馮楠楠，李青青，沐 琦，林珊愉，劉圣權(quán)，李浩君，李春遠(yuǎn)，熊亞紅

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物基材料與能源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/材料與能源學(xué)院, 廣東 廣州510642；2 廣東新科農(nóng)生物科技有限公司, 廣東 韶關(guān) 512000)

近年來，全球氣候變暖和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的變化導(dǎo)致植物病害頻繁暴發(fā)，對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅[1]，例如禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum可引起小麥赤霉病，多在小麥穗期和苗期發(fā)生，導(dǎo)致苗腐、桿腐和穗腐[2]，尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum可引起番茄枯萎病，侵染植株導(dǎo)管組織，使得植株萎蔫[3]?；瘜W(xué)防治由于見效快一度成為我國病害防治的重要手段，但用量大、毒性強(qiáng)、殘留多等問題也給環(huán)境造成了嚴(yán)重威脅[4]。植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物屬于天然產(chǎn)物，通常毒性低、易降解，是發(fā)掘新的環(huán)境友好的抗菌活性物質(zhì)的重要資源[5]，紅樹林真菌代謝產(chǎn)物是其中的研究熱點(diǎn)[6]。高粱附球菌Epicoccum sorghinumL28是我們分離自海洋紅樹林植物苦檻藍(lán)Myoporum bontioidesA. Gray葉片的1株內(nèi)生真菌，前期曾從中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)具有抗菌活性的新化合物[7]。本文研究其代謝產(chǎn)物的分離、鑒定及抗植物病原菌活性，以期找到有潛力的防治植物病害的活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

LCMS-IT-TOF 液質(zhì)聯(lián)用儀，日本Shimadzu公司生產(chǎn)；Bruker AV600核磁共振波譜儀，德國Bruker Biospin GmbH 公司生產(chǎn)。硅膠柱填料(50 ～80 μm)，中國青島海洋化工有限公司生產(chǎn)；其余所有分離溶劑均為分析級(jí)。三唑酮，中國上海Aladdin生化科技有限公司生產(chǎn)。

高粱附球菌Epicoccum sorghinumL28于2018年6月從中國雷州半島半紅樹林植物苦檻藍(lán)Myoporum bontioides葉片中分離得到。其種屬已通過形態(tài)學(xué)、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)rDNA序列(Genbank No. MZ378789) 和β-微管蛋白 (βtub2)基因序列(Genbank No. MZ407981)得到鑒定并報(bào)道[7]。它與禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum保藏在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院。

1.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將E. sorghinumL28菌株接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基，28 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)5～7 d活化。在1 000 mL錐形瓶中裝入100 g 秈米，100 mL水，于121 ℃ 高溫高壓滅菌30 min后接種活化后的E. sorghinumL28菌株，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)30 d，共培養(yǎng)100瓶。

1.3 發(fā)酵產(chǎn)物的分離與提取

用φ為95%乙醇溶液浸泡菌種，重復(fù)3次，每次浸泡3 d。將乙醇提取液濃縮，用乙酸乙酯萃取3次，濃縮后經(jīng)硅膠柱層析法分離代謝物，按照石油醚∶乙酸乙酯體積比 10∶0～0∶10、乙酸乙酯∶甲醇體積比10∶0～5∶1梯度洗脫，再借助硅膠柱色譜進(jìn)行分離，得到化合物1～10。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

通過分析化合物的氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR)、電噴霧質(zhì)譜(ESIMS)、電噴霧高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)等試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并與文獻(xiàn)或標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，鑒定化合物1～10的結(jié)構(gòu)。

1.5 抗菌活性測試

采用二倍稀釋法[8]測試化合物對(duì)小麥赤霉菌F. graminearum和番茄枯萎菌F. oxysporum的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)陽性對(duì)照選取三唑酮。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物及波譜數(shù)據(jù)

分離到10種化合物，在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =3∶1時(shí)得到化合物1 (1.7 mg)和化合物2(1.8 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶1 時(shí)用乙酸乙酯重結(jié)晶，而后用甲醇清洗晶體表面得到化合物3(30.5 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶1 時(shí)得到化合物 4 (20.9 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =7∶1時(shí)得到化合物 5 (1.7 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶3時(shí)分離得到化合物6和化合物7的混合物(79.5 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =10∶1時(shí)分離得到化合物8(14.7 mg)；在V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=10∶1 時(shí)分離得到化合物 9(3.8 mg)和化合物10(8.5 mg)。

