趙 豐 鄧楹君 陳亞洲 高慶和 郭 俊 王 浩 任 凱 郭 軍

中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院男科（北京 100091）

“異病同治”[1]指在中醫(yī)學(xué)上不同的疾病在其發(fā)生和發(fā)展過程中出現(xiàn)了相同病機(jī)，從而采用同樣方法加以治療的法則，是中醫(yī)學(xué)辨證論治的精髓之一，被廣泛用于臨床診療中?！爱惒　钡幕A(chǔ)是病機(jī)相同，濕熱下注是泌尿系疾病的主要證型之一，以小便頻數(shù)、淋漓澀痛、尿液混濁、尿道滴白、會陰脹痛、大便粘滯，舌紅苔黃膩，脈滑數(shù)等為主要表現(xiàn)。慢性前列腺炎癥（chronic prostatitis，CP）和良性前列腺增生癥（Benign Prostate Hyperplasia，BPH）同為泌尿男科的常見病，根據(jù)多項(xiàng)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，濕熱下注證是CP和BPH的主要證型之一[2-5]。

“同治”是治法相同，以方類證就是“異病同治”的體現(xiàn)。寧泌泰膠囊是由貴陽新天藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的專利苗藥，臨床應(yīng)用多年，廣泛應(yīng)用于慢性前列腺炎、良性前列腺增生癥、尿路感染等中醫(yī)辨證為濕熱下注證的泌尿生殖系統(tǒng)疾病[6-7]。近年來在中藥治療CP領(lǐng)域，圍繞寧泌泰展開的研究已成為熱點(diǎn)[8]。寧泌泰對濕熱下注證CP和BPH具有顯著優(yōu)勢，是中醫(yī)理論“異病同治”的體現(xiàn)，但寧泌泰治療二者的具體作用機(jī)制目前尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對寧泌泰膠囊的藥物成分、靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系和潛在通路進(jìn)行研究，預(yù)測其治療CP和BPH的相關(guān)機(jī)制，為后續(xù)寧泌泰膠囊對CP與BPH的治療以及寧泌泰膠囊的進(jìn)一步研究提供參考。

材料與方法

一、寧泌泰膠囊活性成分和靶點(diǎn)的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）[9]和中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMANTCM）檢索寧泌泰膠囊組成藥物（四季紅、大風(fēng)藤、白茅根、連翹、三顆針、仙鶴草、木芙蓉葉）。設(shè)置TCMSP的檢索條件為藥物口服生物利用度（OB）≥30%、藥物相似性（DL）≥0.18，將BATMAN-TCM中檢索到的活性成分輸入TCMSP中以同樣檢索條件進(jìn)行篩選。同時(shí)檢索相關(guān)文獻(xiàn)，將文獻(xiàn)中明確報(bào)道的但未在二者數(shù)據(jù)庫中檢索到或未達(dá)到OB、DL要求的活性成分也納入本研究。在TCMSP中得到每個(gè)成分的作用靶點(diǎn)，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將名稱規(guī)范化并去重。

二、疾病靶點(diǎn)的收集和共有靶點(diǎn)的獲取

以“chronic prostatitis”和“Benign Prostate Hyperplasia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards[10]、OMIM[11]和Disgenet[12]數(shù)據(jù)庫搜索相關(guān)疾病靶點(diǎn)，其中在GeneCards數(shù)據(jù)庫以相關(guān)性評分（Relevance score）的中位數(shù)為卡值，去重后獲得與CP和BPH的疾病靶點(diǎn)。利用維恩圖制作工具將三者的靶點(diǎn)進(jìn)行交集處理，獲得的結(jié)果即為寧泌泰治療CP和BPH的共同有效靶點(diǎn)。將上述數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape[13]中進(jìn)行“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”互作可視化網(wǎng)絡(luò)繪制，并獲取該網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋽?shù)據(jù)。

三、蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)處理與核心靶點(diǎn)篩選

將共有靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫，限定物種為“人”進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，取綜合評分＞0.4分的結(jié)果，在Cytoscape軟件中進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)處理，以度值（Degree）、接近中心性（closeness centrality，CC）和介度中心性（Betweeness centrality，BC）等參數(shù)為卡值，篩選出寧泌泰治療CP和BPH的核心靶點(diǎn)。

四、共有靶點(diǎn)的功能注釋

將共有靶點(diǎn)輸入metascape[14]數(shù)據(jù)庫中，以“人”為限定物種，進(jìn)行基因本體論（Gene ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，以獲得GO的生物過程（Biological Processes，BP）、分子功能（Molecular Functions，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）和KEGG通路，設(shè)定P≤0.01進(jìn)行篩選和排序。

