徐 彤 ， 貢 鑫 ， 鄭明學(xué) ， 呂曉玲 ， 鄭龍龍 ， 崔凱玲 ， 張雪松 ， 段步婷 ， 白 瑞

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 山西 太谷 030801)

雞球蟲病是一種危害性較大的腸道寄生蟲病[1]，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。目前，對(duì)雞球蟲病防治的手段主要是化學(xué)藥物和活疫苗，而藥物防治存在藥物殘留、免疫抑制和耐藥性問題，活疫苗的免疫產(chǎn)生期長且影響雛雞增重。因此，高效免疫預(yù)防雞球蟲病成為一個(gè)熱門研究課題。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，融合細(xì)胞因子作為一種新的疫苗免疫佐劑成為可能[2]。白介素2(Interleukin 2，IL-2)在免疫系統(tǒng)中具有上調(diào)免疫應(yīng)答的作用，使得免疫產(chǎn)生時(shí)間縮短。白介素4(Interleukin 4，IL-4)能夠增強(qiáng)單核細(xì)胞的抗原遞呈能力從而縮短抗體產(chǎn)生時(shí)間[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)2種不同細(xì)胞因子的融合蛋白具有免疫佐劑的作用。目前國內(nèi)外尚無IL-2和IL-4融合基因佐劑。因此本試驗(yàn)構(gòu)建雞IL-2(Chicken interleukin 2,chIL-2)和雞IL-4 (Chicken interleukin 4,chIL-4)融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒，以期為研究新型細(xì)胞因子免疫佐劑夯實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及動(dòng)物 大腸桿菌DH5α和pCI質(zhì)粒，均為本實(shí)驗(yàn)室保存；pEGFP-N3質(zhì)粒，購自上海瓦蘭生物科技有限公司；15日齡SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 QuickCutTMEcoR I、QuickCutTMSalI、QuickCutTMKpnI、QuickCutTMNotI、DNA Ligation Kit、PrimeScriptTMRT Reagent Kit和SYBR?PremixExTaqTMGC，均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；SanPrep無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒和柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；MTT試劑盒，購自上海索萊寶生物科技有限公司；HilyMax，購自上海同仁化學(xué)研究所。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1chIL-4與chIL-2基因合成 根據(jù)GenBank中chIL-4(453 bp)基因序列(AJ621249.1)加EcoR I和KpnI酶切位點(diǎn)，下游去終止密碼子TGA并加Linker序列；根據(jù)GenBank中chIL-2基因(429 bp)序列(AF000631.1)，加KpnI和SalI酶切位點(diǎn)，去終止密碼子TAA。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成重組克隆質(zhì)粒pUC57-ChIL-4和pUC57-ChIL-2。

1.3.2 重組克隆質(zhì)粒和真核表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切、回收與鑒定 按QuickCutEcoR I和QuickCutKpnI說明書，將pUC57-ChIL-4重組質(zhì)粒和pCI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收pCI(約4 000 bp) 和ChIL-4的目的條帶；同樣方法雙酶切與鑒定pUC57-ChIL-2和pCI，膠回收pCI與ChIL-2的目的條帶。

1.3.3 連接與轉(zhuǎn)化 按DNA Ligation Kit說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，雙酶切后的pCI分別與IL-4和IL-2片段按摩爾比3∶1混合為10 μL體系；加等體積Ligation Mix混勻，16 ℃ 30 min；轉(zhuǎn)化并增菌培養(yǎng)；按SanPrep無內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說明書提取質(zhì)粒pCI-chIL-4和pCI-chIL-2。

1.3.4chIL-2連接至pCI-chIL-4質(zhì)粒 按QuickCutKpnI和QuickCutSalI說明書雙酶切pCI-chIL-4，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收約4 459 bp目的條帶；pCI-chIL-4與chIL-2基因片段連接與轉(zhuǎn)化同1.3.3項(xiàng)，獲得pCI-chIL-4-chIL-2重組質(zhì)粒。

1.3.5 pCI-chIL-2、pCI-chIL-4、pCI-chIL-4-chIL-2質(zhì)粒上連接增強(qiáng)綠色熒光蛋白(EGFP)基因 按QuickCutKpnI和QuickCutNotI說明書雙酶切pCI-chIL-4和pEGFP-N3，瓊脂糖凝膠電泳鑒定；同樣方法雙酶切、鑒定及膠回收pCI-chIL-2、pCI-chIL-4-chIL-2、pEGFP-N3；pCI-chIL-4-chIL-2、pCI-chIL-4、pCI-chIL-2分別與EGFP基因連接、轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒DNA，方法同1.3.3項(xiàng)。將構(gòu)建的質(zhì)粒送至深圳華大基因公司測序。

