齊海濤 ， 王 利 ， 楊學(xué)剛 ， 楊耀智 ， 郭 鑫

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 黑龍江大北農(nóng)農(nóng)牧食品有限公司 ， 黑龍江 哈爾濱 150021 ； 3. 新希望六和股份有限公司 ， 北京 海淀 100102)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarthea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarthea virus,PEDV)引起的病毒性傳染病，以引起仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征，7日齡內(nèi)仔豬表現(xiàn)高死亡率。20世紀(jì)90年代以來，我國開發(fā)了以CV777毒株為原型的滅活疫苗，其廣泛使用控制了PED的大規(guī)模流行，使該病呈零星暴發(fā)和區(qū)域性感染。直到2010年10月，我國南部省份暴發(fā)PED，Wang等[1]首次報(bào)道了PEDV的新變異株，自此之后在全國各個(gè)省份都有流行，仔豬感染PEDV死亡率高達(dá)80%以上，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2018—2019年對(duì)我國廣東省的8個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)進(jìn)行采樣檢測(cè)腸道病原體，PEDV的檢出率為47.0%(16/34)[2]。在此次調(diào)查中研究人員還發(fā)現(xiàn)，廣東流行的PEDV毒株存在S基因的重組，因此迫切需要開發(fā)新疫苗以應(yīng)對(duì)新的PEDV變異毒株。

關(guān)于PED疫苗免疫有效性的說法眾說紛紜,對(duì)疫苗免疫后效果的評(píng)估較少。目前控制仔豬PED尚無有效治療藥物，選擇合適的疫苗及合理的免疫程序是預(yù)防PED的重要措施。有研究表明，豬流行性腹瀉的免疫主要依靠黏膜免疫，高水平的分泌型母源IgA抗體與仔豬抵抗PEDV感染呈正相關(guān)，而與血液中的IgG抗體相關(guān)性較低[3]。朱海俠等[4]研究表明，乳汁中PEDV IgA抗體與血清IgA抗體呈現(xiàn)很好的相關(guān)性，且乳汁中 IgA抗體水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血清。因此，如何刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平的分泌型IgA抗體，是PED疫苗免疫以及PED防控的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過對(duì)比不同類型疫苗以不同時(shí)間、不同組合接種妊娠母豬，評(píng)估疫苗免疫對(duì)母豬初乳中IgA抗體含量及持續(xù)時(shí)間的影響，以期為規(guī)?；i場(chǎng)新生仔豬PED的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗(簡稱豬腹瀉二聯(lián)活苗)，購自福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：130141109；豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗(簡稱豬腹瀉二聯(lián)滅活苗)，購自武漢科前生物股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：170041124；豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒，購自美國愛德士公司，生產(chǎn)批號(hào)：56D230。

1.2 主要儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、多道移液器、臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)、醫(yī)用冷藏柜HYC-650等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 大北農(nóng)集團(tuán)唐山種豬場(chǎng)健康妊娠母豬，經(jīng)檢測(cè)PEDV抗原、抗體均為陰性。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 PED疫苗不同組合免疫效果評(píng)估 2017年9月—2018年9月，選取PEDV抗原、抗體陰性健康妊娠母豬125頭，平均分成5個(gè)組，每組25頭。第1組：2次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫(產(chǎn)前40 d、20 d)；第2組：2次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫(產(chǎn)前40 d、20 d)；第3組：1次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫(產(chǎn)前40 d)+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫(產(chǎn)前20 d)；第4組：2次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫(產(chǎn)前60 d、40 d)+1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫(產(chǎn)前20 d)；對(duì)照組：2次疫苗稀釋液免疫注射(產(chǎn)前40 d、20 d)。試驗(yàn)疫苗用法與用量：豬腹瀉二聯(lián)滅活疫苗，妊娠母豬后海穴注射，每次4 mL;豬腹瀉二聯(lián)活苗，妊娠母豬后海穴注射，每次1頭份；對(duì)照組妊娠母豬后海穴注射4 mL 疫苗稀釋液。母豬產(chǎn)仔當(dāng)天收集乳汁2 mL，用ELISA方法檢測(cè)初乳中IgA抗體值。