五、分子對接驗(yàn)證

利用PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://www.Pdb.org/）下載PPI排名前3的核心靶點(diǎn)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，在Pubchem數(shù)據(jù)庫中下載Degree最高的3個(gè)活性成分的3D結(jié)構(gòu)，將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Autodock4.2.6軟件，對活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。

結(jié) 果

一、寧泌泰膠囊活性成分和靶點(diǎn)

通過篩選及文獻(xiàn)校對[15-17]，共納入47個(gè)寧泌泰膠囊的活性成分，包括大風(fēng)藤6個(gè)、白茅根4個(gè)、連翹18個(gè)、木芙蓉葉10個(gè)、三顆針6個(gè)、四季紅11個(gè)、仙鶴草6個(gè)；對應(yīng)靶點(diǎn)280個(gè)，其中來自大風(fēng)藤58個(gè)、白茅根58個(gè)、連翹211個(gè)、木芙蓉葉189個(gè)、三顆針66個(gè)、四季紅179個(gè)、仙鶴草172個(gè)，見表1。

表1 寧泌泰的活性成分相關(guān)信息

二、疾病靶點(diǎn)及共有靶點(diǎn)

研究共獲得CP疾病靶點(diǎn)2259個(gè)，BPH疾病靶點(diǎn)2341個(gè)，將寧泌泰、CP、BPH三者靶點(diǎn)取交集如圖2，最終獲得1445個(gè)CP和BPH的共有靶點(diǎn)，占所有靶點(diǎn)總和的44.87%，這可能是CP和BPH“異病同治”的基礎(chǔ)，獲得168個(gè)寧泌泰治療CP與BPH的共同有效靶點(diǎn)，占所有靶點(diǎn)總和的5.22%，見圖1。

圖1 寧泌泰活性成分與疾病靶點(diǎn)維恩圖

三、寧泌泰“異病同治”治療CP和BPH網(wǎng)絡(luò)可視化

“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖如圖2，其中寧泌泰的七味藥都具有較高節(jié)點(diǎn)度（degree）；所有活性成分的節(jié)點(diǎn)度都高于2，其中以槲皮素（MOL000098）、 山 奈 酚 （MOL000422）、β谷 甾 醇（MOL000358）、木犀草素（MOL000006）的節(jié)點(diǎn)度最高，均超過100；靶點(diǎn)中degree排名較靠前的有PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AA1、ADRB2、PPARG、TOP2A、ADRA1B、AR等。

圖2 寧泌泰基于“異病同治”的“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

四、PPI及核心靶點(diǎn)篩選

PPI分析共得到797對綜合評分≥0.9的蛋白互作數(shù)據(jù)，導(dǎo)入cytoscape軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，分別以degree的二倍中位數(shù)和degree、BC、CC的中位數(shù)為卡值，獲得一個(gè)包含10個(gè)節(jié)點(diǎn)，32條邊的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，這些節(jié)點(diǎn)即為寧泌泰“異病同治”治療CP和BPH的核心靶點(diǎn)，篩選過程見圖3，核心靶點(diǎn)及相關(guān)數(shù)據(jù)見表2。

表2 核心靶點(diǎn)

圖3 核心靶點(diǎn)篩選過程

五、靶點(diǎn)的功能注釋

將168個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入metascape數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行富集分析，選取P值≤0.01的結(jié)果。GO分析共得到248個(gè)BP條目，包括對無機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)（response to inorganic substance）、凋亡信號通路（apoptotic signaling pathway）、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）等，6個(gè)CC條目，包括膜筏（membrane raft）、囊泡腔（vesicle lumen）、蛋白激酶復(fù)合物（protein kinase complex）等；79個(gè)MF條目，包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、激酶結(jié)合（kinase binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等，根據(jù)P值大?。≒≤0.01），用條形圖分別繪制各類P值前10的條目（圖4）。

圖4 GO分析結(jié)果

KEGG富集分析共獲得138條通路。根據(jù)P值（P≤0.01）篩選排序靠前的信號通路通路有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications，以及PI3KAkt、IL-17、TNF、HIF-1、foxo等信號通路，主要與腫瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫炎癥以及缺氧應(yīng)激等有關(guān)。而其后的VEGF，P53，PPAR信號通路則與血管內(nèi)皮細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)。對前20條信號通路以氣泡圖展示（見圖5）。

圖5 KEGG分析結(jié)果

六、分子對接

將排名前3的關(guān)鍵化合物和PPI中排名前3的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接結(jié)果見表3。結(jié)合能（affinity）越小說明對接效果越好，affinity＜-7表示具有良好的結(jié)合性。

