亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        長鏈非編碼RNA GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞凋亡、遷移及侵襲能力調(diào)控作用

        2022-07-08 11:07:12常旭東李宏宇李謙謙王煜曄劉小毓
        臨床軍醫(yī)雜志 2022年6期
        關(guān)鍵詞:檢測能力

        常旭東, 李宏宇, 陳 江, 馮 吉, 李謙謙, 王煜曄, 高 聰, 劉小毓, 高 飛

        1.錦州醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,遼寧 沈陽 1100162.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016;3.大連醫(yī)科大學,遼寧 大連 116000

        胰腺癌是惡性程度極高的消化道系統(tǒng)腫瘤之一,病死率較高[1]。在全球工業(yè)化國家中,胰腺癌是癌癥死亡的第七大原因[2]。據(jù)GLOBOCAN 2020估計,僅2020年,全球新增胰腺癌患者495 773例,新增胰腺癌死亡患者466 003例[3]。雖然,目前已經(jīng)確定了胰腺癌的一些發(fā)病危險因素,如吸煙、肥胖、糖尿病、遺傳等,但具體發(fā)病原因仍不清楚[4]。其早期無明顯癥狀及體征,不易被察覺,絕大多數(shù)患者就診時通常已經(jīng)是晚期[4-5]。胰腺癌的治療往往是手術(shù)聯(lián)合放療、化療等方式,雖可短暫延長患者的生存期,但總體來看,有效率低,預后較差[6]。5年存活率低至5%~13%[7]。因此,積極探索胰腺癌細胞表型的調(diào)控基因是開發(fā)新的有效治療方法的關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度>200個核苷酸的RNA分子[8]。其中,長鏈非編碼RNA GAS5(lncRNA GAS5)被報道為多種癌癥的腫瘤抑制因子[8-9],但是其對胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-1的表型調(diào)控情況尚不明確。本研究旨在通過探討GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞的凋亡、遷移及侵襲的調(diào)控,為胰腺癌提供潛在的治療靶點?,F(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株AsPC-1購自中國科學院上海細胞庫。細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基(購自上海源培生物科技股份有限公司)中添加10%胎牛血清(購自天津康源生物技術(shù)有限公司),并在80%~90%的融合條件下傳代。所有細胞在5% CO2加濕的環(huán)境中維持在37℃。攜帶GAS5的pcDNA載體(pcDNA-GAS5)由上?;蚧び邢薰荆ㄖ袊?gòu)建,用于構(gòu)建GAS5過表達的胰腺癌細胞系。

        1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 分別將lipo2000 pcDNA3質(zhì)粒(1 μg/μl)和pcDNA3-GAS5質(zhì)粒(1 μg/μl)轉(zhuǎn)染至AsPC-1細胞中,將轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒的AsPC-1細胞組設(shè)為對照組,將轉(zhuǎn)染pcDNA3-GAS5質(zhì)粒的AsPC-1細胞組設(shè)為實驗組,將培養(yǎng)瓶置于37℃、 5%CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后,使用15% FCS 1640的新鮮培養(yǎng)基換液。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)42 h,收集兩組細胞用于后續(xù)實驗。

        1.3 實時定量PCR 根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書,使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)從細胞中提取總RNA。將總RNA應用于cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(applied Biosystems)中 檢 測GAS5 mRNA。使 用SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa)檢測GAS5 mRNA的相對表達,反應條件為95℃預變性5min,95℃變 性15 s,60℃退 火 和 延 伸1 min,40 個 循 環(huán),β-actin作為內(nèi)參。特異性引物GAS5序列為正向5′- 3′:GTATGGTGCTGGGTGCG;反向5′- 3′:TAGGCTTGCTCTTTAGGACTT;β-actin序列為正向5′- 3′:GAAGGTGACAGCAGTCGGTT;反向5′- 3′:AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT,由凱杰企業(yè)管理(上海)有限公司提供。

        1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞,進行AnnexinV/PI染色,具體操作步驟按照PE AnnexinV Apoptosis Detection Kit I說明書進行,并通過FACScanto Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司)檢測細胞的凋亡率。

        1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞,將細胞分別以16 000個/cm2接種至6孔板中,當細胞融合率>90%時,進行劃痕實驗。細胞劃痕后0 h、24 h、48 h,采用Nikon Eclipse Ti-s顯微鏡(日本Nikon公司)觀察并獲取圖像,劃痕區(qū)域面積通過Image J軟件進行測量。

