李智新 沈嘉銘 徐 健 顏宏利** 李維杰

1.上海理工大學生物系統(tǒng)熱科學研究所（上海 200093）；2.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院（上海 200433）

線粒體是精子細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換和新陳代謝的關(guān)鍵部位，參與精子超激活運動、獲能、頂體反應、調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細胞凋亡等多種生理過程[1，2]。線粒體膜電位（Mitochondrial Membrane Potential,MMP）反映出線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)的情況，是衡量其能量狀態(tài)的指標[3]。精子MMP與其活力密切相關(guān)[4]，此外，MMP似乎與精子受精能力呈正相關(guān)，與DNA碎片呈負相關(guān)[5]。因此，檢測精子MMP對評估男性生育能力以及精子發(fā)生的病理生理學研究具有重要意義。

目前，廣泛使用商業(yè)化熒光探針如：JC-1（C25H27CL4IN4）檢測MMP[6]，基本流程為：取一定量待測精液樣本與JC-1單標試劑混勻，在37℃的CO2培養(yǎng)箱中避光孵育10分鐘后，將樣本上流式細胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，應用熒光通道FL1（綠）和FL2（紅）檢測熒光強度，紅色/綠色熒光強度比例降低代表線粒體去極化。由于在臨床工作中實驗室經(jīng)常將樣本集中起來一起檢測，那精液樣本放置時間和JC-1染色時間對精子MMP的結(jié)果有怎樣的影響？精液冷藏以及添加樣本保護劑能否降低時間對精子MMP的影響？相關(guān)研究極少。為此，本課題組對此進行了初步探討，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、主要試劑和儀器

精子尾部中段染色試劑盒由浙江星博生物科技股份有限公司提供，葡萄糖、甘氨酸、HEPES等均購自Sigma公司（Sigma,America），精子冷凍保護液1067購于ORIGIO公司，所用儀器為BD Accuri C6流式細胞儀。檢測精子MMP時，進樣速度為低速，14μL/min，樣本流直徑10μm；采樣停止條件為采集精子數(shù)5000個；免調(diào)電壓；前向散射光（FSC）熒光強度閾值＞105。

二、樣本保護劑配置

稱取35.6 mg氯化鉀、29.4 mg硫酸鎂、16.2 mg磷酸二氫鉀、1 g葡萄糖、1 g甘氨酸、25 mg二水氯化鈣、476 mg HEPES、210 mg碳酸氫鈉、500 mg血清白蛋白、10 mg維生素C和維生素B12，用滅菌超純水定容至100 mL，調(diào)整pH為7.2，然后用0.22μm濾器過濾后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

三、精液樣本來源

精液樣本來自長海醫(yī)院生殖中心門診，經(jīng)精液常規(guī)分析后剩余樣本。所有研究對象均禁欲2～7 d，手淫法留取標本于無菌取精杯中。

四、精子MMP檢測

（一）檢測原理

JC-1是一種親脂性陽離子熒光染料，在細胞內(nèi)以聚合物和單體兩種不同形式存在。JC-1會在具有高MMP的線粒體中聚集形成聚合物，經(jīng)488 nm激光激發(fā)后產(chǎn)生橙紅色熒光；而在低MMP的線粒體中形成單體時，JC-1經(jīng)488 nm激光激發(fā)后產(chǎn)生綠色熒光，通過流式細胞儀捕捉的紅色和綠色熒光數(shù)目，發(fā)橙紅色熒光精子百分率即為精子MMP。

（二）檢測方法

按“精子尾部中段染色試劑盒”說明書操作，即每個樣本準備對照管和檢測管，分別在其中加5μL精液和20μL試劑A（樣本緩沖液），混勻后，將對照管置于85℃金剛浴中靜置2min，利用高溫使其線粒體失活，之后在室溫下向兩管中分別加入480μL A液、5μL B液（JC-1染色液)，震蕩混勻，置于37℃水浴箱避光孵育15 min后上機檢測。其中對照管為陽性對照組，結(jié)果分析中根據(jù)陽性對照組的雙參數(shù)散點圖中的陽性信號來設(shè)門。采用MMPView軟件進行數(shù)據(jù)分析。

