文 斐， 顧 磊， 胡志勇

鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）1.病理科；2.消化內(nèi)科，湖北 黃石 435000

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）作為發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，已成為威脅我國(guó)人群生命安全的主要惡性腫瘤之一［1］。多數(shù)HCC患者在臨床確診時(shí)已不易手術(shù)切除，即使手術(shù)切除，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率依然較高［2-3］。有研究報(bào)道，細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，尤其是膠原纖維交聯(lián)重構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移搭建了平臺(tái)［4］。賴(lài)氨酸羥化酶2（procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2，PLOD2）作為PLOD家族的重要成員，是膠原纖維交聯(lián)重構(gòu)過(guò)程中關(guān)鍵性的催化酶［5］。已有研究報(bào)道，PLOD2可通過(guò)影響膠原纖維交聯(lián)參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［6］。本研究旨在探討PLOD2在HCC組織中的表達(dá)，并觀察HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染PLOD2干擾序列后對(duì)癌細(xì)胞遷移、侵襲的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2017年5月至2019年5月于鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院行手術(shù)治療的93例HCC患者的癌組織及癌旁組織為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未行放化療；病理學(xué)檢查證實(shí)為肝細(xì)胞癌。其中，男性69例，女性24例；平均年齡（58.62±12.41）歲；腫瘤直徑＞5 cm者42例，腫瘤直徑≤5 cm者51例；分化程度：低分化31例，中分化29例，高分化33例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期39例；38例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者均行知情同意。

1.2 主要試劑 兔抗人PLOD2多克隆抗體購(gòu)自上海鈺博公司，免疫組化試劑盒及配套試劑購(gòu)自北京中杉公司，HepG2細(xì)胞購(gòu)自上海信裕生物公司，胎牛血清、青-鏈霉素、RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Trizol總RNA提取試劑盒和Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。由上海美軒生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成目的基因干擾序列及對(duì)照序列。引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 免疫組織化學(xué)法 檢測(cè)PLOD2蛋白表達(dá) 將組織石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，烤片、脫蠟至水，浸入3%過(guò)氧化氫以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，浸入枸櫞酸緩沖液中高溫、高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗3次，10%山羊血清封閉。加入按1：500稀釋后的一抗兔抗人PLOD2抗體，4℃條件下孵育過(guò)夜，滴加二抗，反應(yīng)60 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，陰性對(duì)照組采用PBS替代。顯微鏡下觀察，PLOD2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，根據(jù)染色情況和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分［7-8］；（1）染色情況，無(wú)著色0分，淺黃1分，棕黃2分，黃褐3分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，染色細(xì)胞比例＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，比例≥76%為4分；（3）結(jié)果判定根據(jù)染色情況×陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分，0～2分為陰性（-），評(píng)分≥3分為陽(yáng)性（+）。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，條件：37℃含5% CO2。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×106個(gè)／孔接種于6孔板，過(guò)夜培養(yǎng)。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。（1）PLOD2干擾組，轉(zhuǎn)染PLOD2基因的干擾序列 正 義 鏈：5’-GCUCCAUAUGUCAACCGUA-3’，反 義 鏈：5’-UACGGUUGACAUAUGGAGC-3’；（2）陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列：正義鏈：5’-CCACTAATGTCCAGCGTTT-3’，反 義 鏈：5’-ACAAGTAGCTGATATTGAT-3’；（3）空白組僅加入轉(zhuǎn)染液。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PLOD2 mRNA表達(dá) 取各組培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入裂解液，提取總RNA并檢測(cè)濃度。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，按擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明對(duì)引物擴(kuò)增。引物序列：PLOD2：上 游：5’-ATGGAAATGGACCCACCA-3’，下 游：5’-TGCAGCCATTATCCTGTGTC-3’；β-actin：上游：5’-CCTCATGAAGATCCTCACCGA-3’，下 游：5’-TGCCAATGGTGATGACCTGG-3’。反應(yīng)條件：95℃、2 min，95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，循環(huán)38次，利用2-△△Ct法獲得PLOD2 mRNA在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量［9］。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn) 在6孔板底部劃?rùn)M穿孔的直線，每孔劃5條。取各組細(xì)胞，按5×104個(gè)／孔接種在6孔板，加入含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液。細(xì)胞融合度＞90%時(shí)，垂直于孔板橫線用槍頭劃痕，PBS沖洗，加入無(wú)血清培養(yǎng)液。分別在0 h和24 h時(shí)測(cè)量劃痕寬度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

