陳贊鴻，朱靜琳，林靈茵，郭思雨，黃美熒，徐文艷，黃洪波，陶移文*

1廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2廣東省分子靶標(biāo)與臨床藥理學(xué)重點實驗室，廣州 511436

紅樹林生活在惡劣的環(huán)境中，例如高溫高鹽低氧、浸水的土壤、潮汐運動、強風(fēng)和海浪等，這為真菌、細菌和其他微生物提供了獨特的棲息地[1]。紅樹林來源真菌因其獨特的生存環(huán)境而產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的次級代謝物，并對多種抗炎藥、新穎抗生素、抗真菌藥和抗癌藥等先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)做出了重要貢獻[2,3]。煙曲霉(Aspergillusfumigatus)是一種腐生性營養(yǎng)真菌，主要棲息于土壤中，是侵襲性曲霉病最常見致病菌[4]，其孢子和一些代謝成分容易通過空氣傳播引起人類肺部疾病感染，如真菌過敏性哮喘、變態(tài)反應(yīng)性支氣管肺曲菌病和侵襲性肺曲霉菌病等[5]。煙曲霉菌屬分布在世界各地，生存適應(yīng)度高、繁殖能力強、代謝產(chǎn)物多樣[6]。據(jù)文獻報道，2006年至2016年從煙曲霉中分離到220多種具有良好活性的次生代謝產(chǎn)物[7]，主要的代謝產(chǎn)物有聚酮類化合物[8]、二酮哌嗪類衍生物、生物堿類、煙曲霉素類和喹啉類衍生物等[9]。其中，二聚萘并吡喃酮類化合物對多種致病菌具有中等抑菌活性[10]，對多種癌細胞均表現(xiàn)出一定的抑制活性[11]，同時還具有致突變[12]、抗氧化與相關(guān)酶的抑制等活性[13]。本課題組前期研究表明，來自海南省東寨港自然保護區(qū)紅樹林植物無瓣海桑內(nèi)生真菌AspergillusfumigatusSAS10大米發(fā)酵培養(yǎng)代謝產(chǎn)物豐富。前期研究從該菌株獲得了5個吡喃酮類化合物和2個酯類化合物[14]。本文在前期工作基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究其大米發(fā)酵代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分和抗菌活性，以期發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)獨特、抗菌活性顯著的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

超凈工作臺(SJ-CJ-2FDQ型，蘇州蘇潔凈化有限公司)；搖床(上海紫裕生物)，烘干箱；恒溫培養(yǎng)搖床(THZ-1038，太倉市實驗設(shè)備廠)；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(HPX-9162 MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(XHRE-2000C，上海霄漢實業(yè)發(fā)展有限公司)；蒸汽滅菌鍋(日本松下健康醫(yī)療器械株式會社 MLS-3781L-PC)；色譜純乙腈(瑞典Oceanpak公司)；超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JEOL 400NB 核磁共振波譜儀(日本電子株式會社)；安捷倫7890B型氣相色譜儀(美國Agilent 公司)；安捷1260 Infinity 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；安捷倫7200型質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Triple TOFTM 5600高分辨質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX公司)；高效液相系統(tǒng)(LC-20A和LC-20AD，島津)；Sharpsil-AQ C18半制備柱(10 mm × 250 mm，5 μm，上海煊美實業(yè))；硅膠薄層板(HS-GF254，青島海洋化工廠分廠)；硅膠(200～300、300～400目，青島海洋化工廠分廠)；真空干燥箱(DZF系列，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；超凈水機(MILLI-Q)；低溫冷凍離心機(CT18RT，Techcomp)；全波長酶標(biāo)儀(Epoch，美國BioTek公司)；大米培養(yǎng)基(85 g大米加160 mL的2 g/L的粗海鹽水，高壓滅菌)；MH肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司)；二甲基亞砜(上海麥克林生化科技有限公司)；PBS緩沖液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；色譜純乙腈(瑞典Oceanpak)；色譜純甲醇(美國Merck 公司)；其余石油醚、乙酸乙酯等分析純試劑均為國產(chǎn)(上海泰坦科技股份有限公司)。