鑒定化合物1～10分別為7-羥基-2，5-二甲基色原酮、Livistone A、Barceloneic acid A、Barceloneic lactone、2′-O-methylbarceloneate、Spirostaphylotrichin R、 Spirostaphylotrichin U、β-谷甾醇、β-胡蘿卜苷和β-腺苷。其中化合物1～7的波譜數(shù)據(jù)如下。

化合物1：黃色晶體。分子式C11H10O3，ESIMS(m/z)：191.1 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，acetone-d6)δH2.29 (d, 0.50 Hz, 3H), 2.70 (s, 3H), 5.94 (s, 1H),6.67 (d, 2.0 Hz, 1H), 6.68 (d, 2.0 Hz, 1H)。13C NMR(100 MHz, acetone-d6)δC179.5, 164.6, 161.8, 160.6,143.0, 117.2, 113.1,111.7, 101.5, 22.8, 19.7。

化合物2：無色粉末。分子式為C16H14O6，ESIMS (m/z)：335.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz,acetone-d6)δH6.66 (br s, 1H), 6.52 (br s, 2H), 5.06 (s,2H), 2.44 (s, 3H), 2.36 (s, 3H);13C NMR (150 MHz,acetone-d6)δC163.9, 162.2, 161.4, 155.6, 146.0,144.9, 143.5, 132.6, 116.7, 116.5, 115.0, 113.9, 106.0,56.4, 21.3, 17.2。

化合物3：乳白色粉末。分子式C16H16O7，ESIMS (m/z)：320.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz,acetone-d6)δH6.67 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.54(d, 3.0 Hz,1H), 6.49 (d, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (d, 1.8 Hz, 1H), 4.53(br s, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.18 (s, 3H);13C NMR (150 MHz, acetone-d6)δC171.9, 164.4, 159.3, 159.2,151.07, 147.8, 137.5, 132.5, 112.6, 105.7, 105.3,102.5, 101.0, 60.3, 55.8, 22.0。

化合物4：無色結(jié)晶。分子式為C16H14O6，ESIMS (m/z)：303.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz,acetone-d6)δH8.95 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 6.74 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.56 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.55 (d, 3.0 Hz, 1H),6.28 (d, 3.0 Hz, 1H), 5.17 (br s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.27(s, 3H);13C NMR (150 MHz, acetone-d6)δC167.8,156.9, 156.3, 153.9, 150.1, 145.0, 138.7, 128.9, 114.9,114.6, 111.9, 105.4, 103.3, 69.2, 55.5, 21.2。

化合物5：白色粉末。分子式C17H18O7，ESIMS(m/z)：335.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, acetoned6)δH11.02 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 6.70 (d, 3.0 Hz,1H), 6.49 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 5.95 (s, 1H),4.49 (d, 4.0 Hz, 2H), 4.07 (t, 5.6 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H),3.79 (s, 3H), 2.14 (s, 3H);13C NMR (150 MHz,acetone-d6)δC170.7, 162.2, 159.2, 158.0, 150.0,145.9, 137.0, 132.2, 110.6, 105.4, 103.9, 102.1, 101.0,58.8, 54.7, 51.8, 21.6。

化合物6 (和化合物7以物質(zhì)的量3∶5混合)：淡黃色固體。分子式C14H19NO6，HRESIMS (m/z)：298.129 5 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH7.05 (d, 10.0 Hz, 1H), 6.17 (t, 12.0 Hz, 1H), 5.93, (d,10.0 Hz, 1H), 4.74, (s, 1H), 4.09 (s, 1H), 4.01, (s, 3H),2.21 (m, 2H), 1.67 (s, 3H), 1.05 (t, 7.2 Hz, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δC197.1, 167.5, 153.2,150.5, 128.5, 120.9, 86.7, 73.5, 68.5, 64.5, 56.5, 23.6,23.5, 13.5。

化合物7 (和化合物6以物質(zhì)的量5∶3混合)：淡黃色固體。分子式C14H19NO6，HRESIMS (m/z)：298.129 3 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH7.12 (d, 10.0 Hz, 1H), 6.37 (t, 12.0 Hz, 1H), 5.97 (d,10.0 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 3.83 (s, 1H), 4.01 (s, 3H),2.27 (m, 1H), 2.10 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.08 (t, 7.2 Hz, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δC195.3,166.3, 154.0, 152.6, 127.3, 120.1, 90.4, 73.3, 73.2,64.5, 56.8, 23.6, 18.6, 13.2。

化合物8、化合物9和化合物10為β-谷甾醇、β-胡蘿卜苷、β-腺苷，均為真菌和天然產(chǎn)物中常見的化合物，數(shù)據(jù)略。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