1.4.2 免疫后乳汁中PEDV的IgA抗體持續(xù)時(shí)間測(cè)定 對(duì)第2組和第4組的母豬隨機(jī)選取10頭，分別在產(chǎn)后3、6、9、12 d和15 d收集乳汁，檢測(cè)乳汁中IgA抗體，評(píng)估IgA抗體持續(xù)時(shí)間。

1.4.3 乳汁中PEDV的IgA抗體測(cè)定與計(jì)算 按照抗體檢測(cè)試劑盒說明書對(duì)所有試驗(yàn)?zāi)肛i初乳中PEDV IgA抗體進(jìn)行檢測(cè)。(1) 檢測(cè)的有效性：①陰性對(duì)照OD650 nm(NC)平均值<0.200；②陽性對(duì)照OD650 nm(PC)平均值>0.500，上述任何一個(gè)值超出規(guī)定的范圍，則該試驗(yàn)被視為無效，所檢的樣品需要重新進(jìn)行檢測(cè)；(2)計(jì)算：按照豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒說明書計(jì)算樣品與陽性對(duì)照(S/P)的比值。結(jié)果判定：陰性S/P<0.50；陽性S/P≥0.50。

2 結(jié)果

2.1 PED疫苗不同組合免疫后乳汁中IgA抗體檢測(cè) 結(jié)果如表1所示，4個(gè)免疫組中第2組和第4組的免疫組合效果較好，抗體陽性率分別為93.75%和97.50%，陽性平均OD值分別為1.535和1.447，免疫后誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的IgA抗體整齊度好；第1組IgA抗體陽性率最差，為38.13%；第3組IgA抗體陽性率為80%，免疫效果居中。

表1 不同免疫程序的IgA抗體陽性率與平均OD值

2.2 免疫后乳汁中PEDV的IgA 抗體持續(xù)時(shí)間

2.2.1 2次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫IgA持續(xù)時(shí)間檢測(cè) 結(jié)果如表2所示，2次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫組(第2組)母豬乳汁中IgA抗體在前6天陽性率為100%，第9天陽性率開始下降至80%，第12天降至70%，第15天降至10%，在豬群中10%的仔豬有抗體，對(duì)于抵抗病毒感染基本不起作用；IgA抗體可持續(xù)9～12 d；從陽性樣品的平均OD值看，母源抗體也呈現(xiàn)逐漸衰減趨勢(shì)。

表2 2次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫乳汁中IgA抗體動(dòng)態(tài)變化

2.2.2 2次豬腹瀉二聯(lián)活苗加1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫IgA持續(xù)時(shí)間檢測(cè) 結(jié)果如表3所示，2次豬腹瀉二聯(lián)活苗加1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫組(第4組)母豬乳汁中IgA抗體在前6天陽性率為100%，第9天陽性率為90%，在第12天降至70%，第15天降至40%；IgA抗體可持續(xù)12～15 d;從陽性樣品的平均OD值看，母源抗體也呈逐漸下降衰減趨勢(shì)，比單純2次豬腹瀉二聯(lián)活苗免疫下降稍緩和。

表3 2次豬腹瀉二聯(lián)活苗加1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫乳汁中IgA抗體動(dòng)態(tài)變化

加1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫的目的是盡可能維持IgA持續(xù)時(shí)間，從表2和表3結(jié)果可知，加1次免疫能增加母源IgA抗體持續(xù)的時(shí)間，但是會(huì)增加免疫成本且影響工作效率，在實(shí)際工作中可根據(jù)情況選擇免疫2次或免疫3次，本試驗(yàn)結(jié)果表明免疫2次豬腹瀉二聯(lián)活苗獲得IgA抗體持續(xù)的時(shí)間可以保護(hù)仔豬度過危險(xiǎn)期。

