曾 麗，甘思言，杜鎣鎣，喬 石，張炎達(dá)，王全溪，黃一帆*，馬玉芳*

1中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；2福建農(nóng)林大學(xué)獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002；3福建貝迪藥業(yè)有限公司，寧德 355399

皂苷是一種甾體或三萜配糖類(lèi)物質(zhì)，廣泛存在于一些植物體內(nèi)，且隨著研究深入，它也被作為一種植物來(lái)源佐劑應(yīng)用于疫苗中[1]。研究表明，皂苷口服有一定佐劑作用，如口服藜蘆皂苷能增強(qiáng)卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)的免疫效果[2]，灌服人參莖葉皂苷能夠顯著提升被注射口蹄疫疫苗小鼠血清中特異IgG及亞類(lèi)滴度，且促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞增殖，上調(diào)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，強(qiáng)化應(yīng)答效果[3]。太子參參須皂苷(Radix Pseudostellariae fibrous roots saponins，RPFRS)是從太子參(Pseudostellariaheterophylla)參須中提取的活性成分，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫[4]、抗氧化[5]和抗應(yīng)激[6]等作用?，F(xiàn)在太子參以主根入藥，根須則棄之不用，造成極大浪費(fèi)，研究發(fā)現(xiàn)太子參參須中總皂苷平均含量是塊根中的1.14倍[7]。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，以皂苷為成分之一的太子參參須提取物可增強(qiáng)免疫損傷小鼠的機(jī)體免疫，具有顯著的調(diào)節(jié)免疫的作用[4]，推測(cè)其可能具有增強(qiáng)機(jī)體對(duì)于抗原的免疫應(yīng)答潛力。但目前關(guān)于太子參參須皂苷協(xié)助抗原免疫機(jī)體的效果鮮見(jiàn)報(bào)道，而常有研究利用OVA作為一種模式抗原來(lái)驗(yàn)證佐劑效力[8]，被OVA誘導(dǎo)的模型抗原會(huì)產(chǎn)生更高的IgG反應(yīng)，且小鼠脾臟細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ以及轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和T-bet的mRNA表達(dá)等同樣有所提高[9]。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)口服RPFRS對(duì)OVA模式抗原免疫小鼠的免疫佐劑效果，檢測(cè)其相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)，探討RPFRS對(duì)模式抗原OVA的免疫佐劑作用及可能的機(jī)理，為進(jìn)一步尋找高效、無(wú)毒、安全的中藥免疫佐劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 太子參參須皂苷

福建貝迪藥業(yè)有限公司惠柘榮縣所產(chǎn)太子參參須，太子參參須皂苷(RPFRS)采取醇提法自行完成提取，經(jīng)香草醛-冰醋酸法檢測(cè)可得皂苷濃度為48.9%。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性ICR小鼠，20±2 g，60只，福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)入。

1.1.3 主要試劑

金標(biāo)級(jí)卵清白蛋白(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：RD20C904)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào)：AC10238685)；胎牛血清(CellMax公司，批號(hào)：HQ202003)；磷酸鹽緩沖液(PBS，美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：PB20041309)；紅細(xì)胞裂解液、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)分別為：20191108、512C0310、127M4030V)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為：1223G054、20190125)；細(xì)胞因子ELISA試劑盒，特異性抗體及其亞類(lèi)ELISA試劑盒(上海邦奕生物有限公司，批號(hào)為：20201108、20201104、20201101)；APC Anti-Mouse CD3e、FITC Anti-Mouse CD4、PE Anti-Mouse CD8a(Tonbo Biosciences公司，批號(hào)分別為：85-17-0031-81、FMF004-1000U、CB4286178)。

1.1.4 主要儀器

V-1200可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；PCR儀(美國(guó)BIO-RAD Thermal Cycler)；Real-time PCR儀(QuanStudioTM 1 Real-Time PCR System)；ACEA NovoCyteTM流式細(xì)胞儀(美國(guó)艾森公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