選用分離自海南省東寨港紅樹植物無瓣海桑(Sonneratiaapetala)莖部組織的菌株AspergillusfumigatusSAS10為研究材料，植物組織經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院鄭國棟教授鑒定，現(xiàn)保存于廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 發(fā)酵、提取與分離

將菌種接種于PDA培養(yǎng)皿培養(yǎng)3天，單菌落接種于裝有150 mL葡萄糖蛋白胨酵母膏(GYP)液體培養(yǎng)基中，在搖床上120 r/min，25 ℃培養(yǎng)3天，制成種子液后接種5 mL于大米培養(yǎng)基中，靜置40天。

發(fā)酵產(chǎn)物用等體積的甲醇浸泡48 h，攪拌均勻，紗布過濾得粗提液，重復(fù)5次。收集粗提液后減壓旋蒸至無甲醇，以等體積乙酸乙酯萃取5次，合并，旋干得浸膏602 g。

粗提物經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析分離，采用石油醚-乙酸乙酯(體積比為100∶0、80∶20、67∶33、50∶50、33∶67、20∶80、0∶100)系統(tǒng)梯度洗脫，不同梯度使用洗脫有機溶劑5 L，獲得7個(Fr.A～Fr.G)不同極性段的組分。各組分經(jīng)檢測分析后，將Fr.F(97.90 g)進行正相硅膠(300～400目)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(50∶50→0∶100)梯度洗脫，相應(yīng)獲得組分Fr.F1～F6，對Fr.F3(23.4 g)進行正相硅膠(300～400目)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(體積比為50∶50→0∶100)梯度洗脫，相應(yīng)獲得組分Fr.F3A～F3R，合并Fr.F3D～F3E(2.78 g)，用半制備HPLC進行分離，流動相分別為乙腈-水(65∶35，V/V)，流速為2 mL/min，檢測波長為220 nm和280 nm，得到化合物1(12.1 mg，tR=21.472 min)、2(3.2 mg，tR=27.491 min)、4(5.4 mg，tR=24.582 min)；對Fr.G(3.3g)通過半制備HPLC進行分離流動相分別為乙腈-水(65∶35，V/V)，流速2 mL/min，檢測波長為220 nm和280 nm，得到化合物5(14.6 mg，tR=23.106 min)；再將Fr.F2(2.3 g)進行分離，流動相分別為乙腈-水(75∶25，V/V)，流速為2 mL/min，檢測波長為220 nm 和266 nm，得到化合物8(7.8 mg，tR=20.207 min)；同理，F(xiàn)r.E段(147.22 g)進行正相硅膠(300～400目)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(50∶50→0∶100)梯度洗脫，獲得 7個組分(Fr.E1～E7)，將Fr.E5組分(3.69 g)進行正相硅膠(300-400目)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(50∶50→0∶100)梯度洗脫，獲得16組分(Fr.E5A～E5P)，F(xiàn)r.E5H段(1.3 g)用半制備HPLC進行分離，流動相分別為乙腈-水(75∶25，V/V)，流速為2 mL/min，檢測波長為 220 nm和280 nm，得到化合物3(4.1 mg，tR=29.045 min)和化合物6(35.4 mg，tR=27.923 min)；Fr.E5L(2.2 g)段用半制備HPLC進行分離流動相分別為乙腈-水(45∶55，V/V)，流速為2 mL/min，檢測波長為220 nm和280 nm，得到化合物7(11.2 mg，tR=21.113 min)。

