陳 琛，周海龍，吳春興，王博龍

1宜春學(xué)院；2宜春市第二人民醫(yī)院，宜春 336000

細(xì)胞因子是機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)不可或缺的一部分，而細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm，CS)是機體感染病原微生物后IL-6、IL-1、TNF-α、IFN等多種細(xì)胞因子在短時間內(nèi)異常增高表達所導(dǎo)致的嚴(yán)重免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是新冠肺炎發(fā)展的主要機制之一[1]。臨床研究[2,3]顯示部分新冠肺炎患者早期癥狀較輕，而后期病情突然加重的主要原因是CS，且嚴(yán)重程度與CS呈正相關(guān)。對于危重病人，CS可誘發(fā)急性呼吸窘迫綜合征和多器官損害，甚至死亡。由于CS的發(fā)生機制相對復(fù)雜，導(dǎo)致與之相關(guān)的疾病也進展迅速，為臨床治療帶來了挑戰(zhàn)。因此，近年來CS干預(yù)調(diào)節(jié)劑的研發(fā)已成為熱點課題。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在疾病的臨床治療中療效顯著，且中藥復(fù)方干預(yù)疾病時具有多靶點、多途徑、安全性高等優(yōu)點。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法能整合疾病靶點、成分、中藥等具有聯(lián)系的重要信息；本研究擬采取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法并結(jié)合數(shù)據(jù)挖掘，以CS相關(guān)靶點為切入點，探討中藥干預(yù)CS的物質(zhì)基礎(chǔ)及一般規(guī)律，以期為中藥干預(yù)CS的相關(guān)研究和實驗驗證提供借鑒和參考。

1 資料與方法

1.1 相關(guān)靶點收集

以“cytokine storm”為關(guān)鍵詞，借助GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)收集相關(guān)靶點。合并去重后利用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)匹配靶點全稱。

1.2 化合物篩選及靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)，同時根據(jù)CS相關(guān)靶點全稱匹配化合物。化合物應(yīng)滿足如下條件[4]：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥18%、半衰期(half-life，HL)>4、拓?fù)錁O性表面積(topological polar surface area，TPSA)<140、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)(number of rotatable bonds，RBN)≤10、分子質(zhì)量(molecular weight，MW)≤500 Da。借助Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)，并利用Network Analyzer插件分析各節(jié)點的拓?fù)鋵傩灾怠?/p>

1.3 中藥獲取及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取包含備選化合物的所有中藥；去重后根據(jù)《中藥學(xué)》[5]、2020版《中華人民共和國藥典》規(guī)范中藥名稱，如“川牛膝”統(tǒng)一為“牛膝”“南蛇藤果”規(guī)范為“合歡花”等。因化合物在靶點和中藥間起橋梁作用，故可借助化合物映射得到靶點所對應(yīng)的中藥。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)可視圖，通過分析該網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點的拓?fù)鋵傩灾担页鲫P(guān)鍵節(jié)點，初步評估各中藥及其化合物干預(yù)CS的功效強度[6]。

1.4 分子對接驗證

分子對接可驗證潛在靶點與備選化合物間的作用可信度，亦能為新的化合物-靶點組合提供思路。本研究選取靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)中度值排名前七位的靶點與度值較高的化合物進行分子對接。在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/)下載各蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，保存為.pdb格式；借助PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)保存化合物的2D結(jié)構(gòu)，格式為.SDF。CB-Dock在線分子對接平臺(http://clab.labshare.cn/cb-dock/)可自動識別上傳蛋白的潛在結(jié)合位點，并使用內(nèi)置的Auto Dock Vina軟件進行分子對接[7]。對接得分值(affinity)可衡量潛在靶點與備選化合物間的作用可信度，得分<-1.67 kJ/mol表示兩者間具有更強的結(jié)合活性。Ligplot軟件(Version 2.2)可自動計算受體與配體間形成的氫鍵、疏水作用或結(jié)構(gòu)比對，將Affinity值最好的對接組合導(dǎo)入該軟件進行2D可視化展示。

1.5 中藥性味歸經(jīng)功效分析

參照《中藥學(xué)》和2020版《中國藥典》規(guī)范已匹配中藥的性味、歸經(jīng)、功效等基本信息，若某味中藥有多種性味歸經(jīng)，則分別統(tǒng)計在內(nèi)。此外，如中藥性味中出現(xiàn)“微寒”“微苦”等則統(tǒng)一歸為“寒”“苦”。將匹配靶點較多的中藥與其性味、歸經(jīng)、功效建立聯(lián)系，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥性味歸經(jīng)功效網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 相關(guān)靶點結(jié)果