60只雌性ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成對(duì)照空白組(CK)、OVA免疫對(duì)照組(OVA)、OVA+RPFRS低、中、高劑量組(50、100、200 mg/kg，即D、Z、G)。在第1～5天和第16～20天，除CK組和OVA組小鼠灌胃雙蒸水之外，其他組分別灌胃對(duì)應(yīng)劑量RPFRS。第6天和第21天，除CK組各只小鼠腹股溝皮下注射無(wú)菌PBS 0.2 mL外，其余各組各只小鼠腹股溝皮下注射OVA溶液0.2 mL，即其余各組每只小鼠OVA注射質(zhì)量為100 μg。飼養(yǎng)期間各組采食、飲水自由。第36天檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，小鼠摘眼球采血，頸椎脫臼法處死，其中每組各取4只進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定及脾臟T淋巴細(xì)胞亞群分析，剩余的細(xì)胞懸液進(jìn)行脾細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)；4只進(jìn)行脾臟自然殺傷細(xì)胞(NK)活性測(cè)定。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠脾T、B淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化率測(cè)定

1.2.2.1 脾淋巴細(xì)胞懸液制備

脾淋巴細(xì)胞的制備流程參考文獻(xiàn)[10]，無(wú)菌取脾，將脾臟置于研缽中研磨，加入3.75 mL PBS緩沖液后混勻，過(guò)濾，各組清楚標(biāo)記。1 500 r/min離心5 min后棄上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，PBS液洗滌，相同速度時(shí)間離心后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液2 mL，渦旋均勻，臺(tái)盼蘭法計(jì)數(shù)活細(xì)胞≥95%，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)到所需濃度。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

用96孔板，除試劑空白孔(只加培養(yǎng)液，無(wú)細(xì)胞)外，在每個(gè)孔里添加5×106個(gè)/mL脾細(xì)胞懸液100 μL，空白組孔只加100 μL RPMI 1640完全培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)孔分別加入4 μg/mL ConA稀釋液、10 μg/mL LPS稀釋液、10 μg/mL的OVA稀釋液各100 μL，各重復(fù)3孔。于37 ℃恒溫、5% CO2培育箱中44 h，各孔再分別添加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，2 000 r/min離心5 min，棄上清，每孔加入150 μL 酸性DMSO，低速遮光震蕩10 min，酶標(biāo)儀上波長(zhǎng)選492 nm，試劑空白孔調(diào)零后測(cè)定其余各孔的吸光度。參照文獻(xiàn)[11]公式計(jì)算：

刺激指數(shù)SI=實(shí)驗(yàn)孔OD值/空白孔OD值

1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟中NK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定

于96孔板中加入100 μL濃度為1×107個(gè)/mL的脾細(xì)胞懸液作為效應(yīng)細(xì)胞，另再取濃度為2×105個(gè)/mL YAC-1腫瘤細(xì)胞懸液(效靶比50∶1)100 μL加入上述含脾細(xì)胞的孔中，作為實(shí)驗(yàn)孔；另做效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔、靶細(xì)胞對(duì)照孔和空白對(duì)照孔。加液完畢后，于微量震蕩儀上震蕩片刻，置于5% CO2、37 ℃培育箱中4 h，各孔加入20 μL 5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；2 000 r/min離心5 min，去上清，各孔再加入150 μL酸性DMSO溶液(內(nèi)含4% 1N HCl)，避光，于細(xì)胞板振蕩器上振蕩，待甲瓚結(jié)晶完全溶解后，在酶標(biāo)儀492 nm處測(cè)OD值，根據(jù)公式算出NK細(xì)胞殺傷活性：

NK細(xì)胞活性=[靶細(xì)胞對(duì)照OD值-(實(shí)驗(yàn)組

OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值)]/靶細(xì)胞對(duì)照OD

值×100%

1.2.4 實(shí)驗(yàn)小鼠血清細(xì)胞因子及特異性抗體及其亞類(lèi)含量檢測(cè)

小鼠摘眼球取血后，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清，-20 ℃保存。用ELISA法檢測(cè)血清細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)以及特異性抗體OVA-sIgG及其亞類(lèi)(IgG1、IgG2a、IgG2b)含量，具體操作方法見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)小鼠脾細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)檢測(cè)

采用qRT-PCR檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ)及轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3)mRNA相對(duì)表達(dá)量，具體操作及引物序列按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[10,11]。計(jì)算公式參照文獻(xiàn)[12]：相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，△△Ct=(Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組管家基因)-(Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組管家基因)。引物序見(jiàn)表1。

