王立斌,王強(qiáng)龍,潘陽陽,楊珊珊,崔 燕,余四九
(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心,蘭州 730070)
牦牛(Bos grunniens)是青藏高原特有的物種,具有許多珍貴的生物學(xué)特性,生活在海拔3 000 m~5 500 m高寒低氧地區(qū),能夠適應(yīng)惡劣的自然環(huán)境[1,2],素有“高原之舟”的美譽(yù),與藏區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和藏民生活質(zhì)量息息相關(guān)。但是,牦牛是季節(jié)性繁殖生產(chǎn)動物,2年1胎或3年2胎,繁殖力低下[3]。輸卵管是雌性牦牛生殖系統(tǒng)高度活躍的分泌器官,對卵巢激素水平的變化極其敏感,在牦牛生殖周期中雌激素和孕激素的含量呈規(guī)律性波動,輸卵管上皮細(xì)胞和分泌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能隨之發(fā)生相應(yīng)的周期變化[4]。輸卵管上皮細(xì)胞(epithelial cells of oviduct,ECO)及其分泌物與卵母細(xì)胞成熟、精子儲存與獲能、精卵融合以及早期胚胎發(fā)育密切相關(guān)[5-7]。在哺乳動物發(fā)情周期不同階段,輸卵管發(fā)生一系列變化,輸卵管上皮細(xì)胞物質(zhì)代謝異?;钴S,為受精創(chuàng)造適宜的生理環(huán)境。
地西泮結(jié)合抑制因子(diazepam binding inhibitor,DBI)是參與?;o酶A(Acyl-CoA)轉(zhuǎn)運(yùn)的胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白,又稱酰基輔酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA-binding protein,ACBP)[8],與中、長鏈?;o酶A(Acyl-CoA)具有高親和力,在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)其轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存,可用于磷脂、甘油酯和膽固醇的合成[9]、類固醇激素的代謝調(diào)節(jié),也參與介導(dǎo)高度專門化的調(diào)節(jié)過程,如胰島素分泌[10]、炎癥[11]或細(xì)胞凋亡[12]。DBI是一種廣泛分布的10KDa的細(xì)胞質(zhì)蛋白,在肝臟、脂肪組織、腎臟、心臟、大腦、腸道、骨骼肌、乳腺[13]、紅細(xì)胞[14]、睪丸、卵巢、肺臟和脾臟[15-16]均表達(dá)。DBI在腎上腺皮質(zhì)和睪丸類固醇產(chǎn)生細(xì)胞中,以及在專門分泌水和電解質(zhì)運(yùn)送的上皮細(xì)胞中含量高,而這些部位都以高能量代謝為特征[17]。DBI作為高度保守蛋白,在脂質(zhì)代謝活躍的組織表達(dá)水平更高,如肝臟和脂肪組織[18],作為Acyl-CoA的轉(zhuǎn)運(yùn)體,DBI能夠參與線粒體中β-氧化的進(jìn)程或微粒體中甘油酯的合成[19-20]。為細(xì)胞物質(zhì)代謝提供能量,保障細(xì)胞的正常生長增殖。研究表明,DBI缺失小鼠植入前的早期胚胎致死率與DBI在預(yù)防LCFA-CoAs對參與能量生產(chǎn)和脂肪酸生物合成的敏感酶有害影響的重要性一致,說明DBI是一個缺失導(dǎo)致胚胎致死的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)結(jié)合蛋白[21]。
哺乳動物的許多生殖功能受到卵巢分泌的雌二醇(E2)和孕酮(P4)調(diào)節(jié)。雌激素(Estrogen,E2)是動物體內(nèi)極其重要的生殖激素,在動物發(fā)情、泌乳、分娩等生理活動中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明,雌激素可通過細(xì)胞膜上的受體(membrane estrogen receptor,MER)介導(dǎo)或受體直接作用于膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶的生物活性,從而發(fā)揮生物學(xué)作用。E2對輸卵管發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用,可以促進(jìn)輸卵管上皮細(xì)胞增生,加強(qiáng)輸卵管節(jié)律性收縮的幅度,加速卵子在其中的前進(jìn)速度,能夠縮短精卵相遇的時間[4]。因此,研究高原地區(qū)牦牛輸卵管上皮細(xì)胞受外源細(xì)胞因子作用對DBI表達(dá)的影響,能夠?yàn)槟冈醇?xì)胞因子調(diào)控輸卵管上皮細(xì)胞物質(zhì)代謝提供理論依據(jù)。本研究擬通過輸卵管上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)與鑒定,優(yōu)化ECO體外培養(yǎng)體系;為探索外源添加17 β-雌二醇對輸卵管上皮細(xì)胞DBI表達(dá)的影響,尋求17 β-雌二醇誘導(dǎo)DBI表達(dá)的最佳條件,為揭示母源細(xì)胞因子調(diào)控ECO物質(zhì)代謝提供理論參考。
DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,F(xiàn)BS)購自Gibco公司、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素、鏈霉素購自于美國Gibco公司;胰蛋白酶、FGF-10購自美國Sigma公司;Transzol購自全式金(Transgen)公司;Go ScriptTM Reverse Transcription System購自Promega公司、Taq PCR Master Mix、StarPrep Gel Extraction Kit購自GenStar公司、SYBR Premix Dimer EraserTM(2×)、SYBR GreenⅡ熒光定量PCR試劑盒購自美國OMEGA生物公司,DAPI及蛋白免疫印跡所用試劑均購買于北京索萊寶生物公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。
在青海省西寧市定點(diǎn)屠宰場采集健康牦牛正常發(fā)育的輸卵管,置于37 ℃預(yù)熱的含有雙抗(100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)的生理鹽水中,3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。立即用生理鹽水清洗3次,在超凈工作臺用無菌剪刀去除漿膜、結(jié)締組織和脂肪組織,縱向剪開輸卵管,用37 ℃的PBS(含雙抗)清洗3次,再用37 ℃的0.25%胰酶+0.02% EDTA消化20 min,加入含有15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化,用無菌的載玻片刮取輸卵管上皮細(xì)胞,反復(fù)吹打成單細(xì)胞懸液,通過差速貼壁法(1 500 r/min離心8 min)獲取純度較高的ECO,用含有雙抗的PBS洗滌3次,1 500 r/min離心8 min,棄上清,加入含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù)后調(diào)整密度至2×105/mL接種于25 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),間隔36 h更換培養(yǎng)液。
原代細(xì)胞生長至90%左右,棄去全培,PBS清洗2次,用0.25%胰酶消化處理,在倒置顯微鏡下觀察,加入含有10% FBS的培養(yǎng)液進(jìn)行終止,1 500 r/min離心10 min,吹打成單細(xì)胞懸液,以4×105個/mL接種于新的培養(yǎng)瓶,定期更換培養(yǎng)液。
采用免疫熒光化學(xué)方法鑒定牦牛輸卵管上皮細(xì)胞上的角蛋白18受體(CK-18R)、波形蛋白受體(Vimentin R)。0.25%胰酶消化原代輸卵管上皮細(xì)胞,用PBS清洗3次,制成細(xì)胞懸液,將4×105個/mL細(xì)胞懸液接種到放有蓋玻片的六孔板中,溫箱培養(yǎng)24 h,細(xì)胞貼壁,取出爬片,PBS清洗3次,每次3 min,4%多聚甲醛固定,洗滌后加入含有0.1% TritonX-100室溫透化細(xì)胞1 h,PBS清洗3次,每次5 min,用BSA進(jìn)行2 h室溫封閉,棄去封閉液,分別加入CK-18R抗體(1∶200)、VimentinR抗體(1∶200),37 ℃孵育2 h,PBS清洗3次,每次5 min,用FITC標(biāo)記的二抗(1∶200)孵育1 h,PBS洗滌后,用DAPI染色液染核3 min,清洗3次后用抗熒光淬滅劑封片,在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的輸卵管上皮細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化2 min,鏡下觀察待細(xì)胞全部消化,迅速終止消化,吹打混勻后離心(轉(zhuǎn)速1 500 r/min,8 min),PBS清洗2次,制成細(xì)胞懸液并進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞懸浮液濃度依次稀釋為1×104、3×104、5×104、7×104、9×104個/mL,各濃度梯度均吸取100 μL加入到96孔板中,每個密度設(shè)置4個復(fù)孔,在37 ℃,5% CO2的條件下培養(yǎng)6 h,鏡下觀察使細(xì)胞完全貼壁,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS清洗3次,每次3 min,之后向每個孔內(nèi)添加90 μL DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑混合液,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱3 h,在490 nm波長測吸光度(OD),以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)建立輸卵管上皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
繪制輸卵管上皮細(xì)胞生長曲線,將上述輸卵管上皮細(xì)胞按細(xì)胞密度為0.5×104個/mL接種到96孔板中,每個孔內(nèi)加100 μL細(xì)胞懸浮液,將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱3 h后,鏡下觀察細(xì)胞完全貼壁后,選擇其中4個孔棄去培養(yǎng)液,PBS清洗2次,加入90 μL DMEM/F12培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑混合液,培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測OD值,其余孔棄培養(yǎng)液,PBS清洗2次,加入100 μL含有胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,24 h后選擇4孔重復(fù)上述操作,連續(xù)測8 d,以培養(yǎng)天數(shù)(Day)為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)量(個)為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。