結(jié)果從GeneCards和DrugBank數(shù)據(jù)庫各獲得638、89個與CS相關(guān)的基因靶點，其他數(shù)據(jù)庫沒有檢索到相關(guān)靶點。篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫中靶點值較高(relevance score>6)的前100位相關(guān)靶點，去重后經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫規(guī)范共獲得113個CS相關(guān)基因靶點。經(jīng)篩選匹配，只有35個靶點存在符合條件的對應(yīng)化合物，故將這35個靶點定義為干預(yù)CS的潛在靶點(見表1)。

表1 潛在靶點基本信息

2.2 備選化合物篩選及靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“潛在靶點”為檢索詞，以O(shè)B≥0.3、DL≥0.18、HL>4、TPSA<140、RBN≤10、MW≤500 Da等為條件篩選潛在靶點對應(yīng)的備選化合物，合并去重后共獲得49個CS潛在靶點對應(yīng)的備選化合物，圖1為靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由84個節(jié)點和136條邊組成，圖中箭頭節(jié)點代表潛在靶點，八邊形節(jié)點為備選化合物。節(jié)點度值越大其樞紐作用越強，在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要?？梢姸戎登?位的化合物依次是槲皮素、木犀草素、雷公藤甲素、漆黃素、漢黃芩素，它們分別對應(yīng)著23、13、10、9、7個靶點。另外，度值前7位的靶點依次為MAPK14、TNF、IL6、AKT1、MAPK1、VEGFA、IL1B。

圖1 靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 中藥獲取及靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫匹配出49個備選化合物涉及的全部中藥，去重后根據(jù)《中藥學(xué)》、2020版《中國藥典》規(guī)范中藥名稱并去重，最終獲得268味中藥。利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)包含317個節(jié)點和589條邊。經(jīng)Network Analyzer拓?fù)浞治?，度值在前十位的中藥依次是甘草、苦參、雞血藤、胡蘆巴、山豆根、射干、燈盞細(xì)辛、銀杏葉、菊花、敗醬草，分別對應(yīng)著12、10、8、7、7、6、6、6、6、6個備選化合物。同時，銀杏葉、敗醬草、甘草、燈盞細(xì)辛可分別作用于29、29、29、28個靶點，故推測這四味中藥對CS具有較強的干預(yù)作用，可作為臨床遣方用藥或?qū)嶒炑芯康闹攸c；中藥度值及其對應(yīng)的靶點數(shù)見圖2。由于化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)的度值中位數(shù)為2，因此認(rèn)為度值>4的化合物為干預(yù)CS的潛在核心化合物，共15個(見表2)。度值較高的前5位化合物分別是槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素、柚皮素。本研究選取度值>4的中藥，利用Cytoscape 3.7.2軟件重新構(gòu)建靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，其中網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的大小與其度值成正比。

圖2 中藥度值及其作用靶點數(shù)分布圖

圖3 靶點-化合物-中藥網(wǎng)絡(luò)圖(Degree>4)

表2 干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴的潛在核心化合物(Degree>4)

2.4 分子對接

利用CB-Dock在線分子對接平臺將度值前15位的化合物與7個核心靶點MAPK14(PDB ID:4EH3)、TNF(PDB ID:6M8A)、IL-6(PDB ID:5Z15)、AKT1(PDB ID:1QKM)、MAPK1(PDB ID:3V3V)、VEGFA(PDB ID:4GQR)、IL1B(PDB ID:5R86)進行分子對接，結(jié)果見圖4。在105組對接結(jié)果中，affinity值<-1.67 kJ/mol的有95組(90.48%)，其中對接affinity值最高的組合為IL-6-luteolin(-2.56 kJ/mol)，最低的是IL1B-matrine(-1.48 kJ/mol)。利用Ligplot軟件將affinity值最高的5組對接組合結(jié)果以二維圖的形式展示，如圖5A～5E所示。可見各配體均嵌入靶點蛋白的活性口袋中，且通過疏水作用或氫鍵等形式與靶蛋白的多個氨基酸殘基發(fā)生相互作用。