表1 基因及引物序列

1.2.6 實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群分析

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第2次免疫后兩周的小鼠脾臟中的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及CD4+/CD8+的比例。將CD3、CD4、CD8三個(gè)抗體用滅菌中性PBS稀釋至0.05 μg/μL備用。而后各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中分別加入稀釋后的CD3、CD4和CD8抗體各10μL，混勻；分別設(shè)單克隆抗體單標(biāo)管各1支(共3支)、1支空白管(不加染料)。4 ℃下孵育15 min(避光)；各管分別加入1 mL紅細(xì)胞裂解液(1×)，混勻靜置15 min(避光)，1 500 r/min離心5 min棄上清；分別各用1 mL pH值呈中性的PBS洗滌沉淀兩遍；最后用300 μL的PBS將沉淀重懸后置于冰上，立刻上流式細(xì)胞儀機(jī)器檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 24.0軟件上應(yīng)用單因素方差分析(one-way ANOVA)，LSD法多重比較，顯著差異用P<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表2可知，與OVA組相比，RPFRS各劑量組對(duì)T細(xì)胞和OVA的SI均差異顯著(P<0.05)，D組顯著提高B細(xì)胞SI(P<0.05)。

表2 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.2 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響

由表3可知，RPFRS各劑量組與OVA組的NK細(xì)胞殺傷活性差異不顯著(P﹥0.05)，但RPFRS各劑量組均對(duì)于NK細(xì)胞的殺傷力有一定程度的提升，且以D組效果最好。

表3 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響

2.3 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中細(xì)胞因子含量的影響

由表4可知，與OVA組相比，D組和G組IL-2、IL-4含量升高(P<0.05)，G組IFN-γ含量升高(P<0.05)。

表4 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量的影響

2.4 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中特異性抗體及其亞類(lèi)含量的影響

由表5可知，與OVA組相比，各劑量RPFRS組的OVA-IgG和OVA-IgG1含量有顯著提高(P<0.05)，D組和G組OVA-IgG2a含量顯著提高(P<0.05)，D組和Z組的OVA-IgG2b含量顯著提高(P<0.05)。

表5 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清中特異性抗體IgG及亞類(lèi)IgG1、IgG2a和IgG2b含量的影響

2.5 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟細(xì)胞因子與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)情況的影響

RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠脾淋巴細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響如圖1所示：與OVA組相比，RPFRS各劑量組IL-2 mRNA、IL-4 mRNA和IFN-γmRNA相對(duì)表達(dá)量增高(P<0.05)，G組IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)(見(jiàn)圖1A)，RPFRS各劑量組對(duì)T-bet、GATA相對(duì)表達(dá)量和T-bet/GATA-3比值的提升也均不顯著(P>0.05)(見(jiàn)圖1B、1C)。

圖1 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)量的影響

2.6 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群影響

RPFRS對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響見(jiàn)圖2。與CK組相比，RPFRS組的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)均顯著提升(P<0.05)，OVA組的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)，D、G組及OVA組CD4+/CD8+比值顯著提高(P<0.05)；與OVA組相比，RPFRS組的CD3+、CD8+T細(xì)胞數(shù)和CD4+/CD8+比值顯著提高(P<0.05)，對(duì)CD4+T細(xì)胞的提升作用以D、Z組最為明顯(P<0.05)。

圖2 RPFRS對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群的影響

3 討論

T、B細(xì)胞能識(shí)別抗原，啟動(dòng)機(jī)體免疫，激活細(xì)胞增殖[13]，而是否能誘導(dǎo)有效T、B淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力則可以通過(guò)刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)來(lái)顯示[14]。人參莖葉皂苷能增強(qiáng)口蹄疫疫苗的效價(jià)，在ConA和LPS分別刺激作用下淋巴細(xì)胞的增殖[15]；三七根人參皂苷可顯著提升ConA、LPS和OVA各自誘導(dǎo)的被OVA免疫過(guò)的小鼠脾細(xì)胞增殖效果[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Z組能夠協(xié)同ConA促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，而Z、G組能更明顯地協(xié)同LPS以及OVA顯著促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖，說(shuō)明RPFRS能通過(guò)提升脾細(xì)胞增殖來(lái)升高體液、細(xì)胞免疫，對(duì)免疫OVA小鼠T、B細(xì)胞活力都有提高作用。

NK細(xì)胞具有天然的殺傷功能，機(jī)體固有免疫的激活能促使NK細(xì)胞的分泌，在自身免疫疾病當(dāng)中起到至關(guān)重要的作用。Li等[17]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能降低由于達(dá)沙替尼抑制的NK細(xì)胞殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPFRS組都能一定程度提高NK細(xì)胞活性，而其中低劑量RPFRS更為有效，使得YAC-1的被殺傷率更高，證明RPFRS能夠提升免疫OVA小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫過(guò)程，增強(qiáng)小鼠非特異性免疫的功能。