牦牛輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)至第3代對數(shù)生長期時,加入含有0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化,在培養(yǎng)液中調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×105個/mL,再將輸卵管上皮細(xì)胞傳代到6孔板,每孔含有2 mL細(xì)胞懸液,然后根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)做以下處理:添加不同濃度17β-E2對其進(jìn)行處理,分別加入1×10-6,1×10-7,1×10-8,1×10-9,1×10-10mol/L的17β-E2到細(xì)胞培養(yǎng)液,同時設(shè)置空白對照組(0 mol/L 17β-E2)每個處理組3個重復(fù),分別培養(yǎng)0,6,12,24,48,72 h后,分別提取細(xì)胞總RNA和蛋白質(zhì)。
將17β-E2處理后的輸卵管上皮細(xì)胞用PBS清洗3遍,參照貼壁細(xì)胞總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA,并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,置于-20 ℃保存。
參照(黃成渝)DBI的引物序列,由上海生工生物公司合成。引物信息見表1。反應(yīng)體系20 μL:2 μL cDNA模板,上、下游引物各0.5 μL,2×SYBR GreenⅡ PCR mix 10 μL,ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性 15 s,94 ℃預(yù)變性10 s,退火15 s、72 ℃延伸10 s,共35個循環(huán)。程序運(yùn)行結(jié)束后,保存循環(huán)閾值(Ct),利用在線軟件分析擴(kuò)增曲線和熔解曲線。
表1 DBI基因、內(nèi)參基因引物序列
具體操作同1.4牦牛輸卵管上皮細(xì)胞鑒定,目的一抗為DBI(1∶100稀釋),其它操作相同。
采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,每組至少重復(fù)3次。P>0.05表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著,所有結(jié)果以“X±SE”表示。
細(xì)胞免疫熒光檢測到牦牛輸卵管上皮細(xì)胞CK-18R陽性率>90%(圖1),分離的輸卵管上皮細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
輸卵管上皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶培養(yǎng)第2天有少量貼壁,到第4天貼壁良好,細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形,細(xì)胞核圓而大,邊界清晰,排列較為緊密,ECO呈鋪路石樣外觀,培養(yǎng)至第6天輸卵管上皮細(xì)胞生長良好,只出現(xiàn)個別死細(xì)胞,形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰可辨,細(xì)胞呈多角形,表現(xiàn)為“鋪路石”樣,細(xì)胞生長融合度達(dá)到80%,培養(yǎng)至第8天細(xì)胞數(shù)量增加,接觸抑制明顯(圖2)。
以輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo),當(dāng)天細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長曲線,基本上呈“S”形(圖3)。接種細(xì)胞后,第1-2天為緩慢生長的潛伏期,第3-6天為快速生長的對數(shù)期,第7-8天細(xì)胞生長緩慢,進(jìn)入平臺期。結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)的牦牛輸卵管上皮細(xì)胞具有正常細(xì)胞的分裂增殖特性,符合細(xì)胞生長的規(guī)律。
不同濃度17 β-雌二醇作用于培養(yǎng)至第3代的牦牛輸卵管上皮細(xì)胞,檢測發(fā)現(xiàn):17 β-雌二醇對牦牛輸卵管上皮細(xì)胞DBI mRNA的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。隨著17 β-雌二醇濃度的減小,試管組輸卵管上皮細(xì)胞中DB的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,10-7mol/L處理組DBI表達(dá)水平顯著(P<0.05)高于其他處理組(圖4)。