五、精子MMP流式細胞術(shù)檢測的重復性分析

取MMP高、中、低各1例精液樣本，以上述方法重復檢測10次，計算變異系數(shù)（CV）以反映精子MMP流式細胞術(shù)檢測的重復性[7]。

六、樣本放置時間及溫度對精子MMP檢測的影響

隨機收集11例精液樣本，分別于留取標本當日，精液放置室溫下30 min液化后取出1000μL，在檢驗完MMP后，平均分為兩份，分別放置在室溫和2～8℃下冷藏，2 h、4 h、8 h之后，按上述方法進行精子MMP檢測。

七、樣本保護劑對精子MMP檢測的影響

隨機收集9例精液樣本，精液完全液化并搖勻后，每份樣本各吸取1000μL，平均分為兩組：對照組（無保護劑添加）、實驗組（1：1添加保護劑）。之后避光冷藏于2～8℃，待2、4、8 h后取出，按“精子尾部中段染色試劑盒”說明書進行精子MMP檢測。

八、精液樣本冷凍對精子MMP檢測的影響

隨機收集5例精液樣本，平均分為兩組：對照組和實驗組，實驗組按1：1緩慢添加精子冷凍保護劑。之后將兩組都放于-20℃冷凍，1 d后取出，在37℃水浴中搖晃復溫后，按“精子尾部中段染色試劑盒”說明書進行精子MMP檢測。

九、統(tǒng)計學分析

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS Version20（IBM公司）統(tǒng)計軟件分析。各組數(shù)據(jù)先進行正態(tài)分布分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。不同組間比較進行配對t檢驗，P＜0.05為統(tǒng)計學分析具有顯著性差異。

結(jié) 果

一、精子MMP流式細胞術(shù)檢測的重復性評價

高、中、低MMP的精液樣本使用流式細胞術(shù)重復檢測10次，所得CV均低于7%（表1），提示精子MMP流式細胞術(shù)檢測的重復性較好。JC-1流式細胞術(shù)檢測結(jié)果代表性示意圖見圖1。

表1 精子MMP流式細胞術(shù)檢測的重復性評價（±s）

表1 精子MMP流式細胞術(shù)檢測的重復性評價（±s）

Sample n MMP（%） CV（%）高10 65.90±3.25 4.93中10 41.27±2.63 6.37低10 23.29±1.05 4.51

圖1 精子MMP流式細胞圖

二、樣本放置時間及溫度對精子MMP檢測的影響

精液樣本在室溫和2～8℃分別放置30 min、2 h、4 h、8 h后精子MMP檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示樣本隨存放時間的增加，精子MMP呈顯著下降。與放置30 min相比，樣本放置2 h后MMP顯著降低（P＜0.05），4 h、8 h后降低更為明顯。精液樣本于2～8℃冷藏2、4、8 h后，精子MMP隨冷藏時間延長而下降，而與室溫下放置對應時長的樣品相比，MMP下降變緩，但無顯著差異（P＞0.05）。

表2 不同放置時間及溫度下的精子MMP結(jié)果比較(±s)

表2 不同放置時間及溫度下的精子MMP結(jié)果比較(±s)

注：與30 min相比，*P＜0.05；與室溫下2 h相比，#P＜0.05

Placement time and temperature n MMP（%）30 min 11 43.31±15.96室溫下2 h 11 35.44±17.23*室溫下4 h 11 28.74±18.10*#室溫下8 h 11 22.02±20.62*#冷藏2 h 11 36.20±15.01*冷藏4 h 11 30.46±18.94*#冷藏8 h 11 20.13±19.55*#

三、樣本保護劑對精子MMP檢測的影響

精液樣品加入保護劑后放置于2～8℃下2、4、8 h后的精子MMP結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組于2～8℃冷藏2、4、8 h后，精子MMP下降減緩，在2 h內(nèi)MMP不存在顯著變化，但超過4 h后，MMP則會顯著下降（P＜0.05）。

表3 樣品保護劑對精子MMP的影響（n=9）

四、精液樣本冷凍對精子MMP檢測的影響

添加冷凍保護劑的精液樣本在-20℃冷凍1 d后的精子MMP結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，樣本冷凍在-20℃下，即使添加了冷凍保護劑，但復溫后的精子MMP與冷凍前仍存有顯著差異（P＜0.01），說明無法將冷凍后的精子MMP作為室內(nèi)質(zhì)控品。