1.3 抗菌活性測定

采用倍半稀釋法[15]測定化合物1～8對大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 29213)和兩種耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA N315和MRSA NCTC 10442)致病菌的抑制活性。將上述4株致病菌接入MH液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 200 r/mim恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h備用。取待用菌液，用PBS緩沖液稀釋至酶標(biāo)儀600 nm下OD值為0.1，再用MH肉湯稀釋100倍，即為實驗用菌液(1×106CFU/mL)。采用96孔板，每孔預(yù)先加入100 μL MH肉湯和100 μL樣品(200 μg/mL)，混合均勻，然后依次倍半稀釋，最后每孔添加100 μL實驗用菌液，即樣品最終濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781和0.390 μg/mL(每個濃度重復(fù)3個復(fù)孔)。將孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄0 h和24 h酶標(biāo)儀測量結(jié)果，計算抑制率。陽性對照為萬古霉素和鏈霉素，陰性對照為實驗用菌液和MH肉湯。

1.4 菌株分離與鑒定

將采自海南省東寨港紅樹林植物無瓣海桑Sonneratiaapetala莖部組織充分洗凈后剪成小塊，在濃度為75%的酒精中浸泡1 min，再用濃度為2%的次氯酸鈉溶液浸泡3 min，最后轉(zhuǎn)入濃度為75%酒精中浸泡30 s后，再用無菌水漂洗3次后平放于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至組織切面長出菌絲。用平板劃線法將菌絲接種至新的孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，直到平板上的菌落形態(tài)基本一致后接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，待真菌菌落基本覆蓋，記錄菌落生理生化特征，保存待用。

菌株SAS10經(jīng)DNA提取，PCR反應(yīng)，ITS序列測定，測定結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，選擇具有較高序列相似度的已有序列進行BLAST，并使用MEGA 7.0構(gòu)建進化樹，結(jié)果鑒定SAS10為Aspergillusfumigatus[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物3黃色粉末；分子式為C32H26O10，HR-ESI-MS：m/z571.160 4[M+H]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：7.39(1H，s，H-9)，7.31(1H，s，H-10)，6.61(1H，d，J=2.2 Hz，H-9′)，6.55(1H，s，H-3′)，6.26(1H，s，H-3)，6.09(1H，d，J= 2.2 Hz，H-7′)，4.01(3H，s，10′-OMe)，3.74(3H，s，8-OMe)，3.58(3H，s，8′-OMe)，3.44(3H，s，6-OMe)，2.55(3H，s，2′-Me)，2.44(3H，s，2-Me)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：169.1(s，C-2)，106.8(d，C-3)，184.1(s，C-4)，101.4(s，C-5)，102.0(s，C-6)，157.4(s，C-7)，117.8(s，C-8)，159.7(d，C-9)，161.1(d，C-10)，167.9(s，C-2′)，109.9(d，C-3′)，182.4(s，C-4′)，152.5(s，C-5′)，110.5(s，C-6′)，96.8(d，C-7′)，160.9(s，C-8′)，96.4(d，C-9′)，159.3(s，C-10′)，103.9(s，C-4a)，140.0(s，C-5a)，109.3(s，C-9a)，153.6(s，C-10a)，107.6(s，C-4a′)，140.3(s，C-6a′)，104.1(s，C-10a′)，155.0(s，C-10b′)，20.1(q，2-Me)，61.4(q，6-OMe)，56.0(q，8-OMe)，20.3(q，2′-Me)，55.1(q，8′-OMe)，56.4(q，10′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故化合物3鑒定為asperpyrone C。

化合物8黃色粉末；分子式為C16H14O5；ESI-MS：m/z287.09[M+H]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6):7.18(1H，s，H-10)，6.86(1H，s，H-9)，6.47(1H，s，H-7)，6.19(1H，s，H-3)，3.87(6H，s，6，8-OMe)，2.39(3H，s，2-Me)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)：168.7(s，C-2)，106.8(d，C-3)，183.7(s，C-4)，162.1(s，C-5)，160.2(s，C-6)，100.9(d，C-7)，161.4(s，C-8)，97.3(d，C-9)，98.2(d，C-10)，152.6(s，C-11)，103.5(s，C-12)，107.5(s，C-13)，140.8(s，C-14)，20.2(q，2-Me)，55.9(q，6-OMe)，55.5(q，8-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故化合物8鑒定為rubrofusarin B。