Th細(xì)胞包括Th1細(xì)胞(產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等)和Th2細(xì)胞(產(chǎn)生IL-4、IL-6、IL-10等)，Th1可激活促炎反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化、CTL細(xì)胞增殖；Th2促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖以及抗體的產(chǎn)生，Th1和Th2的平衡調(diào)節(jié)著機(jī)體的免疫反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RPFRS組IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ細(xì)胞因子含量升高，顯示RPFRS能促進(jìn)Th2型且也能促進(jìn)Th1型免疫，提高細(xì)胞因子分泌程度，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體免疫。由此可知，口服RPFRS對(duì)于上述兩種類(lèi)型免疫都有促進(jìn)作用，這可使其在臨床應(yīng)用方面有更廣的發(fā)展空間。

機(jī)體抗體亞類(lèi)的產(chǎn)生受不同細(xì)胞因子的影響，Th1型細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a，而Th2促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IgG1[18]。Sun等[19]通過(guò)對(duì)原人參二醇和三醇皂苷聯(lián)合OVA免疫小鼠后發(fā)現(xiàn)，二者都能提高免疫小鼠的OVA特異性抗體IgG。合歡皮總皂苷AJS75組分也被探究發(fā)現(xiàn)，它顯著提高OVA的免疫效價(jià)，激活小鼠Th1/Th2應(yīng)答[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各劑量RPFRS組比OVA組更能提升OVA特異性IgG抗體及其亞類(lèi)含量，說(shuō)明RPFRS能夠促進(jìn)Th1及Th2型免疫，刺激機(jī)體分泌特異性抗體，這與上述文獻(xiàn)中的結(jié)果保持一致。

T-bet和GATA-3與Th1/Th2的分化密切相關(guān)，二者可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌及mRNA的表達(dá)等進(jìn)而影響Th1/Th2之間的動(dòng)態(tài)平衡[21]。Su[22]的研究表明，人參皂苷Rg1和Re能通過(guò)提升IFN-γ等相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，來(lái)提高由OVA引起的小鼠免疫力。Wang等[23]在小鼠身上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，人參莖葉總皂苷與硒聯(lián)合可通過(guò)上調(diào)T-bet/GATA-3 mRNA的表達(dá)，從而對(duì)偽狂犬病減毒疫苗的免疫應(yīng)答呈佐劑作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中劑量RPFRS能顯著提高IL-4 mRNA的表達(dá)、高劑量RPFRS顯著促進(jìn)IL-10 mRNA的表達(dá)，且RPFRS各組均能一定程度提升T-bet、GATA-3表達(dá)及T-bet/GATA-3之比，說(shuō)明RPFRS既能夠通過(guò)促進(jìn)有關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)Th1/Th2反應(yīng)的產(chǎn)生，從而提升機(jī)體的細(xì)胞免疫作用，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)OVA的應(yīng)答。

T淋巴細(xì)胞亞群情況展示了機(jī)體整體的細(xì)胞免疫狀態(tài)，CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量以及CD4+/CD8+的比例平衡可顯示機(jī)體免疫狀態(tài)[24,25]，其中CD4+和CD8+T細(xì)胞主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo)[26]。Qi等[27]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2及其主要代謝產(chǎn)物R-PHQ和S-PHQ可提高環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫功能低下小鼠的免疫應(yīng)答：通過(guò)阻止免疫器官萎縮，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，恢復(fù)CD4+/CD8+比例。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)OVA組，RPFRS各組均能顯著提升CD3+、CD8+T細(xì)胞數(shù)及CD4+/CD8+比值，D、Z組能明顯提高CD4+T細(xì)胞數(shù)，說(shuō)明RPFRS具有平衡機(jī)體，提升T細(xì)胞免疫，加大免疫應(yīng)答的作用。

通過(guò)以上指標(biāo)測(cè)定的結(jié)果顯示，RPFRS能提升OVA免疫后的小鼠的體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答，比OVA免疫對(duì)照的小鼠更能夠持久地讓機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)答和提升小鼠免疫功能，證明RPFRS具有作為免疫佐劑的良好潛力，實(shí)驗(yàn)中不同劑量太子參參須皂苷作用時(shí)，三種劑量在某些指標(biāo)上各有優(yōu)勢(shì)，因此需對(duì)最優(yōu)濃度做進(jìn)一步篩選，同時(shí)，太子參參須皂苷具體有效成分及作用機(jī)制尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。