劉思源，王常安，王亞玲，張樹澤，陸紹霞，劉紅柏

（1.中國水產(chǎn)科學研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，遼寧 大連 116000；3.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；4.東北農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150070）

【研究意義】大鱗鲃（Barbus capito）屬于鯉科（Cyprinidae）、亮鲃屬（Luciobarbus），是烏茲別克斯坦當?shù)孛F的大型經(jīng)濟魚類之一，自2003 年引進我國。大鱗鲃作為雜食性魚類，食性廣、生長速度快[1]。目前，已在我國遼寧、河北、山東、天津、四川、江蘇、廣東等地和一些內(nèi)陸的鹽堿地進行了推廣養(yǎng)殖，均取得了良好的經(jīng)濟效益[2]。為進一步研究其高效專用的配合飼料，需要對其營養(yǎng)需求進行深入研究。蛋白質作為水生動物最主要的營養(yǎng)來源，需要降解為必需和非必需的氨基酸和小肽，才能促進魚體發(fā)育、維持免疫功能、調節(jié)魚體的代謝功能[3]。若飼料蛋白含量不足，會導致魚體的生長受限和飼料效率降低。飼料蛋白含量過高，氨基酸組成失衡，不僅造成蛋白質資源浪費，還會導致糞便和殘餌等引起的水質惡化現(xiàn)象[4-5]。當飼料中的氨基酸達到平衡時，魚體對飼料氨基酸能夠充分利用，從而顯著提高生長性能?！厩叭搜芯窟M展】有研究發(fā)現(xiàn)，當飼料蛋白添加低于魚類營養(yǎng)需求時，飼料的氨基酸用于維持魚類正常的生理代謝，有部分積累，魚體氨基酸沉積量受蛋白質水平影響顯著；而當飼料蛋白添加高于魚類需求時，參與正常生理代謝的蛋白質已得到滿足，魚體氨基酸沉積量趨于穩(wěn)定，故不受飼料蛋白水平影響[6-7]。在張靜等[8]對工業(yè)養(yǎng)殖大菱鲆（Scophthatmus maximusL.）幼魚的研究中有相似的發(fā)現(xiàn)，隨著飼料蛋白水平的升高，魚體肌肉氨基酸略有增加，但當飼料蛋白水平高于50%時，肌肉氨基酸積累趨緩[8]。Barreto-Curiel等[9]在不同蛋白水平下的蛋白質利用進行研究表明，40%蛋白水平下加利福尼亞灣石首魚（Totoaba macdonaldi）幼魚魚體的蛋白沉積率最高，43%處理組的肌肉中必需氨基酸富集顯著。另外，多項研究[10-11]表明，飼料蛋白質能夠影響甲狀腺功能，通過調控甲狀腺軸，刺激甲狀腺激素分泌，進而促進魚體生長。Eales 等[12]認為，三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）水平的適度提高，可增加細胞內(nèi)骨骼肌蛋白質合成相關mRNA 含量，促進魚體對氨基酸的吸收，增強魚體蛋白質的合成與積累。【本研究切入點】此前，國內(nèi)外學者通常從生長性能、飼料轉化、營養(yǎng)物質利用等方面來確認水生生物適宜的日糧蛋白水平。Yan等[13]以特定生長率為評價標準，研究得到點帶石斑幼魚（Epinephelus coioides）的最適飼料蛋白添加量為521.84 g/kg。王常安等[14]分別以大鱗鲃幼魚的增重率和飼料系數(shù)為評價指標，確定大鱗鲃幼魚的最適飼料蛋白水平為43.09%和44.15%。許紅等[15]根據(jù)大鱗鲃魚體日增加氨基酸和日維持氨基酸需要量兩者之和，得到大鱗鲃（初重（11.29±0.07）g）飼料中9 種必需氨基酸的最低含量。有關大鱗鲃對蛋白質、脂肪[16]、氨基酸[15]等營養(yǎng)素的需要量已確定，但關于大鱗鲃對飼料氨基酸組成及利用關系無相關研究?！緮M解決的關鍵問題】試驗研究飼料蛋白質水平對魚體氨基酸組成、沉積率及血清T3、thyroxine（T4）含量的影響，以魚體氨基酸沉積率為指標確定滿足大鱗鲃幼魚有效利用飼料中蛋白質的范圍，為配制大鱗鲃飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗飼料用酪蛋白、魚粉和小麥水解蛋白為蛋白源，魚油、豆油和磷脂為脂肪源，以糊精平衡能量。設計7 組不同蛋白水平飼料，含量分別為30.24%（G1），33.22%（G2），36.23%（G3），39.33%（G4），42.15%（G5），45.33%（G6）和48.12%（G7），配方及營養(yǎng)水平見表1[14]，氨基酸組成見表2。原料均過80 目篩后用鼓型混合機混合，膨化制粒（直徑為1.5 mm），然后置于-20 ℃冰箱中保存待用。