表4 精液樣本冷凍后精子MMP結(jié)果比較（±s）

表4 精液樣本冷凍后精子MMP結(jié)果比較（±s）

注：實驗組為添加樣本保護劑，對照組則無；組內(nèi)與冷凍前相比，*P＜0.01

Sample n 冷凍前 冷凍后實驗組 5 38.32±11.94 16.23±8.04*對照組 5 39.57±13.25 4.87±2.69

討 論

精子MMP與精子活力、受精潛能及形態(tài)均密切相關(guān)，可以作為臨床評估特發(fā)性男性不育的重要指標，在本質(zhì)上為男性不育的診斷提供重要依據(jù)，故準確檢測精子MMP對了解男性生育能力、男性生殖和輔助生殖的基礎(chǔ)研究及臨床研究的可靠性有重要意義[8，9]。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針，與其它陽離子染料如羅丹明123相比特異性更高，紅綠色熒光強度比率只受線粒體膜電位變化的影響，不受線粒體差異的干擾，基于JC-1染色聯(lián)合流式細胞術(shù)很適合用于臨床常規(guī)的精子MMP測試。在臨床應用中要對精液樣本的MMP進行客觀測量，實現(xiàn)標準化方案至關(guān)重要。首先我們證實了該方案具有較好的重復性，不論樣本MMP值的高低，CV值均低于7%。其次要確定在流式細胞儀檢測前樣本放置條件對MMP結(jié)果的影響，樣品放置不當可能會嚴重改變精子的MMP。

我們觀察到隨著放置時間的延長，精子MMP有顯著下降，特別是在超過2小時以后，雖然其中有部分樣本的變化較小，但在臨床檢驗中還是要在液化后30～60 min內(nèi)完成檢驗，保證檢驗結(jié)果的準確性。這種變化差異可能與病人之間的個體差異以及樣本本身質(zhì)量有關(guān)[10]，在實驗中我們還觀察了染色時間對精子MMP結(jié)果的影響，對于染色時間或染色后放置時間的延長，在40 min內(nèi)精子MMP的結(jié)果不會有顯著變化，提示JC-1染色后檢驗技術(shù)人員可在相對空閑的時間里進行流式細胞術(shù)分析。但需注意的是，反應液應避光放置，且在上流式細胞儀檢測之前應再次充分混勻，否則對檢測結(jié)果可能有顯著影響，推測與精子下沉導致采集精子數(shù)量顯著下降有關(guān)。

為了延緩MMP的變化，我們測試了冷藏及保護劑對樣本的影響，結(jié)果顯示在2～8℃冷藏的精液樣本MMP下降速度略低于室溫放置的樣本，但沒有顯著差異，甚至部分樣品在4℃下MMP下降更快。這可能由于在4℃下精子的代謝能力和活動強度隨著溫度的下降而減弱，呈現(xiàn)出休眠狀態(tài)，但部分樣本精子膜穩(wěn)定性較差，當溫度變化過快時，會對其造成冷應激，致使精子活力下降[11]。當樣本添加保護劑后于4℃下保存，精子MMP下降相對減緩，表明保護劑可以在一定程度下短暫的維持精子質(zhì)量，但是超過2 h后精子MMP仍有顯著降低。這種短暫的延緩作用可能與以下原因相關(guān)，保護劑中的白蛋白可以通過與精子質(zhì)膜磷脂相互作用以降低精子受損程度[12，13]，同時誘導精子蛋白磷酸化，從而維持線粒體膜電位[14，15]。保護劑中的外源葡萄糖為精子代謝提供底物，維持精子活力[16]。其次保護劑中的抗氧化劑可以降低精子細胞內(nèi)的ROS水平，增加細胞的抗氧化能力，進而保護精子細胞的線粒體[17，18]。但隨著時間的延長，精子凋亡水平提高，ROS生成增多，精子蛋白脫磷酸化趨勢逐漸增強，致使精子線粒體受損，使精子MMP呈現(xiàn)顯著的下降趨勢。

為了做好精子MMP室內(nèi)質(zhì)控，本研究意圖使用冷凍精液樣本作為質(zhì)控品，但結(jié)果顯示不論是否添加精子冷凍保護劑，精液樣本凍融后，精子MMP都有顯著下降。這可能是由于凍融過程中冰晶和滲透壓的快速變化，導致線粒體膜流動性改變，致使線粒體膜電位下降[19]。這意味著冷凍后的精液樣本無法作為室內(nèi)質(zhì)控品。對精子MMP檢測的流式細胞術(shù)如何進行質(zhì)控，以及如何確保不同流式細胞儀檢測結(jié)果之間的一致性，是未來要解決的關(guān)鍵問題。