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與真核細(xì)胞表達(dá) 將原代雞胚盲腸上皮細(xì)胞以3×105個(gè)/mL接種于24孔板中，41 ℃、 8% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；貼壁率達(dá)80%～90%時(shí)，將細(xì)胞分為5個(gè)組：空白組(A0，不加pCI、Opti-MEM培養(yǎng)基、HilyMax)、空載組(A1)、pCI-chIL-2-EGFP組(A2)、pCI-chIL-4-EGFP組(A3)和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP組(A4)，每組16個(gè)孔。其中A1～ A4組分別添加相應(yīng)質(zhì)粒 16 μg、Opti-MEM培養(yǎng)基480 μL、HilyMax 48 μL，孵育4 h；在24、48、72 h和96 h檢測轉(zhuǎn)染率、轉(zhuǎn)染細(xì)胞chIL-4、chIL-2基因mRNA表達(dá)量、細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量和細(xì)胞培養(yǎng)液中融合蛋白表達(dá)量。

(1)轉(zhuǎn)染率：熒光細(xì)胞數(shù)占活細(xì)胞總數(shù)的百分比。

(2)chIL-4、chIL-2基因mRNA表達(dá)量測定:按SYBR?PremixExTaqTMGC說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)，用Primer 3軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：雞IL-4(156 bp)：F 5′-AGCCAGCACTGCCACAAGAAC-3′, R 5′-GTGGAAGAAGGTACGTAGGTC TGC-3′；雞IL-2(155 bp)：F 5′-AGTGCACCCAGCAAACTCTG-3′, R 5′-TCCGGTGTGATTTAGACCC GT-3′；雞β-actin(135 bp)：F 5′-CACCACAGCCGAGAGAGAAAT-3′, R 5′-TGACCATCAGGGAGTTCATAGC-3′。反應(yīng)體系：SYBR?PremixExTaqII(Tli RNaseH)(2×) 10 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.4 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.4 μL、ROX Reference Dye II(50×) 0.4 μL、cDNA溶液(Template) 2 μL、ddH2O 6.8 μL,共20 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,40個(gè) 循環(huán)。雞β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，RT-qPCR結(jié)果用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

(3)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量：采用Image-Pro Plus. v 6.0軟件測量熒光細(xì)胞累積光密度(IOD)。

(4)細(xì)胞培養(yǎng)液中融合蛋白表達(dá)量：按芮琴[4]的方法用熒光分光光度計(jì)(激發(fā)波長、發(fā)射波長分別為460 nm、509 nm)測定各時(shí)間段細(xì)胞上清的熒光強(qiáng)度。

1.3.7 表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性鑒定 按范忠玲[5]的方法測定表達(dá)產(chǎn)物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖活性的影響。取37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h的雞脾淋巴細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，細(xì)胞密度為5×103個(gè)/μL，50 μL/孔。試驗(yàn)分為6個(gè)組(每組5個(gè)孔)，分別為空白組(C，無細(xì)胞僅含RPMI 1640培養(yǎng)基的對(duì)照)、細(xì)胞陰性對(duì)照組(C0)、試驗(yàn)組(B1～B4)。分組后，B1～B4組再分別添加1.3.6項(xiàng)A1～A4組轉(zhuǎn)染后各時(shí)間段細(xì)胞上清液50 μL/孔，空白組(C)和細(xì)胞陰性對(duì)照組(C0)加DMEM培養(yǎng)基50 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。MTT法檢測各組細(xì)胞活性，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。

2 結(jié)果

2.1 pUC57-chIL-4和pUC57-chIL-2重組質(zhì)粒鑒定 pUC57-chIL-4重組質(zhì)粒雙酶切得到約453 bp和2 700 bp 的條帶，pUC57-chIL-2重組質(zhì)粒雙酶切得到約429 bp和2 700 bp的條帶，與預(yù)期一致，見圖1。

圖1 pUC57-chIL-4和pUC57-chIL-2雙酶切電泳圖

2.2 pCI-chIL-4、pCI-chIL-2和pCI-chIL-4-chIL-2重組質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒pCI-chIL-4可酶切得到約453 bp 和4 000 bp的條帶，pCI-chIL-2可酶切得到約429 bp 和4 000 bp的條帶，重組質(zhì)粒pCI-chIL-4-chIL-2可酶切得到約4 000 bp和888 bp的條帶，符合預(yù)期結(jié)果(圖2)。

圖2 pCI-chIL-4-chIL-2、pCI-chIL-2和pCI-chIL-4雙酶切電泳圖

2.3 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP重組質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒pCI-chIL-4-EGFP可酶切得到約770 bp和4 400 bp的條帶，重組質(zhì)粒pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP可酶切得到約770 bp和4 900 bp的條帶，重組質(zhì)粒pCI-chIL-2-EGFP可酶切得到約770 bp和4 400 bp的條帶，初步證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖3)。