表1 基礎飼料配方及營養(yǎng)水平（風干基礎）Tab.1 Dietary formula and nutritional level（air-dry basis） %

表2 試驗飼料氨基酸組成及含量Tab.2 Amino acid profiles in the test diets %

1.2 試驗魚

試驗魚來自中國水產(chǎn)科學研究院鱘魚繁育技術中心，日齡70 d，初重為（11.07±2.42）g。選取魚體健康、規(guī)格一致的630尾大鱗鲃幼魚放入室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。用基礎飼料馴養(yǎng)14 d后開展養(yǎng)殖試驗。

1.3 飼喂與管理

試驗分7 個處理組，每處理3 個重復，每重復30 尾魚。試驗位于中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所第一車間，在玻璃缸水族箱（220 L）循環(huán)水系統(tǒng)中進行。試驗水為曝氣水，水溫（25.0±0.5）℃，溶氧＞6.0 mg/L，NH4+-N＜0.2 mg/L，pH值7.5～7.8，NO2--N＜0.1 mg/L，日換水量為全水量1/3。光照周期12 L∶12 D。日投喂4次（08：00，11：00，13：00，16：00），飽食投喂。養(yǎng)殖周期為56 d。

1.4 樣品采集

每個重復取6 尾全魚，置于20 ℃冰箱中保存待測。另取3 尾魚麻醉后抽取尾靜脈血，4 ℃靜置30 min，4 500 r/min 離心15 min后取上層血清，裝入1.5 mL離心管中，置于-80 ℃冰箱凍存，待用于T3、T4含量測定。

1.5 氨基酸組成測定

將置于-20 ℃冰箱的全魚解凍后，于電熱恒溫干燥箱中70 ℃下烘干后，稱量測定干物質含量。利用磨粉機將烘干后魚體研成魚粉，用索氏抽提法脫脂后待用于氨基酸測定。依據(jù)GB/T 50091124—2003以酸水解法，稱取40～50 mg 烘干脫脂后魚粉放入50 mL 安培瓶中并做好標記，加入6 mol/L 鹽酸10 mL，封管后放入恒溫干燥箱箱（110±1）℃中水解22 h，冷卻后打開安瓿瓶；加入6 mol/L 的氫氧化鈉溶液10 mL調節(jié)PH值，最后用0.02 mol/L的鹽酸定容至100 mL，充分混勻后即為試樣水解液。吸取試樣水解液及混合氨基酸標準液1 mL，經(jīng)過濾至動進樣瓶中并加蓋。采用日立L-8900氨基酸分析儀測定全魚和飼料樣品的氨基酸含量。色氨酸依據(jù)NY/T 57—1987 以堿水解法前處理，稱取40 mg 脫脂魚粉置于20 mL 具塞玻璃試管中，加入10%氫氧化鉀1 mL，混勻浸潤樣品，于恒溫干燥箱中40 ℃水解17 h，冷卻至室溫后加入0.2 mL 5%對二甲氨基苯甲醛和0.2 mL 1%硝酸鈉。搖勻后放入冰水中冷卻，加入5 mL濃鹽酸，震蕩后置于恒溫干燥箱中40 ℃顯色45 min。取出試管冷卻至室溫，然后定容至20 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清液，在590 nm波長處測定吸光值。氨基酸沉積率計算公式為：