所鑒定的10個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物的分子結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of compounds

化合物1的1H NMR譜δH6.67 (d, 2.0 Hz),6.68 (d, 2.0 Hz)苯環(huán)間位H信號(hào)表明存在1個(gè)1，2，3，5-四取代苯環(huán)，13C NMR譜除顯示6個(gè)苯環(huán)碳信號(hào)外，還顯示1個(gè)雙鍵及1個(gè)與苯環(huán)及雙鍵共軛的羰基碳信號(hào)δC179.5，這表明化合物1具有色原酮碳架。此外，1H NMR譜還觀察到2個(gè)甲基信號(hào)δH2.29、 2.70及1個(gè)未與其他質(zhì)子偶合的雙鍵H信號(hào)δH5.94。查閱文獻(xiàn)核磁數(shù)據(jù)[9]，鑒定為7-羥基-2，5-二甲基色原酮。

化合物2的1H NMR譜顯示了3個(gè)苯環(huán)H信號(hào)(由于儀器分辨率問題，未能觀察到明顯裂分)，結(jié)合13C NMR譜12個(gè)雙鍵碳及1個(gè)羰基碳信號(hào)，表明分子仍是二苯醚骨架，且與化合物3相比多1個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)，推測可能具有內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。1H NMR譜還顯示了1個(gè)連羥基的—CH2以及2個(gè)甲基信號(hào)。查閱文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)[10]，鑒定為Livistone A。

化合物3的分子式通過ESIMS (m/z)：320.1[M+H]+結(jié)合13C NMR確定分子式為C16H16O7。1H NMR 譜δH6.67 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.54 (d, 3.0 Hz, 1H),6.49 (d, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (d, 1.8 Hz, 1H) 的信號(hào)表明存在 2 個(gè) 1，2，3，5-四取代苯環(huán)；δH4.53 (br s,2H)是連羥基的亞甲基信號(hào), 3.80 (s, 3H)和2.18 (s,3H)分別是甲氧基和甲基信號(hào)，13C NMR譜除上述基團(tuán)外，還顯示了1個(gè)羧基碳信號(hào)δC171.9，剩余的取代基為滿足分子式推測可能是羥基。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，鑒定為Barceloneic acid A。

化合物 4的1H NMR 譜δH6.74 (d, 3.0 Hz, 1H),6.56 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.55 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.28 (d, 3.0 Hz, 1H)表明，其和化合物3一樣存在2個(gè)1，2，3，5-四取代苯環(huán)，δH5.17 (br s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.27(s, 3H)分別是1個(gè)連氧的亞甲基，1個(gè)甲氧基和1個(gè)甲基信號(hào)，δH8.95 (s, 1H), 8.55 (s, 1H)是2個(gè)酚羥基信號(hào)，表明化合物4仍然是二苯醚骨架。13C NMR譜還顯示了1個(gè)酯羰基信號(hào)，根據(jù)文獻(xiàn)[12]數(shù)據(jù)，鑒定為Barceloneic lactone。

化合物5的相對(duì)分子質(zhì)量比化合物3的多15，1H NMR及13C NMR與化合物3的十分類似，僅多出了 1 個(gè)甲氧基信號(hào)δH3.94 (s, 3H)，δC58.8，由于苯環(huán)碳化學(xué)位移值基本未變化，推測化合物5是化合物3羧基H被甲基取代的衍生物。根據(jù)文獻(xiàn)[13]數(shù)據(jù)，鑒定為 2′-O-methylbarceloneate。