圖3 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP雙酶切電泳圖

測序結(jié)果用NCBI BLAST與GenBank中發(fā)表的EGFP、chIL-2、chIL-4基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)基因序列匹配度100%，符合預(yù)期結(jié)果。

2.4 雞胚盲腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果及表達(dá)效果

2.4.1 轉(zhuǎn)染效果 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP后24～96 h，轉(zhuǎn)染率先升后降，48 h達(dá)峰值，96 h為0，且各時(shí)間段間差異不顯著(P>0.05)。pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP規(guī)律同pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP，見圖4和圖5。

圖4 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP在雞胚盲腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果

圖5 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP轉(zhuǎn)染雞胚盲腸上皮細(xì)胞

2.4.2 表達(dá)效果

2.4.2.1ChIL-4、ChIL-2基因mRNA表達(dá)量測定 轉(zhuǎn)染后24～96 h，chIL-4-chIL-2、chIL-2和chIL-4基因的mRNA表達(dá)量均先升高后降低，48 h時(shí)極顯著高于其他時(shí)間段(P<0.01)，見圖6。

圖6 目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量

2.4.2.2 細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)量 重組質(zhì)粒pCI-chIL-2-EGFP轉(zhuǎn)染后24～96 h，細(xì)胞累積光密度(IOD)值先升后降，72 h達(dá)峰值，其IOD值顯著高于48 h(P<0.05)或極顯著高于24 h(P<0.01)，96 h為0。pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP變化規(guī)律同pCI-chIL-2-EGFP。空載組各時(shí)間段均為0，見圖7。

圖7 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP在雞胚盲腸上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.4.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中融合蛋白表達(dá)量 重組質(zhì)粒pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP轉(zhuǎn)染后24～96 h，熒光強(qiáng)度先升后降，72 h達(dá)峰值且極顯著高于其他時(shí)間段(P<0.01)。 pCI-chIL-4-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP變化規(guī)律同pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP，見圖8。

圖8 pCI-chIL-4-chIL-2-EGFP、pCI-chIL-2-EGFP和pCI-chIL-4-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)蛋白的分泌情況

2.5 真核重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性鑒定 轉(zhuǎn)染后24～96 h，B2、B3組和B4組的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖活性的影響均先升后降，且均極顯著高于B1組(P<0.01)，B4組極顯著高于B2組和B3組(P<0.01)，B2組和B3組無差異(P>0.05)，見圖9。

圖9 各組表達(dá)產(chǎn)物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

3 討論

本試驗(yàn)用DNA重組技術(shù)將IL-4和IL-2基因與EGFP基因融合構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)凝膠電泳、基因測序、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液熒光蛋白測定，表明成功構(gòu)建了3種真核表達(dá)質(zhì)粒，且轉(zhuǎn)染雞胚盲腸上皮細(xì)胞后可持續(xù)表達(dá)并分泌chIL-2、chIL-4、chIL-4-chIL-2融合蛋白，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-2和IL-4都可促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[6-7]。雞脾淋巴細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染于原代雞胚盲腸上皮細(xì)胞后分泌的chIL-2、chIL-4蛋白和chIL-4-chIL-2融合蛋白在各時(shí)間段均能促雞脾淋巴細(xì)胞增殖。戴華等[7]通過試驗(yàn)獲得的重組蛋白pBac-ChIL-4能刺激雞脾淋巴細(xì)胞增殖。牛澤[8]研究結(jié)果表明，重組ChIL-2蛋白對(duì)雞脾淋巴細(xì)胞有顯著增殖作用。以上研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種重組質(zhì)粒對(duì)雞脾淋巴細(xì)胞增殖均有顯著促進(jìn)作用，而單一chIL-2、chIL-4促進(jìn)雞脾淋巴細(xì)胞增殖作用顯著低于chIL-4-chIL-2，結(jié)果表明chIL-4-chIL-2融合蛋白具有更好的生物學(xué)活性。閆若潛等[9]以雞α干擾素與IL-2為對(duì)象構(gòu)建融合基因并獲得其重組融合蛋白，結(jié)果表明此蛋白有雙重生物學(xué)活性。馬文濤[10]以豬IL-2和IL-6基因?yàn)閷?duì)象獲得重組融合蛋白，通過試驗(yàn)證實(shí)此蛋白生物學(xué)活性優(yōu)于單一重組蛋白。上述研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相同。但是chIL-4-chIL-2細(xì)胞因子免疫佐劑能否縮短免疫產(chǎn)生期還需進(jìn)一步的驗(yàn)證?？傊?種重組質(zhì)粒對(duì)雞脾淋巴細(xì)胞的增殖均有促進(jìn)作用，且融合蛋白chIL-4-chIL-2的生物學(xué)活性明顯優(yōu)于單一蛋白。