1.6 T3、T4含量測定

T3、T4含量測定采用南京建成生物工程研究所提供的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（H222、H223）測定，測定方法按照說明書方法提供的干粉法操作。準備96孔酶標板，在酶標孔中加入樣品與標準品50 μL，每孔加入生物素抗原工作液50 μL，37 ℃反應30 min后棄去孔內(nèi)液體，加入洗滌液靜置30 s后棄去，重復洗滌5 次。拍干后每孔加入50 μL 親和素-HRP，37 ℃反應30 min 后棄去液體，洗板5 次。拍干后加入顯色液A、B各50 μL，37 ℃避光顯色10 min后，加入顯色反應終止液50 μL。在450 nm波長處測定吸光值。

1.7 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。用軟件SPSS 20.0 進行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較，顯著性水平P值為0.05。飼料氨基酸含量和魚體氨基酸含量的相關性分析采用Pearson Correlation（2-tailed）進行分析?；貧w曲線利用Excel 2010制作分析。

2 結果與分析

2.1 飼料蛋白質水平對大鱗鲃攝食和生長的影響

從表3 可見，飼料蛋白質水平33.22%處理組的體增重量和干物質含量顯著高于30.24%處理組（P＜0.05），隨著飼料蛋白水平的增加，兩者均呈先上升后下降趨勢，但無顯著性差異（P＞0.05）。當飼料蛋白水平達到42.15%時，魚體增重量和干物質含量達到最大值。

表3 飼料蛋白質水平對大鱗鲃攝食和生長的影響Tab.3 Effects of dietary protein levels on feeding and growth of Barbus capito

2.2 飼料蛋白質水平對大鱗鲃氨基酸組成的影響

從表4 可見，當飼料蛋白質水平達到33.22%時，除色氨酸與蘇氨酸外的蛋氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸等8種必需氨基酸含量、魚體氨基酸總量及必需氨基酸總量均顯著高于30.24%組（P＜0.05），其他處理組之間無顯著性差異（P＞0.05）。魚體的色氨酸含量隨著飼料蛋白含量增加呈顯著升高趨勢（P＜0.05）。在蛋氨酸、賴氨酸等10種必需氨基酸中，其中亮氨酸和賴氨酸在魚體氨基酸組成中的占比較高。不同蛋白水平飼料氨基酸和魚體氨基酸的相關性關系表現(xiàn)為極顯著的正相關（P＜0.01），相關系數(shù)介于0.994～0.995（表5）。

表4 飼料蛋白質水平對大鱗鲃魚體氨基酸組成的影響Tab.4 Effects of dietary protein levels on amino acids composition in the whole body of Barbus capito %

表5 不同蛋白質水平處理組的飼料氨基酸與魚體氨基酸的相關分析Tab.5 Correlation analysis between diets amino acids and the whole body aminoacids of Barbus capito fed on the experimental %

2.3 飼料蛋白質水平對大鱗鲃氨基酸沉積率的影響

表6表明，隨著飼料中蛋白質水平的增加，大鱗鲃全魚的蛋氨酸等10種必需氨基酸的氨基酸沉積率均呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05），蛋白質水平至33.22%時，全魚的必需氨基酸沉積率達到最高值，隨著蛋白水平的增加，全魚的必需氨基酸呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。全魚的氨基酸組成中甘氨酸的沉積率最高，必需氨基酸中蛋氨酸的沉積率最高，其次是賴氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸。氨基酸總量沉積率也在蛋白水平33.22%時達到最大，之后隨蛋白質的增加而顯著下降（P＞0.05）。

表6 飼料蛋白質水平對大鱗鲃氨基酸沉積率的影響Tab.6 Effects of dietary protein levels on amino acids retention in the whole body of Barbus capito %