3 討論

大量的研究表明，豬流行性腹瀉的免疫主要依靠黏膜免疫，高水平的母源IgA抗體與保護(hù)仔豬抵抗PEDV感染呈正相關(guān)，初乳中的PEDV 中和抗體滴度與血清中的IgA 抗體具有相關(guān)性[3],通過刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平的分泌型IgA抗體，是PED疫苗免疫和防治的關(guān)鍵。本試驗(yàn)通過比較豬腹瀉二聯(lián)活苗與滅活苗的不同免疫組合對(duì)母豬初乳中IgA抗體水平的影響，得出接種2次豬腹瀉二聯(lián)活苗加1次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗的母豬初乳中IgA抗體水平最高，整齊度最好，但成本相對(duì)于2次豬腹瀉二聯(lián)活苗偏高，并且免疫操作多1次，增加工作量和母豬應(yīng)激；其次是2次豬腹瀉二聯(lián)活苗組合。疫苗組合效果的順序與王娟萍等[5]、王艷豐等[6]的研究結(jié)果相近，每個(gè)組合的豬只免疫后的陽性率有差異，可能與選用的滅活疫苗抗原含量有差異相關(guān)。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，豬腹瀉二聯(lián)滅活苗單獨(dú)使用免疫效果欠佳，一定要與豬腹瀉二聯(lián)活苗或活毒馴化配合使用，才能更好的發(fā)揮免疫作用。

徐宏軍等[7]進(jìn)行的仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，商品化PED滅活疫苗免疫組斷奶仔豬出現(xiàn)腹瀉，腹瀉保護(hù)率為60%，未達(dá)到有效性標(biāo)準(zhǔn)。由于我國目前所使用的商品化滅活苗通常不能有效激發(fā)機(jī)體的黏膜免疫，這可能是滅活疫苗免疫保護(hù)效果不佳的原因之一，滅活疫苗需要與活疫苗組合免疫才能產(chǎn)生高水平抗體，本試驗(yàn)中2次豬腹瀉二聯(lián)滅活苗免疫產(chǎn)生的IgA抗體水平最差，與徐宏軍等[7]的研究結(jié)論一致，因此不建議滅活疫苗單獨(dú)使用。有研究表明，PEDV感染仔豬機(jī)體后，病毒的主要靶器官是腸道、腸系膜淋巴結(jié),如果感染時(shí)間早、持續(xù)時(shí)間長，會(huì)導(dǎo)致消化器官嚴(yán)重的病理損傷[8]，腸道黏膜免疫中分泌型IgA抗體非常重要。通過后海穴注射疫苗，尤其是免疫弱毒活苗，可以很好的刺激母豬產(chǎn)生大量 IgA 抗體分泌到乳汁中形成分泌型IgA抗體，從而為新生仔豬提供被動(dòng)免疫保護(hù)[9]。

綜上所述，綜合考慮養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際操作情況和生產(chǎn)成本，推薦豬場(chǎng)豬流行性腹瀉的免疫程序?yàn)椋喝焉锬肛i產(chǎn)前40 d、20 d各免疫1次豬腹瀉二聯(lián)活苗，或產(chǎn)前60 d、40 d各免疫1次豬腹瀉二聯(lián)活苗，產(chǎn)前20 d于后海穴注射豬腹瀉二聯(lián)滅活苗，在加強(qiáng)基礎(chǔ)母豬免疫的同時(shí)，也要注意加強(qiáng)對(duì)后備豬的免疫，加強(qiáng)生物安全設(shè)施升級(jí)，嚴(yán)格執(zhí)行生物安全操作程序，進(jìn)場(chǎng)人員遠(yuǎn)離傳染源，通過生物安全操作程序嚴(yán)格處理進(jìn)場(chǎng)物資、車輛、人員，切斷傳播途徑，通過綜合防控措施控制好PED。