10-7mol/L 17 β-雌二醇作用于培養(yǎng)至第3代的牦牛輸卵管上皮細(xì)胞,檢測發(fā)現(xiàn):隨著處理時間的不同,17 β-雌二醇對牦牛輸卵管上皮細(xì)胞DBI mRNA的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用。隨著時間延長,DBI的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在處理6 h之后,DBI表達(dá)水平顯著(P<0.05)高于其他處理組(圖5)。
對不同處理組輸卵管上皮細(xì)胞用DBI蛋白進(jìn)行免疫標(biāo)記(圖6),熒光檢測顯示DBI在牦牛輸卵管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均表達(dá),但其熒光強(qiáng)度明顯高于對照組(0 E2)。
迄今,地西泮結(jié)合抑制因子(DBI)在兔[22]、大鼠[23]、青鳉魚、山羊、檳榔將水牛以及人[24]等物種均有研究,確定其廣泛發(fā)揮生物學(xué)作用。研究表明,DBI與類固醇激素(雌激素、孕激素)合成密切相關(guān)。說明17 β-雌二醇在調(diào)節(jié)牦牛輸卵管上皮細(xì)胞DBI表達(dá)的過程中具有重要作用。本試驗(yàn)成功建立高質(zhì)量的牦牛輸卵管上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系,構(gòu)建ECO生長曲線;并且外源添加不同濃度的17 β-雌二醇,檢測其對DBI表達(dá)的影響。
輸卵管在人類生殖生理過程中具有重要地位,隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展,有關(guān)ECO的形態(tài)及功能研究已經(jīng)成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[25-26],但動物體內(nèi)的研究受到諸多限制,體外培養(yǎng)ECO是一種理想的研究模型,ECO最普遍的應(yīng)用就是作為胚胎體外發(fā)育的飼養(yǎng)層細(xì)胞[27]。目前,體外建立ECO模型已經(jīng)在人[26,28]、水牛[29]、鼠[30]等物種相對成熟,在輸卵管上皮細(xì)胞與早期胚胎共培養(yǎng)過程中,共培養(yǎng)細(xì)胞可以分泌對早期胚胎發(fā)育有利的物質(zhì),如生長因子、糖蛋白、氨基酸、丙酮酸等,從而有效促進(jìn)胚胎發(fā)育;另外,共培養(yǎng)體系可以通過代謝途徑,去除培養(yǎng)環(huán)境中早期胚胎發(fā)育不利的物質(zhì)、如重金屬二價陽離子、葡萄糖、次黃嘌呤等,能夠?qū)ε咛テ鸬奖Wo(hù)作用[32]。但在牦牛輔助生殖方面還沒有形成完整的體系,因此,本試驗(yàn)建立了牦牛輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)純化方法,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)鑒定,為牦牛ECO的功能研究奠定基礎(chǔ)。本研究用37 ℃的0.25%胰酶+0.02% EDTA消化20 min,消化效果明顯,也避免了細(xì)胞受到損傷,原代細(xì)胞貼壁良好。用無菌的載玻片刮取輸卵管上皮細(xì)胞,得到的上皮細(xì)胞純度更高,后期細(xì)胞培養(yǎng)選擇高濃度胎牛血清有利于上皮細(xì)胞的快速生長增殖。
qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著17 β-雌二醇濃度的增大,DBI的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,10-7mol/L處理組DBI 表達(dá)水平顯著(P<0.05)高于其他處理組;當(dāng)濃度一定時,隨著17 β-雌二醇作用時間延長,DBI的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在17 β-雌二醇作用6 h的處理組,DBI 表達(dá)水平顯著(P<0.05)高于其他處理組。由此表明,17 β-雌二醇對輸卵管上皮細(xì)胞的DBI的表達(dá)具有明顯的調(diào)節(jié)作用,而且與雌激素濃度有密切關(guān)系,隨著時間的延長,DBI的表達(dá)量具有明顯的變化。在研究E2對牦牛ECO中DBI表達(dá)影響過程中,E2對ECO中DBI表達(dá)在6 h起促進(jìn)作用,說明雌激素與細(xì)胞表面受體結(jié)合以后,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激發(fā)ECO的生物學(xué)效應(yīng),從而改變了DBI的表達(dá)。提示輸卵管上皮細(xì)胞中DBI的表達(dá)可能受到激素的調(diào)節(jié),尤其和雌激素關(guān)系密切。由于DBI和類固醇激素合成、脂肪酸代謝密切相關(guān),雌激素能促進(jìn)DBI的表達(dá),有助于提高ECO脂肪酸代謝。細(xì)胞間相互識別、相互反應(yīng)和相互作用,才能保障生物體內(nèi)部機(jī)能的協(xié)調(diào)統(tǒng)一,不同的細(xì)胞通訊信號分子,能將外源信號轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞內(nèi)部各分子功能上的變化,從而對代謝過程產(chǎn)生影響,如細(xì)胞增殖、分化以及凋亡。隨著時間延長,17 β-雌二醇誘導(dǎo)DBI表達(dá)有所減弱,這可能與不同時間雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中雌激素核受體途徑與膜受體途徑主導(dǎo)作用的改變而引起。探索母源細(xì)胞因子對機(jī)體生長、發(fā)育和代謝的調(diào)控機(jī)理極為重要。