以立方曲線擬合飼料蛋白質水平（x）與總必需氨基酸沉積率（y）的關系，得到回歸方程：y=0.012 7x3-1.534x2+59.931x-714.68（R2=0.902 5）（圖1）。根據(jù)計算得出必需氨基酸沉積率在最大值時對應的值為48.95%，對應的飼料蛋白質水平為33.33%；必需氨基酸沉積率達最小值對應的值為32.01%，對應的飼料蛋白質水平為47.20%。

圖1 飼料蛋白質水平和必需氨基酸沉積率的回歸分析Fig.1 Regression analysis between dietary protein levels and essential amino acid deposition rate of Barbus capito

2.4 飼料蛋白質水平對大鱗鲃血清中T3和T4含量的影響

從表7 可見，大鱗鲃血清T4 水平較T3 水平高，T3 的含量隨飼料中蛋白質水平的增加呈先升高后下降的趨勢（P＜0.05），蛋白質水平達到45.33%時，血清中T3、T4 的含量均達到最大值。蛋白水平達42.15%時，血清中T4的含量顯著上升（P＜0.05）。

表7 飼料蛋白質水平對大鱗鲃血清中T3和T4含量的影響Tab.7 Effects of dietary protein levels on the contents of T3 and T4 in serum of Barbus capito

3 討論

3.1 飼料蛋白水平與大鱗鲃魚體氨基酸組成及魚體氨基酸沉積率的影響

試驗結果表明，當飼料蛋白質水平達到33.22%時，除色氨酸與蘇氨酸以外的八種必需氨基酸含量、魚體氨基酸總量及必需氨基酸總量均顯著高于30.24%組（P＜0.05），其他處理組之間無顯著性差異（P＞0.05）。Jiang 等[17]對雜交石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatu♂s）的研究表明，飼料蛋白質水平與肌肉氨基酸組成無顯著性影響。Schwarz 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，鯉（Cyprinus carpio）的肌肉氨基酸組成也未受飼料蛋白水平的影響。這與本試驗的結果相似，Ye 等[19]對兩種不同體重的異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）幼魚研究發(fā)現(xiàn)，初始重量3.18 g處理組的肌肉氨基酸組成在不同飼料蛋白水平下無差異，但初始重量87.1 g處理組的肌肉氨基酸組成中的必需氨基酸總量和非必需氨基酸總量均隨著飼料蛋白水平的升高而增加。但本試驗研究發(fā)現(xiàn)，飼料蛋白水平33.22%組的氨基酸含量顯著高于飼料蛋白水平30.24%組，當飼料蛋白水平高于33.22%時，魚體的氨基酸并沒有隨著飼料的氨基酸含量增加而呈現(xiàn)顯著升高趨勢。分析認為，當飼料蛋白水平低于33.22%時，飼料中的氨基酸含量不滿足大鱗鲃的最低生長需求，表現(xiàn)為魚體的各種氨基酸含量均較低。

氨基酸是魚體合成蛋白質的基礎，飼料氨基酸的利用效率越高也說明飼料的品質越好，飼料中的氨基酸組成成分也更接近于氨基酸平衡。對斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和不同食性鯉研究表明魚體機體組織的必需氨基酸組成和飼料中的氨基酸的提供存在明顯的相關關系[20-21]。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，不同蛋白水平飼料氨基酸和魚體氨基酸之間的相關性系數(shù)介于0.994～0.995，均為極顯著的正相關關系，表明以酪蛋白、魚粉和小麥水解蛋白組成的蛋白混合物為蛋白源能夠滿足大鱗鲃對于氨基酸的需求。在不同蛋白水平處理組中，10種必需氨基酸中蛋氨酸的沉積率均為最高，其次是賴氨酸?？赏茰y出蛋氨酸是大鱗鲃的第一限制性氨基酸[18]，這也說明蛋氨酸在大鱗鲃幼魚生長發(fā)育中需求量較大。因此在后續(xù)的研究中，可考慮飼料中適量添加蛋氨酸以促進大鱗鲃生長。試驗結果表明，飼料蛋白水平達到33.22%時，魚體的各種氨基酸及氨基酸總量沉積率達到最高值。經(jīng)飼料蛋白質水平（x）與總必需氨基酸沉積率（y）回歸分析得出，在飼料蛋白水平達到33.33%時，魚體的總必需氨基酸沉積率達到最高值，魚體對飼料中的必需氨基酸利用最為高效。結合魚體增重量和魚體氨基酸含量可知，33.33%的飼料蛋白水平為滿足大鱗鲃生長的最低蛋白水平。以氨基酸沉積率為評定指標，飼料蛋白水平在33.33%～47.20%時，魚體能夠對飼料中的氨基酸有效利用，過高的蛋白水平則會造成蛋白資源的浪費。