2.5 性味歸經(jīng)功效分析

根據(jù)《中藥學(xué)》與2020版《中華人民共和國藥典》匹配所獲得中藥的基本信息，建立數(shù)據(jù)庫，其中對應(yīng)靶點較多的中藥基本信息見表3。利用Microsoft Office Excel 2017表的數(shù)據(jù)透視表功能統(tǒng)計分析中藥的性味歸經(jīng)，干預(yù)CS的中藥藥味總頻次為393次，以苦為主；藥性總頻次為264次，以寒最常見(見表4)。同時，這些中藥以入肝經(jīng)(137次)、肺經(jīng)(107次)最多(見圖6)。由此推測CS的發(fā)生機制可能與肝經(jīng)、肺經(jīng)有著緊密的聯(lián)系。將對應(yīng)靶點最多的前15位中藥與其性味、歸經(jīng)、功效建立聯(lián)系，并構(gòu)建中藥性味歸經(jīng)功效網(wǎng)絡(luò)。由圖7可知這些中藥的特征與上述分析結(jié)果基本吻合；此外，它們在功效分類上多為清熱類、活血化瘀類、補虛類。

圖6 歸經(jīng)分布圖

圖7 中藥性味歸經(jīng)功效網(wǎng)絡(luò)圖

表3 主要中藥基本信息

表4 干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴的中藥性味分布

3 討論

CS是人體受刺激后產(chǎn)生的過度免疫反應(yīng)，體內(nèi)的細(xì)胞因子、趨化因子被活化釋放，導(dǎo)致促炎和抗炎的平衡被打破。研究[8]表明導(dǎo)致COVID-19患者病情惡化、死亡的罪魁禍?zhǔn)渍荂S，而抑制CS是搶救危重癥COVID-19患者的首要任務(wù)。西醫(yī)治療CS主要依賴糖皮質(zhì)激素，長期大劑量使用糖皮質(zhì)激素雖能達到一定的防治效果，但其所帶來的毒副作用不容忽視。與之相反，中藥本身具有作用廣泛、靶點多元、整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢，在干預(yù)和調(diào)節(jié)CS中具有廣闊的應(yīng)用前景和研究價值。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和數(shù)據(jù)挖掘的方法，以CS相關(guān)靶點為切入點，篩選出干預(yù)CS的化合物和中藥，并系統(tǒng)預(yù)測和闡釋了中藥干預(yù)CS的物質(zhì)基礎(chǔ)及用藥規(guī)律。

結(jié)果顯示，度值排名靠前的靶點主要有MAPK14、TNF、IL6、AKT1、MAPK1、VEGFA、IL1B等。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)在細(xì)胞增殖、分化、炎癥反應(yīng)、免疫防御等諸多方面發(fā)揮著重要作用。研究[9,10]表明MAPK14在調(diào)節(jié)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)和趨化因子(CCL2、CCL4)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)MAPK14的活化可抑制細(xì)胞炎癥因子的釋放。COVID-19患者感染早期TNF-α、IL1B等早期炎癥因子即迅速分泌，過量的早期炎癥細(xì)胞因子會打破體內(nèi)抗炎-促炎平衡，進一步引發(fā)包括IL-6、IL-2等在內(nèi)的細(xì)胞因子和趨化因子活化、釋放，形成失控的CS[11]。另外，由于TNF-α是機體在炎癥早期分泌的主要炎性因子，可使細(xì)胞間黏附分子表達增加，NF-κB活性增強，最終通過正反饋調(diào)節(jié)機制使炎癥反應(yīng)擴大和持續(xù)[12,13]。IL-6不僅具有多種生物學(xué)活性，且是前炎癥介質(zhì)[14]；同時IL-6的體內(nèi)水平與COVID-19患者病情程度呈正相關(guān)，這預(yù)示著其在中藥抗炎反應(yīng)中可能處于關(guān)鍵地位。此外，廣泛分布于腦中的VEGFA作為重要的血管生成因子，可能通過促進炎癥細(xì)胞的聚集及調(diào)節(jié)血管生成素II(Ang II)的水平在COVID-19患者腦部炎癥中起關(guān)鍵作用[15]。