表3 分子對接結(jié)果

選擇結(jié)合能最好的前組對接結(jié)果進(jìn)行展示，見圖6。圖6（A）顯示beta-sitosterol與SRC結(jié)合情況，圖6（B）顯示kaempferol與AKT1結(jié)合情況；圖6（C）kaempferol與TP53結(jié)合情況。

圖6 分子對接結(jié)果圖示

討 論

濕熱下注證是CP和BPH的常見證型，濕為陰邪，其性重濁黏滯，易襲下焦；熱為陽邪，易耗傷津液，二者合而為病，病程遷延不愈。濕熱下注膀胱，則膀胱氣化不利，可致尿頻、尿濁、尿痛；精室以通為用，精室濕熱，則見尿頻尿急，小便短赤；濕熱阻滯精道，引起精液粘稠不液化；濕熱結(jié)于陰器，則陰部瘙癢或陰囊潮濕異味[18]。多項(xiàng)研究表明，寧泌泰可明顯改善濕熱下注證CP所引起的下尿路癥狀[19]，并可明顯緩解疼痛，提高生活質(zhì)量評分，安全有效[20-21]。在治療BPH方面，臨床研究顯示在服用寧泌泰治療后患者IPSS評分明顯下降，Qmax明顯提高[22]；在另一項(xiàng)研究中，寧泌泰對尿路刺激癥狀的緩解更明顯，且在降低生活質(zhì)量指數(shù)（QOL）評分方面比對照藥物更優(yōu)[23]。方中四季紅清熱利濕、利尿通淋、解毒散瘀，為君藥；白茅根甘寒，清熱利尿、涼血止血，大風(fēng)藤利水消腫、祛風(fēng)止痛，連翹清熱涼血、活血解毒，三藥合用，俱為臣藥；三顆針清熱、利濕、散瘀，仙鶴草收斂止血、解毒、補(bǔ)虛，佐助君臣，共為佐藥；木芙蓉葉清熱、解毒、消腫，助諸藥以增效；全方清熱解毒、利濕通淋、養(yǎng)陰止血，且利濕而不傷陰、驅(qū)邪而不傷正。適用于濕熱下注型的CP和BPH患者[24-25]。

本研究篩選得到寧泌泰膠囊活性成分47個(gè)，靶點(diǎn)280個(gè)，CP疾病靶點(diǎn)2259個(gè)，BPH疾病靶點(diǎn)2341個(gè)，體現(xiàn)了寧泌泰治療CP和BPH具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。從圖3可看出，寧泌泰組成的七味藥都具有較高節(jié)點(diǎn)度，活性成分中槲皮素、山奈酚、β谷甾醇、木犀草素的節(jié)點(diǎn)度最高，提示可能在治療CP和BPH上發(fā)揮了更大的作用。槲皮素與山奈酚同屬于天然黃酮類化合物，二者都具有良好的抗炎、抗氧化作用[26-27]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素可改善Ⅲ型慢性前列腺炎模型大鼠的前列腺病理和痛覺敏感性，并可降低大鼠血清中NFκB及TNF-α水平以及前列腺組織中的COX-2蛋白水平，說明槲皮素可能通過降低炎性因子表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)來治療CP[28]。山奈酚能夠減弱促炎因子（如IL-6、IL-17A、TNF-α）的CD3+T細(xì)胞浸潤及基因表達(dá)[29-30]。BPH方面，臨床試驗(yàn)表明，使用槲皮素干預(yù)后，BPH患者AUA癥狀評分明顯降低，并提升尿流率[31]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，山奈酚表現(xiàn)出類似雄激素的活性，抑制雙氫睪酮誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞（LNCaP）、人前列腺增生細(xì)胞（BPH-1）和人前列腺基質(zhì)永生化細(xì)胞（WPMY-1）的雄激素受體轉(zhuǎn)錄活性、前列腺特異抗原（PSA）和雄激素受體（AR）基因表達(dá)以及細(xì)胞增殖；持續(xù)降低BPH大鼠前列腺指數(shù)，改善BPH大鼠的病理變化，使BPH大鼠血清中上調(diào)的T水平顯著降低[32]。β-谷甾醇屬植物甾醇，有降血脂、抗炎、抗腫瘤的作用。研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇對維持男性前列腺健康的功能具有重要作用[33]。在一項(xiàng)治療BPH的多中心研究中，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇治療組的Boyarsky評分顯著下降，最大尿流率提升，殘余尿量減少[34]。

PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，寧泌泰膠囊的活性成分主要通過 如 蛋 白 激 酶 相 關(guān) 受 體（AKT1、MAPK1、MAPK8、MAPK14）、炎癥相關(guān)受體（TNF、IL-6、IL-1B、ALB）、生長因子相關(guān)受體（SRC、EGFR、KDR）、性激素受體（AR、ESR1）、癌癥相關(guān)因子（TP53、FOS、CCND1）等核心靶點(diǎn)對于治療CP和BPH發(fā)揮作用。AKT1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞，包括促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、吞噬、自噬并維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)[35]。AKT1的過表達(dá)和前列腺體積的增大具有一定關(guān)聯(lián)[36]。IL-6是主要的抗炎性細(xì)胞因子，能夠抑制促炎因子的產(chǎn)生，研究報(bào)道CP患者的免疫應(yīng)答中，IL-6誘導(dǎo)T、B細(xì)胞分化和增殖[37]。持續(xù)、頑固性炎癥被認(rèn)為在BPH發(fā)病和疾病進(jìn)展中占主導(dǎo)地位，表現(xiàn)為多種細(xì)胞因子和生長因子的分泌，這些因子可促進(jìn)前列腺細(xì)胞的生長[38]。IL-6等促炎癥因子是BPH發(fā)病的重要因素之一，其所導(dǎo)致的慢性炎癥反應(yīng)對整個(gè)發(fā)病進(jìn)程起到重要促進(jìn)作用[39]。因此預(yù)測AKT1、IL-6是寧泌泰“異病同治”治療CP和BPH的核心靶點(diǎn)。

目前公認(rèn)的BPH主要發(fā)病機(jī)制主要集中于α-腎上腺素能受體誘導(dǎo)的自主神經(jīng)過度活動(dòng)和雄激素刺激前列腺組織細(xì)胞生長。AR可被雄激素激活，調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，從而引起前列腺的異常增殖；研究發(fā)現(xiàn)，BPH的前列腺組織中ERα、AR的蛋白及mRNA表達(dá)相比正常前列腺組織顯著增高[40]，調(diào)節(jié)雌/雄激素的比例可影響前列腺基質(zhì)細(xì)胞的增殖和凋亡。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，炎癥相關(guān)因子TNF、IL-6、IL-1B等靶點(diǎn)具有較高度值，多項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用寧泌泰治療后，CP患者的不適癥狀減輕，并伴隨前列腺液中TNF-α、IL-1β等指標(biāo)顯著下降[41-42]。根據(jù)研究結(jié)果，推測寧泌泰可能通過調(diào)節(jié)AR、ESR1、TNF、IL-1B等靶點(diǎn)分別治療CP和BPH。

GO分析結(jié)果顯示，寧泌泰膠囊可能通過對類固醇反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激酶活性、凋亡信號通路和信號受體的調(diào)節(jié)來發(fā)揮治療CP和BPH的作用。結(jié)合KEGG富集分析結(jié)果，PI3K-Akt信號通路可能是寧泌泰治療CP和BPH的共同作用通路。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種過程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，去勢聯(lián)合丙酸睪酮注射方法建立的BPH模型大鼠與正常大鼠相比，前列腺明顯增生，PI3K/Akt/mTOR信號通路顯著激活[43]；另一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，阻斷PI3K/Akt信號通路可抑制前列腺的增生[44]；在BPH患者前列腺組織中，PI3K和AKT的基因表達(dá)水平隨著前列腺體積的增加而增加[45]。PI3K/AKT信號通路還參與多種炎癥反應(yīng)和炎性疼痛的發(fā)生[46-47]，該通路激活后，其下游NF-κB信號通路活化，引起炎癥反應(yīng)[48]，在抑制PI3K/Akt信號通路及其上下游的釋放后，可減輕炎癥痛及神經(jīng)病理性疼痛[49]。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族參與細(xì)胞的生長、分化、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞生理病理過程，其家族中眾多成員均與前列腺相關(guān)疾病有密切聯(lián)系，如MAPK1、MAPK3在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的作用[50]。使用MAPK抑制劑可減少促炎性細(xì)胞因子的合成及信號傳導(dǎo)，從而治療CP[51]。MAPK家族成員ERK1/2在BPH患者前列腺上皮和基質(zhì)組織中呈高表達(dá)[52]。寧泌泰膠囊可能通過PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路對CP和BPH起到治療作用?？赡芡ㄟ^與抑制促炎細(xì)胞因子的合成、抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)前列腺組織細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)雄激素水平等機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在“異病同治”理念的指導(dǎo)下，篩選寧泌泰膠囊的活性成分及作用靶點(diǎn)，預(yù)測寧泌泰膠囊“異病同治”治療CP和BPH的關(guān)鍵靶點(diǎn)與相關(guān)通路，體現(xiàn)了寧泌泰膠囊“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)，研究結(jié)果與當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)的研究成果基本一致，具有較高的參考價(jià)值，為寧泌泰膠囊“異病同治”治療CP和BPH提供思路借鑒，并為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。