3.2 飼料蛋白水平與大鱗鲃血清T3、T4水平的影響

飼料蛋白質通過調控甲狀腺軸來影響機體生長。T3 能夠促進氨基酸吸收，提高魚體蛋白質合成與沉積，從而促進魚類生長發(fā)育[22-23]。在低等脊椎動物中，甲狀腺激素的主要作用是促進生長和發(fā)育[24]。有報道表明，甲狀腺主要分泌T4 進入血液到肝臟，通過肝臟5’D 單脫碘酶脫碘轉化為T3。甲狀腺激素中T3 較容易進入細胞，并與核受體結合，且T3 的活性較T4 更高，更新更快[12]。故T3 更能代表甲狀腺的功能，是體內(nèi)發(fā)揮效能的主要甲狀腺激素[25]。飼料蛋白攝入量也會影響魚類甲狀腺激素的分泌[26]。試驗結果表明，飼料蛋白水平在30.24%～45.33%范圍內(nèi)，大鱗鲃血清中的T3 水平隨蛋白水平的升高而呈上升趨勢（P＜0.05）。虹鱒（Oncorhynchus mykiss）在長期禁食的情況下，虹鱒血清中的T3 和T4、肝核受體數(shù)量減少，但恢復飲食后，虹鱒血清中的T3 和T4 含量隨飼料攝入蛋白質量的增加而增加[27]。對黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）的研究報道稱，在饑餓15 d、30d 狀態(tài)下血清中T3 水平均顯著低于對照組（P＜0.05）[28]。這些試驗結果表明，飼料的蛋白質水平可調節(jié)魚體的甲狀腺激素分泌，對魚類血清T3、T4 含量存在顯著影響。

王桂芹等[29]對翹嘴紅鲌（Erythroculter ilishaeformis）幼魚的研究表明，血清T3 水平與飼料蛋白水平正相關，但對血清中T4的含量無顯著影響。試驗中血清T4含量在飼料蛋白水平在30.24%～39.33%范圍內(nèi)無顯著影響，但血清中T3的含量隨著蛋白水平升高而上升，這說明飼料蛋白水平的升高提高了5’D單脫碘酶的活性，從而促進了T4 向T3 的轉化，增強了核內(nèi)依賴于DNA 的RNA 聚合酶的活性，促進特異RNA的合成，進而促進蛋白質和相關酶的合成，從而促進魚體的生長與發(fā)育。飼料蛋白水平達到42.15%時，大鱗鲃血清中的T4含量顯著提高（P＜0.05）。這與當飼料蛋白水平達到42.15%時，魚體的增重量最高的結果一致?？赏茰y出當飼料蛋白水平變化較大時，可促進甲狀腺分泌。本試驗結果表明，血清中T3、T4水平與魚體的增重量呈正相關。這說明在一定的蛋白水平范圍內(nèi)，蛋白質攝入可以增加甲狀腺激素的分泌，促進大鱗鲃的生長。

4 結論

滿足大鱗鲃生長的最低蛋白水平為33.33%，其適宜飼糧蛋白水平應在33.33%～47.20%。飼料蛋白水平低于33.33%，無法維持大鱗鲃幼魚正常的生理需求；蛋白水平高于47.20%，不僅浪費飼料蛋白質資源，污染水質，還會引起大鱗鲃甲狀腺功能紊亂，降低大鱗鲃的生長性能。