靶點-化合物網(wǎng)絡(luò)中對應(yīng)靶點較多的化合物，如雷公藤甲素、漆黃素等所映射的中藥在后續(xù)分析中度值較小，故不再討論。而度值較高的化合物主要有槲皮素、山奈酚、木犀草素、異鼠李素、柚皮素等。研究[16]顯示槲皮素可通過抑制NF-κB p65蛋白表達，降低IL-6等炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎及保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。山奈酚能顯著抑制MAPK通路的激活，降低IL-8、IL-10、MDC等炎癥因子產(chǎn)生，從而有效抑制炎癥發(fā)生[17]。Leyva-López等[18]研究證實木犀草素是重要的促炎細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑，可抑制炎癥反應(yīng)中的活性氧和一氧化氮(NO)等介質(zhì)，減少細(xì)胞因子的表達和分泌。此外，柚皮素可通過抑制LRP3炎癥小體活化，進而降低肺組織中TNF-α、IL-1B和IL-18等炎癥因子的含量[19]。分子對接結(jié)果顯示所篩選的高度值化合物與核心靶點間均具有較好的結(jié)合活性；此外，黃芩素、蘆薈大黃素等化合物在分子對接中也展現(xiàn)出了較好的對接活性。

靶點-化合物、靶點-化合物-中藥等網(wǎng)絡(luò)直觀呈現(xiàn)了中藥在干預(yù)CS方面具有多種類、多成分、多靶點的特點。同時，化合物度值及對應(yīng)靶點數(shù)也體現(xiàn)了銀杏葉、敗醬草、甘草等中藥在干預(yù)CS上的重要性。實驗證實銀杏葉及其提取物可干預(yù)小鼠Ghrelin-Obestatin信號通路，降低血清中TNF-α、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子含量，減輕炎癥反應(yīng)、改善肺功能[20]。敗醬草可降低炎癥模型大鼠血清中IL-6、IL-8和TNF-α的含量[21]，且具有清熱解毒的功效，是疏風(fēng)解毒膠囊的主要佐藥[22]。Dai等[23]發(fā)現(xiàn)甘草、菊花、射干等是新冠肺炎治療的常用中藥，這些中藥均能較好地抑制TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生。由甘草、射干等中藥組成的清肺排毒湯作為新冠肺炎治療的主要方劑，能顯著降低促炎因子釋放，具有強大的體內(nèi)外抗炎活性[24]?？鄥A作為苦參的主要成分，其治療新冠肺炎的臨床療效已得到證實；此外，苦參中含有的黃酮類化合物也具有明顯的抗炎活性，能顯著抑制促炎性細(xì)胞因子NO、TNF-α、IL-6及MCP-1等釋放[25]。

性味分析顯示具有干預(yù)CS潛能的中藥藥味以苦為主，藥性以寒最常見。中醫(yī)理論認(rèn)為苦味中藥“能泄、能燥、能堅”；且多具有清泄火熱、泄降氣逆、通泄大便、瀉火存陰等功效。CS引起的急性肺損傷患者多有燥熱內(nèi)結(jié)、腑氣不通、腹脹痞滿等癥候，苦味中藥之應(yīng)用可發(fā)揮通氣瀉下、廓清熱邪的作用。寒性中藥多有清熱解毒、瀉火涼熱之功效，而CS所致的COVID-19屬中醫(yī)“溫?zé)岵　狈懂?，主要表現(xiàn)多為發(fā)熱、咳嗽等，應(yīng)用寒性中藥正符合中醫(yī)熱者寒之的基本治則。與此同時，具有干預(yù)CS潛能的中藥多入肝經(jīng)、肺經(jīng)，肝為將軍之官，肺為機體宣發(fā)肅降之臟。《素問·陰陽應(yīng)象大論》有“肺居膈上，其氣肅降；肝居膈下，其氣升發(fā)；肝升才能肺降，肺降才能肝升”的記載，可見只有肝肺兩臟升降相宜才能保證人體氣機舒展氣血正常運行，進而恢復(fù)患者的呼吸功能。由此可見，中醫(yī)藥干預(yù)CS可從清熱瀉火、活血化瘀及補益肺氣等方面入手。

綜上所述，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接和數(shù)據(jù)挖掘等方法，以CS相關(guān)的靶點為切入點，較為系統(tǒng)地探討了中藥干預(yù)CS的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其用藥規(guī)律。在一定程度上為中醫(yī)藥干預(yù)CS及其相關(guān)疾病提供了理論支持，也為進一步開發(fā)干預(yù)CS的藥物提供了新思路。