        1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 Transwell上室中加入150 μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司),37℃條件下凝固5 h進行基質(zhì)膠包被。轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞,分別調(diào)整對照組與實驗組細 胞密度 為2×105個/ml,各 取500 μl接種至Transwell上室中。下室加入1 ml含20% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后PBS洗滌Transwell上室,用無水冰甲醇固定30 min,PBS洗滌后,用0.4%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽擦掉上室中未穿過的細胞,采用Nikon Eclipse Ti-s顯微鏡觀察并獲取圖像。

        1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 AsPC-1胰腺癌細胞系轉(zhuǎn)染GAS5基因表達檢測 AsPC-1細胞系轉(zhuǎn)染GFP熒光質(zhì)粒(圖1a),明場條件下和熒光條件下均可見目標GFP蛋白陽性的表達,顯示轉(zhuǎn)染目標質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率良好。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞,以β-actin為內(nèi)參,行PCR檢測。結(jié)果顯示,實驗組的GAS5表達水平明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1b),表明AsPC-1細胞系成功構(gòu)建,pcDNA3-GAS5過表達。

        圖 1 GFP轉(zhuǎn)染及PCR檢測(a.GFP轉(zhuǎn)染AsPC-1,上圖為顯微鏡明場下拍照,下圖為顯微鏡熒光下拍照,顯微鏡倍數(shù)100倍;b.GAS5相對表達量檢測)

        2.2 轉(zhuǎn)染GAS5對AsPC-1細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞,使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒進行凋亡檢測。結(jié)果顯示,對照組與實驗組早期凋亡率分別為(5.1%±2.1%)和(4.8%±2.1%),兩組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);對照組與實驗組晚期凋亡率分別為(6.5%±1.8%)和(6.7%±3.0%),兩組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

        圖 2 不同轉(zhuǎn)染組細胞流式圖凋亡水平[橫坐標為FITC,縱坐標為PE;Q1象限:(AnnexinV-FITC)-/PI+為壞死細胞,Q2象限:(AnnexinV+FITC)+/PI+為晚期凋亡細胞,Q3象限:(AnnexinV-FITC)-/PI-為活細胞,Q4象限:(AnnexinV-FITC)+/PI-為早期凋亡細胞]

        2.3 轉(zhuǎn)染GAS5對AsPC-1細胞遷移能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞進行劃痕實驗,結(jié)果顯示,對照組24 h的相對劃痕面積愈合率為(77.9%±0.5%),高于實驗組的(67.7%±0.4%),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);對照組48 h的相對劃痕面積愈合率為(89.8%±0.6%),高于實驗組的(77.5%±1.1%),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。GAS5可抑制細胞的遷移能力。見圖3。圖3 劃痕實驗檢測GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞遷移能力的影響(a.劃痕實驗檢測對照組與實驗組細胞的遷移能力;b.對照組與實驗組細胞相對劃痕面積愈合百分率)

        2.4 轉(zhuǎn)染GAS5對AsPC-1細胞侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞進行侵襲實驗,結(jié)果顯示,對照組侵襲細胞數(shù)為(535±28),高于實驗組的(314±21),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較,實驗組可明顯抑制細胞的侵襲能力。見圖4。

        圖 4 GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞侵襲能力的影響(a.Transwell檢測實驗組和對照組細胞侵襲能力,0.4%結(jié)晶紫染色,顯微鏡倍數(shù)100倍;b.對照組與實驗組細胞侵襲數(shù))

        3 討論

        胰腺癌惡性程度高,現(xiàn)有的治療手段均不能顯著延長患者生存期??傮w來說,胰腺癌仍缺乏有效的治療靶點。因此,積極探索胰腺癌新的有效治療靶點至關(guān)重要。隨著分子生物學等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展,越來越多的學者們開始關(guān)注到lncRNA和胰腺癌的關(guān)系。lncRNA本身不編碼蛋白或只編碼很短的多肽,近年來的研究表明,其能夠在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動力學、基因表達、生長、分化方面發(fā)揮重要作用[10]。此外,還可通過表觀遺傳調(diào)控等方式影響腫瘤細胞的生長、凋亡、耐藥與轉(zhuǎn)移等多個特征性生物學過程[11]。

