉犢牛呼吸道疾病發(fā)病情況和6種常發(fā)病原的鑒定開(kāi)展為期3年的追蹤調(diào)查。2019—2021年間犢牛呼吸道病毒性疾病發(fā)病率逐年減少，原因可能是由于近年來(lái)病毒性疫苗的使用，尤其是牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒疫苗的推廣使用明顯抑制了這兩種疾病的發(fā)生，同時(shí)也證明疫苗可以作為預(yù)防疾病的首要手段；而牛支原體和多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性率占比較大，牛支原體目前美國(guó)已經(jīng)有商品化的疫苗，但是成本較高，免疫效果沒(méi)有數(shù)據(jù)可作參考，國(guó)內(nèi)目前沒(méi)有牛支原體的疫苗[7]，犢牛也可通過(guò)接觸被感染的母?；蛘弑慌Ｖгw污染的牛乳而造成感染，多殺性巴氏桿菌目前無(wú)可用的商品化疫苗而造成病原的廣泛存在。當(dāng)生活環(huán)境、飼料、氣溫、運(yùn)輸?shù)日T因存在后，致使?fàn)倥Ｃ庖吡档鸵矔?huì)使?fàn)倥８腥九Ｖгw病和多殺性巴氏桿菌病[8]，造成犢牛呼吸系統(tǒng)疾病。各種病原感染后犢牛表現(xiàn)的臨床癥狀沒(méi)有特異性，病程剛開(kāi)始時(shí)，犢牛的臨床表現(xiàn)并不明顯，因此就需要臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員及早發(fā)現(xiàn)，及早治療。

通過(guò)對(duì)6種病原的鑒定和流行情況追蹤，揭示了寧夏固原地區(qū)犢牛目前存在多種呼吸道病原感染情況，不同養(yǎng)殖場(chǎng)疾病發(fā)病情況和病原發(fā)病比例不同，但均存在本研究中的6種病原體。研究還發(fā)現(xiàn)，注射過(guò)疫苗的犢牛發(fā)病率逐年降低，因此疫苗可以預(yù)防動(dòng)物疾病的發(fā)生，但是牛支原體和多殺性巴氏桿菌的疫苗國(guó)內(nèi)沒(méi)有商品化的產(chǎn)品，這也為科研人員提供了今后的努力方向。由于沒(méi)有科學(xué)有效的疫苗預(yù)防疾病，發(fā)病后只能使用多種不同種類(lèi)的抗生素治療疾病，因此準(zhǔn)確診斷疾病發(fā)生的原因，并給出科學(xué)的治療方案十分重要。在養(yǎng)殖過(guò)程中，負(fù)責(zé)人員應(yīng)注重犢牛健康培育，從飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)、疫病的預(yù)防、疾病的早期診斷和治療等方面建立一套適合本養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境的犢牛培育及健康養(yǎng)殖技術(shù)體系，進(jìn)而減少犢牛疾病的發(fā)病率和死淘率，保證基層肉牛養(yǎng)殖高效、健康發(fā)展[1,9]；基層獸醫(yī)工作者也要經(jīng)常參加培訓(xùn)，提高自身的理論知識(shí)，在工作中才能更早更準(zhǔn)確的診斷出使何種疾病，對(duì)癥下藥，科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠盟幰部梢越档筒≡哪退幮訹10]。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)2019—2021年固原2個(gè)肉牛養(yǎng)殖區(qū)造成犢牛呼吸道疾病6種主要病原的發(fā)病率開(kāi)展病原學(xué)研究。2019—2021年楊坪村犢牛呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，但不同年份間差異不顯著(P>0.05)；馬溝村犢牛呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率呈下降趨勢(shì)，2021年與2019年相比差異顯著(P<0.05)。2019—2021年，病毒性呼吸道疾病呈下降趨勢(shì)，而牛支原體和多殺性巴氏桿菌由于沒(méi)有有效的疫苗預(yù)防而呈現(xiàn)較高的陽(yáng)性率。牛支原體和多殺性巴氏桿菌為目前犢牛主要的呼吸道致病病原，做好牛支原體病和多殺性巴氏桿菌病的預(yù)防、早期診斷和治療可有效降低犢牛呼吸道疾病的發(fā)病率。