化合物1～8結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 化合物1～8的結(jié)構(gòu)

2.2 抗菌活性結(jié)果

化合物1～8在50 μg/mL濃度下的抑菌活性結(jié)果見表1。結(jié)果表明8種化合物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和兩種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用，其中化合物6對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA N315)的IC50為32.42 μg/mL，陽性對照藥萬古霉素對金黃色葡萄球菌的MIC為1.25 μg/mL，對兩種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MIC為0.675 μg/mL，鏈霉素對大腸桿菌的MIC為1.25 μg/mL。

3 討論與結(jié)論

本課題組研究了紅樹林內(nèi)生真菌AspergillusfumigatusSAS10次生代謝物的化學(xué)成分，利用各種分離純化和鑒定技術(shù)，從發(fā)酵液中提取分離得到7個二聚萘并吡喃酮類化合物和1個萘并吡喃酮角形單體，所有化合物均為首次報道的南海紅樹林內(nèi)生真菌煙曲霉次生代謝產(chǎn)物，為二聚萘并吡喃酮類化合物的獲取提供了新來源。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)及相關(guān)研究[21]，我們推測它們的生源合成途徑是醋酸-丙二酸途徑(見圖2)。7分子的乙酰輔酶A經(jīng)過一系列反應(yīng)可以得到線型萘并吡喃酮母核(如化合物8和11)和角型萘并吡喃酮母核(如化合物9和10)，然后在Gip1相關(guān)酶作用下[22]，將萘并吡喃酮單體羥基上的一個電子移除，形成結(jié)合氧自由基，再經(jīng)過共軛系統(tǒng)中電子重排導(dǎo)致單體上的碳活化，兩個碳活化單體通過自身或者互相偶聯(lián)，從而生成二聚體1～7。

圖2 化合物1～8可能的生源合成途徑

據(jù)文獻報道，該類化合物在抗菌和抗腫瘤等方面都表現(xiàn)出較好的活性。化合物1和4對人胰腺癌細胞PANC-1、乳腺癌細胞MDA-MB-231、人結(jié)腸癌細胞Caco-2和卵巢癌細胞SK-OV-3均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中1對 PANC-1 細胞表現(xiàn)出強細胞毒性，其IC50值為8.25 ± 2.20 μM[10]；2、6和8的抗細菌(枯草芽孢桿菌，大腸埃希氏菌和熒光桿菌)以及抗真菌(紅錐菌和白色念珠菌)活性較好，其中2對枯草芽孢桿菌、熒光桿菌的MIC均為1.9 μg/mL(陽性對照均為青霉素：0.78 μg/mL)，6對熒光桿菌和紅色毛癬菌的MIC均為7.8 μg/mL(陽性對照分別為青霉素：0.78 μg/mL和酮康唑：3.9 μg/mL)[23]；1、4、6和7對白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出弱的抑菌作用(前者陽性對照為兩性霉素B，后兩者陽性對照為氨芐青霉素鈉)[24,25]。我們的抗菌活性表明，化合物1～8對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和兩種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有不同程度的抑制活性，其中化合物6對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA N315)的IC50為32.42 μg/mL。另外，二聚萘并吡喃酮體對金黃色葡萄球菌(S.aureusATCC 29213)和兩種耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA N315和MRSA NCTC 10442)的抑制活性普遍比線型萘并吡喃酮單體的抑菌活性強，不同構(gòu)型(線型和角型)的二聚萘并吡喃酮類化合物的抑菌活性也存在一定的差異，后續(xù)我們將深入研究二聚萘并吡喃酮類化合物的抗菌構(gòu)效關(guān)系，為該類新型抗菌劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。