化合物6和化合物7一起被分離到，通過氫譜積分比例發(fā)現(xiàn)二者大約以物質(zhì)的量3∶5的比例混合，碳譜顯示出28個(gè)碳，且每2個(gè)碳的化學(xué)位移值比較接近，推測這2個(gè)化合物是1對(duì)旋光異構(gòu)體?；衔?和7的HRESIMS (m/z)：298.129 5 [M+H]+結(jié)合13C NMR譜(共顯示28個(gè)C，按每個(gè)化合物14個(gè)C計(jì))表明每個(gè)化合物的分子式為C14H19NO6。通過1H-1H COSY以及氫譜積分，可以發(fā)現(xiàn)1H NMR 譜δH7.05 (d, 10.0 Hz, 1H)，5.93 (d, 10.0 Hz,1H) 是1對(duì)雙鍵上的H，結(jié)合異核單量子關(guān)系(Heteronuclear singular quantum correlation,HSQC)的13C NMRδC153.2, 120.9 的碳，再聯(lián)系197左右的碳，推測分子中存在1 個(gè)α，β-六元環(huán)的烯酮結(jié)構(gòu)單元。1H NMR譜δH6.17 (t, 12.0 Hz, 12-H) 的雙鍵化學(xué)位移偏向低場，同時(shí)觀察到它和δH7.05弱的1H-1H COSY相關(guān)信號(hào)，再根據(jù)偶合常數(shù)和氫譜積分可以判斷其一端與前述烯酮的雙鍵相連且形成共軛，1H-1H COSY相關(guān)信號(hào)和積分比例顯示，其另一端與δH2.21 (m, 2H)的—CH2相連，該—CH2則與δH1.05 (t, 7.2 Hz, 3H)的甲基連接。此外，根據(jù)積分比例還可以判斷出1H NMR 譜中化合物6和7的混合物每個(gè)異構(gòu)體分子分別具有2個(gè)連氧的次甲基、1個(gè)甲氧基和1個(gè)甲基?？鄢總€(gè)分子中的雙鍵和羰基(δC120.0 ～197.1)所具有的不飽和度，表明分子中存在雙環(huán)結(jié)構(gòu)，結(jié)合分子式判斷可能還有1個(gè)五元環(huán)，查閱文獻(xiàn)[14]，鑒定二者為Spirostaphylotrichin R和Spirostaphylotrichin U的混合物，且物質(zhì)的量比為3∶5，并進(jìn)行了氫譜和碳譜的歸屬。

化合物8、化合物9和化合物10為真菌和植物中常見代謝產(chǎn)物，化合物8的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15-16]對(duì)比基本一致，化合物9和10波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17-18]基本一致，分別鑒定為β-谷甾醇、β-胡蘿卜苷和β-腺苷。

2.3 抗植物病原菌活性測定

采用二倍稀釋法測定化合物1～10對(duì)小麥赤霉菌和番茄枯萎菌的MIC，結(jié)果表明，化合物1對(duì)小麥赤霉菌的MIC為100 μg/mL，強(qiáng)于陽性對(duì)照三唑酮的150 μg/mL，同時(shí)其對(duì)番茄枯萎菌的MIC也為100 μg/mL，與陽性對(duì)照等效?；衔?對(duì)番茄枯萎菌的MIC為200 μg/mL，效果弱于三唑酮的100 μg/mL。在抗菌測試所測樣品最高質(zhì)量濃度為200 μg/mL的情況下，其余化合物仍有菌生長，即MIC數(shù)據(jù)均大于200 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

從高粱附球菌Epicoccum sorghinumL28的發(fā)酵物乙醇浸泡液中共分離得到10種化合物。我們?cè)鴱脑摼蛛x到9個(gè)二苯醚類新化合物，它們的結(jié)構(gòu)與本研究所得化合物均不相同[7]。本研究所得化合物除化合物2～5屬于二苯醚結(jié)構(gòu)類型外，還包括色原酮、生物堿、甾醇結(jié)構(gòu)類型，豐富了該菌的代謝產(chǎn)物庫，證實(shí)了該菌代謝產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣性?？咕鷾y試結(jié)果表明，化合物7-羥基-2，5-二甲基色原酮(化合物1)能強(qiáng)烈抑制禾谷鐮孢菌和尖孢鐮孢菌的生長，2′-O-methylbarceloneate (化合物 5)對(duì)尖孢鐮孢菌的生長具有中等抑制作用，可作為相應(yīng)的抗菌先導(dǎo)化合物開展深入研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道Livistone A具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50為2.1 ±0.2 μmol/L[19]，且其對(duì) H2O2誘導(dǎo)的 SH-SY5Y(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞)細(xì)胞損傷具有明顯的細(xì)胞保護(hù)活性[10]；Barceloneic acid A是一種新型溫和的法呢基轉(zhuǎn)移酶(Farnesyl protein transferase, FPTase)抑制劑，IC50為 40 μmol/L[11]；Spirostaphylotrichin R 具有抗氧化活性，對(duì)OH-的抑制作用較強(qiáng)，IC50為0.17 mmol/L，對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基；1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)和O2-自由基的清除作用較弱，IC50分別為0.50和5.15 mmol/L[20]。因此，它們也具有相應(yīng)的開發(fā)價(jià)值。本研究結(jié)果豐富了天然植物內(nèi)生真菌抗植物病原菌化合物庫，有利于抗菌農(nóng)藥的開發(fā)。此外，研究也為Livistone A、Barceloneic acid A、Spirostaphylotrichin R等活性物質(zhì)提供了新的菌種來源，有助于后續(xù)開展深入研究。