        lncRNA5(GAS5)是近期發(fā)現(xiàn)的一種生長停滯特異轉(zhuǎn)錄本,其在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用已有多篇文獻報道,多數(shù)研究認為,GAS5可以抑制人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9,11-12]。但是,GAS5對胰腺癌腫瘤細胞的生物學行為的影響尚未完全清楚。Gao 等[13]研究發(fā)現(xiàn),GAS5能夠通過miR-181c-5pt調(diào)控Hippo通路,影響胰腺癌對化療藥物的耐藥性。Lu等[14]研究表明,GAS5還可以通過調(diào)節(jié)蛋白激酶6的表達水平在一定程度上抑制胰腺癌細胞增殖。為了進一步研究GAS5對胰腺癌腫瘤細胞生物學相關(guān)功能的作用與影響,本研究將GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌AsPc-1細胞株,流式細胞學檢測結(jié)果示,GAS5轉(zhuǎn)染對胰腺癌AsPC-1細胞凋亡無顯著影響。而Gao等[15]的另外一項研究發(fā)現(xiàn),GAS5可誘導胰腺癌細胞凋亡。筆者推測這與本研究選擇的細胞系不同有關(guān)。Gao等[15]選擇的細胞系為PANC-1、BxPC-3等,其惡性表型與AsPC-1細胞不同。另外,也可能與凋亡檢測時間點不同有關(guān)。后續(xù)筆者擬通過增加納入研究的胰腺癌細胞系種類對GAS5轉(zhuǎn)染后胰腺癌細胞凋亡的變化情況進行進一步研究,以明確GAS5對胰腺癌腫瘤細胞生存的影響。本研究細胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染GAS5對胰腺癌細胞遷移和侵襲能力抑制明顯。該結(jié)果與Liu等[16]報道的體內(nèi)過表達GAS5可以抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力的結(jié)果相類似。這提示GAS5在不同類型腫瘤中可能存在相似的調(diào)控作用,需要進一步研究其作用機制。

        綜上所述,lncRNA GAS5對胰腺癌AsPc-1細胞凋亡無明顯影響,對其遷移、侵襲能力有明顯的抑制作用,這可能為胰腺癌的治療提供新的靶點。

        猜你喜歡
        檢測能力
        消防安全四個能力
        “不等式”檢測題
        “一元一次不等式”檢測題
        “一元一次不等式組”檢測題
        “幾何圖形”檢測題
        “角”檢測題
        幽默是一種能力
        大興學習之風 提升履職能力
        你的換位思考能力如何
        努力拓展無人機飛行能力
        無人機(2017年10期)2017-07-06 03:04:36
        精品欧美在线| 国产果冻豆传媒麻婆精东| 国产真实强被迫伦姧女在线观看| 久久久国产精品ⅤA麻豆| 太大太粗太爽免费视频| 蜜桃视频羞羞在线观看| 97在线视频免费人妻| 4444亚洲人成无码网在线观看| 国产高清在线91福利| 久久精品国产亚洲av网站| 成人国成人国产suv| 亚洲中文字幕无码一区| 国产成人亚洲欧美三区综合| 日本精品中文字幕人妻| 中文字幕亚洲无线码一区女同| 中国一 片免费观看| 999久久久免费精品国产牛牛| 国产美女高潮流白浆视频| 国产欧美成人一区二区a片| 窝窝影院午夜看片| 91自国产精品中文字幕| 国产影片一区二区三区| 少妇高潮流白浆在线观看| 国产真实露脸4p视频| 国产精品久久熟女吞精| 亚洲va中文字幕无码一二三区| 亚洲人成无码www久久久| 吃下面吃胸在线看无码| 人妻少妇精品视频专区二区三区| 亚洲国产天堂久久综合| 亚洲AⅤ无码日韩AV中文AV伦| 亚洲一区二区三区厕所偷拍| 一边捏奶头一边高潮视频| 99精品国产兔费观看久久99| 亚洲AV色欲色欲WWW| av网站在线观看亚洲国产| 天天天天躁天天爱天天碰2018| 99在线视频精品费观看视| 丝袜美腿在线观看视频| 18禁黄网站禁片免费观看女女| 九九视频免费|