常旭東， 李宏宇， 陳 江， 馮 吉， 李謙謙， 王煜曄， 高 聰， 劉小毓， 高 飛

1.錦州醫(yī)科大學北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，遼寧 沈陽 1100162.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016；3.大連醫(yī)科大學，遼寧 大連 116000

胰腺癌是惡性程度極高的消化道系統(tǒng)腫瘤之一，病死率較高［1］。在全球工業(yè)化國家中，胰腺癌是癌癥死亡的第七大原因［2］。據(jù)GLOBOCAN 2020估計，僅2020年，全球新增胰腺癌患者495 773例，新增胰腺癌死亡患者466 003例［3］。雖然，目前已經(jīng)確定了胰腺癌的一些發(fā)病危險因素，如吸煙、肥胖、糖尿病、遺傳等，但具體發(fā)病原因仍不清楚［4］。其早期無明顯癥狀及體征，不易被察覺，絕大多數(shù)患者就診時通常已經(jīng)是晚期［4-5］。胰腺癌的治療往往是手術(shù)聯(lián)合放療、化療等方式，雖可短暫延長患者的生存期，但總體來看，有效率低，預后較差［6］。5年存活率低至5%～13%［7］。因此，積極探索胰腺癌細胞表型的調(diào)控基因是開發(fā)新的有效治療方法的關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度＞200個核苷酸的RNA分子［8］。其中，長鏈非編碼RNA GAS5（lncRNA GAS5）被報道為多種癌癥的腫瘤抑制因子［8-9］，但是其對胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-1的表型調(diào)控情況尚不明確。本研究旨在通過探討GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞的凋亡、遷移及侵襲的調(diào)控，為胰腺癌提供潛在的治療靶點?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株AsPC-1購自中國科學院上海細胞庫。細胞在RPMI 1640培養(yǎng)基（購自上海源培生物科技股份有限公司）中添加10%胎牛血清（購自天津康源生物技術(shù)有限公司），并在80%～90%的融合條件下傳代。所有細胞在5% CO2加濕的環(huán)境中維持在37℃。攜帶GAS5的pcDNA載體（pcDNA-GAS5）由上?；蚧び邢薰荆ㄖ袊?gòu)建，用于構(gòu)建GAS5過表達的胰腺癌細胞系。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 分別將lipo2000 pcDNA3質(zhì)粒（1 μg／μl）和pcDNA3-GAS5質(zhì)粒（1 μg／μl）轉(zhuǎn)染至AsPC-1細胞中，將轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒的AsPC-1細胞組設(shè)為對照組，將轉(zhuǎn)染pcDNA3-GAS5質(zhì)粒的AsPC-1細胞組設(shè)為實驗組，將培養(yǎng)瓶置于37℃、 5%CO2孵箱中培養(yǎng)6 h后，使用15% FCS 1640的新鮮培養(yǎng)基換液。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)42 h，收集兩組細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 實時定量PCR 根據(jù)生產(chǎn)廠家的說明書，使用TRIzol試劑（Invitrogen公司）從細胞中提取總RNA。將總RNA應用于cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（applied Biosystems）中 檢 測GAS5 mRNA。使 用SYBR Premix Ex TaqⅡ（TaKaRa）檢測GAS5 mRNA的相對表達，反應條件為95℃預變性5min，95℃變 性15 s，60℃退 火 和 延 伸1 min，40 個 循 環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。特異性引物GAS5序列為正向5′- 3′：GTATGGTGCTGGGTGCG；反向5′- 3′：TAGGCTTGCTCTTTAGGACTT；β-actin序列為正向5′- 3′：GAAGGTGACAGCAGTCGGTT；反向5′- 3′：AGTGGGGTGGCTTTTAGGAT，由凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司提供。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞，進行AnnexinV／PI染色，具體操作步驟按照PE AnnexinV Apoptosis Detection Kit I說明書進行，并通過FACScanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD公司）檢測細胞的凋亡率。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞，將細胞分別以16 000個／cm2接種至6孔板中，當細胞融合率＞90%時，進行劃痕實驗。細胞劃痕后0 h、24 h、48 h，采用Nikon Eclipse Ti-s顯微鏡（日本Nikon公司）觀察并獲取圖像，劃痕區(qū)域面積通過Image J軟件進行測量。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 Transwell上室中加入150 μl稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司），37℃條件下凝固5 h進行基質(zhì)膠包被。轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞，分別調(diào)整對照組與實驗組細 胞密度 為2×105個／ml，各 取500 μl接種至Transwell上室中。下室加入1 ml含20% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后PBS洗滌Transwell上室，用無水冰甲醇固定30 min，PBS洗滌后，用0.4%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽擦掉上室中未穿過的細胞，采用Nikon Eclipse Ti-s顯微鏡觀察并獲取圖像。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AsPC-1胰腺癌細胞系轉(zhuǎn)染GAS5基因表達檢測 AsPC-1細胞系轉(zhuǎn)染GFP熒光質(zhì)粒（圖1a），明場條件下和熒光條件下均可見目標GFP蛋白陽性的表達，顯示轉(zhuǎn)染目標質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率良好。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，以β-actin為內(nèi)參，行PCR檢測。結(jié)果顯示，實驗組的GAS5表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1b），表明AsPC-1細胞系成功構(gòu)建，pcDNA3-GAS5過表達。