劃痕愈合率［10］=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）／0 h劃痕寬度×100%

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用不含血清培養(yǎng)液對(duì)Matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋?zhuān)戒佋赥ranswell小室上室，風(fēng)干備用。取各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，密度調(diào)整為2×105個(gè)／ml。Transwell小室上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，將上室中散落的細(xì)胞清除，倒置顯微鏡觀察，計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)量［11-12］，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析及t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLOD2蛋白表達(dá)情況 HCC組織PLOD2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為77.42%（72／93），高于癌旁組織的33.33%（31／93），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖 1 PLOD2蛋白表達(dá)（a.HCC組織； b.癌旁組織；SP×400）

2.2 HCC組織PLOD2蛋白表達(dá)與臨床指標(biāo)相關(guān)性 PLOD2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微血管侵犯有關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 HCC組織中PLOD2蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性

2.3 3組細(xì)胞PLOD2 mRNA表達(dá)量比較 PLOD2干擾組PLOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.22±0.11），低于陰性對(duì)照組的（1.03±0.08）和空白組的（1.00±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。

2.4 3組細(xì)胞細(xì)胞遷移能力比較 PLOD2干擾組24 h時(shí)劃痕愈合率為（43.91%±3.44%），低于陰性對(duì)照組的（60.37%±4.47%）和空白組的（63.17%±6.68%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.5 3組細(xì)胞侵襲能力比較 PLOD2干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)（81.81±4.19）個(gè)，低于陰性對(duì)照組的（133.91±6.72）個(gè)和空白組的（128.11±7.87）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖 2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果（a.PLOD2干擾組0 h；b.陰性對(duì)照組0 h；c.空白組0 h；d.PLOD2干擾組24 h；e.陰性對(duì)照組24 h；f. 空白組24 h）

圖 3 Transwell法檢測(cè)結(jié)果（a.PLOD2干擾組；b.陰性對(duì)照組；c.空白組；200倍）

3 討論

腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移與細(xì)胞周?chē)奈h(huán)境密切相關(guān)［13］。其中，細(xì)胞外基質(zhì)是微環(huán)境的主要構(gòu)成部分，而細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維交聯(lián)增多、硬度增加為腫瘤細(xì)胞快速運(yùn)動(dòng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移搭建了平臺(tái)［14］。在此過(guò)程中，PLOD2是調(diào)控膠原蛋白合成，促進(jìn)膠原纖維交聯(lián)、重構(gòu)的主要賴(lài)氨酸羥化酶［15］。有研究報(bào)道，食管鱗癌組織中PLOD2高表達(dá)，參與了細(xì)胞遷移和侵襲［16］。此外，PLOD2蛋白在腎透明細(xì)胞癌［17］、喉癌［18］、肺腺癌［19］組織中表達(dá)也明顯增多。本研究結(jié)果顯示，PLOD2蛋白在HCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率升高，說(shuō)明HCC組織中PLOD2蛋白高表達(dá)可能與HCC發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析不同臨床指標(biāo)患者PLOD2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PLOD2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率在低分化、Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微血管侵犯的患者癌組織中升高，提示PLOD2蛋白可能與HCC惡性化進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究利用轉(zhuǎn)染PLOD2干擾序列的方法對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行分組處理，結(jié)果顯示，PLOD2干擾組PLOD2 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，說(shuō)明PLOD2干擾組PLOD2基因表達(dá)被成功抑制。有研究報(bào)道，PLOD2驅(qū)動(dòng)IL-6／STAT3信號(hào)通過(guò)激活整合素β1促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［20］。另有研究報(bào)道，PLOD2可能通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲［5］。本研究結(jié)果顯示，PLOD2干擾組24 h時(shí)劃痕愈合率較陰性對(duì)照組和空白組降低，說(shuō)明PLOD2參與了細(xì)胞遷移過(guò)程，抑制細(xì)胞中PLOD2基因表達(dá)可抑制細(xì)胞侵襲。

綜上所述，PLOD2蛋白在HCC組織中呈高表達(dá)，且與惡性進(jìn)展指標(biāo)有關(guān)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和微血管侵犯的組織中表達(dá)明顯升高，下調(diào)PLOD2基因表達(dá)可明顯抑制人肝癌細(xì)胞HepG2遷移和侵襲，但有關(guān)的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究明確。