圖 1 GFP轉(zhuǎn)染及PCR檢測（a.GFP轉(zhuǎn)染AsPC-1，上圖為顯微鏡明場下拍照，下圖為顯微鏡熒光下拍照，顯微鏡倍數(shù)100倍；b.GAS5相對表達量檢測）

2.2 轉(zhuǎn)染GAS5對AsPC-1細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞，使用Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒進行凋亡檢測。結(jié)果顯示，對照組與實驗組早期凋亡率分別為（5.1%±2.1%）和（4.8%±2.1%），兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；對照組與實驗組晚期凋亡率分別為（6.5%±1.8%）和（6.7%±3.0%），兩組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖 2 不同轉(zhuǎn)染組細胞流式圖凋亡水平［橫坐標為FITC，縱坐標為PE；Q1象限：（AnnexinV-FITC）-／PI+為壞死細胞，Q2象限：（AnnexinV+FITC）+／PI+為晚期凋亡細胞，Q3象限：（AnnexinV-FITC）-／PI-為活細胞，Q4象限：（AnnexinV-FITC）+／PI-為早期凋亡細胞］

2.3 轉(zhuǎn)染GAS5對AsPC-1細胞遷移能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞進行劃痕實驗，結(jié)果顯示，對照組24 h的相對劃痕面積愈合率為（77.9%±0.5%），高于實驗組的（67.7%±0.4%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；對照組48 h的相對劃痕面積愈合率為（89.8%±0.6%），高于實驗組的（77.5%±1.1%），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。GAS5可抑制細胞的遷移能力。見圖3。圖3 劃痕實驗檢測GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞遷移能力的影響（a.劃痕實驗檢測對照組與實驗組細胞的遷移能力；b.對照組與實驗組細胞相對劃痕面積愈合百分率）

2.4 轉(zhuǎn)染GAS5對AsPC-1細胞侵襲能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h后收集兩組細胞進行侵襲實驗，結(jié)果顯示，對照組侵襲細胞數(shù)為（535±28），高于實驗組的（314±21），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，實驗組可明顯抑制細胞的侵襲能力。見圖4。

圖 4 GAS5對胰腺癌AsPC-1細胞侵襲能力的影響（a.Transwell檢測實驗組和對照組細胞侵襲能力，0.4%結(jié)晶紫染色，顯微鏡倍數(shù)100倍；b.對照組與實驗組細胞侵襲數(shù)）

3 討論

胰腺癌惡性程度高，現(xiàn)有的治療手段均不能顯著延長患者生存期?？傮w來說，胰腺癌仍缺乏有效的治療靶點。因此，積極探索胰腺癌新的有效治療靶點至關(guān)重要。隨著分子生物學等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的學者們開始關(guān)注到lncRNA和胰腺癌的關(guān)系。lncRNA本身不編碼蛋白或只編碼很短的多肽，近年來的研究表明，其能夠在調(diào)節(jié)染色質(zhì)動力學、基因表達、生長、分化方面發(fā)揮重要作用［10］。此外，還可通過表觀遺傳調(diào)控等方式影響腫瘤細胞的生長、凋亡、耐藥與轉(zhuǎn)移等多個特征性生物學過程［11］。

lncRNA5（GAS5）是近期發(fā)現(xiàn)的一種生長停滯特異轉(zhuǎn)錄本，其在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用已有多篇文獻報道，多數(shù)研究認為，GAS5可以抑制人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9，11-12］。但是，GAS5對胰腺癌腫瘤細胞的生物學行為的影響尚未完全清楚。Gao 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，GAS5能夠通過miR-181c-5pt調(diào)控Hippo通路，影響胰腺癌對化療藥物的耐藥性。Lu等［14］研究表明，GAS5還可以通過調(diào)節(jié)蛋白激酶6的表達水平在一定程度上抑制胰腺癌細胞增殖。為了進一步研究GAS5對胰腺癌腫瘤細胞生物學相關(guān)功能的作用與影響，本研究將GAS5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌AsPc-1細胞株，流式細胞學檢測結(jié)果示，GAS5轉(zhuǎn)染對胰腺癌AsPC-1細胞凋亡無顯著影響。而Gao等［15］的另外一項研究發(fā)現(xiàn)，GAS5可誘導胰腺癌細胞凋亡。筆者推測這與本研究選擇的細胞系不同有關(guān)。Gao等［15］選擇的細胞系為PANC-1、BxPC-3等，其惡性表型與AsPC-1細胞不同。另外，也可能與凋亡檢測時間點不同有關(guān)。后續(xù)筆者擬通過增加納入研究的胰腺癌細胞系種類對GAS5轉(zhuǎn)染后胰腺癌細胞凋亡的變化情況進行進一步研究，以明確GAS5對胰腺癌腫瘤細胞生存的影響。本研究細胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染GAS5對胰腺癌細胞遷移和侵襲能力抑制明顯。該結(jié)果與Liu等［16］報道的體內(nèi)過表達GAS5可以抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力的結(jié)果相類似。這提示GAS5在不同類型腫瘤中可能存在相似的調(diào)控作用，需要進一步研究其作用機制。

綜上所述，lncRNA GAS5對胰腺癌AsPc-1細胞凋亡無明顯影響，對其遷移、侵襲能力有明顯的抑制作用，這可能為胰腺癌的治療提供新的靶點。