陳玉秀，王婭娟，張 發(fā)，趙成法*

（1.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

土壤線蟲是指生活史的某個階段或終生生活于土壤中的線蟲，是土壤中最為豐富且生態(tài)功能最重要的動物之一〔1-2〕。根據(jù)其生活方式差異可分為腐生線蟲、食微生物線蟲和寄生線蟲。這類動物具有個體小、種類多、繁殖快、比表面積大和代謝快的特點〔2-3〕，在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)等生態(tài)過程中扮演著重要的角色〔1，4-5〕，同時由于對土壤因子的改變極為敏感，其多樣性和豐富度不僅是衡量整個土壤生態(tài)系統(tǒng)狀況的重要指標，也是農(nóng)田土壤健康與否的主要評判標準之一〔3，6-7〕。土壤植物寄生線蟲就危害程度而言僅次于植物病原微生物的病原體，也是眾多科研工作者研究的重點對象〔8-10〕。如何準確、快速地將線蟲從土壤中分離出來是相關(guān)研究不可避免的基礎(chǔ)問題，一個可靠、高效的分離方法是相關(guān)研究成功與否的關(guān)鍵。

目前常用的土壤線蟲分離方法主要有淺盤法、貝爾曼漏斗法和LUDOX TM 懸浮法等〔11-12〕。其中LUDOX TM 懸浮法雖具有較好的分離率，但操作繁瑣、成本較高，很難大規(guī)模使用。淺盤法操作簡便、成本較低，但因其僅利用線蟲的親水性進行分離，導(dǎo)致分離率較低，難以用于精確的定量研究〔13〕。與淺盤法相比，貝爾曼漏斗法不僅利用線蟲的親水性使之從土壤中游離出來，而且在重力作用下下沉到收集管，使分離率有所提高，是目前使用最多的方法〔13〕，但該分離方法依然無法滿足定量研究的需要〔14〕。

本研究在改良貝爾曼漏斗法〔15-16〕（簡稱“改良法1”）的基礎(chǔ)上再次進行改良（簡稱“改良法2”），并對線蟲分離率等進行評估，旨在探索更簡便、高效和低成本的土壤線蟲分離方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料高壓蒸氣滅菌鍋（致微（廈門）儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）；電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）；體式顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司）；微量移液器（熱電（上海）儀器有限公司）；培養(yǎng)皿（上海五一玻璃儀器廠）；30、35、120、500 目（φ=65 mm）圓形不銹鋼濾網(wǎng)（紹興市上虞區(qū)豪泉篩具廠）；三角漏斗（φ＝90 mm）、錐形瓶、燒杯（上海申立玻璃儀器銷售有限公司）；瓊脂、葡萄糖、液體硅膠（西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司）。

全齒復(fù)活線蟲（Panagrellus Redivivus）由大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫提供；土壤采集自大理大學(xué)后山茶園，除去大顆粒后，取部分進行間歇式高壓蒸氣滅菌處理（121 ℃、30 min）后備用。

1.2 方法

1.2.1 線蟲及土壤處理方法 全齒復(fù)活線蟲經(jīng)燕麥培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)6 d 后，采用貝爾曼漏斗法分離備用。

人工添加定量線蟲土壤樣品：土壤經(jīng)高壓滅菌，去除原有線蟲。稱取土壤樣品15 份，每份10 g，體視顯微鏡下用移液器在每份樣品中準確加入150條線蟲。

自然農(nóng)田土壤樣品（含不定量線蟲）：稱取未滅菌土壤樣品15 份，每份5 g。

1.2.2 不同分離方法線蟲分離率的測定 用人工添加定量線蟲的土壤樣品，按以下不同方法分離土壤線蟲，記數(shù)并計算分離率，每種方法重復(fù)3 次。

線蟲分離率= （分離出的線蟲數(shù)/總線蟲數(shù)）×100%。

淺盤法：參照毛小芳等〔13〕報道的土壤線蟲分離方法，并在其基礎(chǔ)上將淺盤改為培養(yǎng)皿，篩網(wǎng)和擦鏡紙換為1 層80 目尼龍紗網(wǎng)和2 層擦鏡紙。

貝爾曼漏斗法：按文獻〔16〕的土壤線蟲分離方法進行分離。

LUDOX TM 懸浮法〔14〕：將土壤樣品放入燒杯加入100 mL 沸水，冷卻后倒入35 目篩網(wǎng)（下接120目、500 目篩網(wǎng)）組合中，用流水緩慢沖洗至水流澄清。依次移除35 目和120 目篩網(wǎng)后，再用流水將500 目篩網(wǎng)內(nèi)物質(zhì)緩慢沖洗至流水澄清，最后用密度為1.18 g/mL 的硅膠溶液將500 目篩網(wǎng)內(nèi)的物質(zhì)完全沖至500 mL 燒杯中，攪拌均勻后靜置1.5 h，將燒杯中的上清液再次倒回500 目篩網(wǎng)，留在篩網(wǎng)上的物質(zhì)用流水完全沖至樣品瓶中即為土壤線蟲濾液。重復(fù)3 次操作后將線蟲濾液混合并計數(shù)。

改良法1：參照鐘雪超〔16〕報道的土壤線蟲分離方法，在該方法的基礎(chǔ)上修改而成，漏斗與紗網(wǎng)間增加不銹鋼網(wǎng)篩以支撐樣品。

改良法2：由改良法1 進一步調(diào)整改良。主要區(qū)別在于：（1）在乳膠收集管末端注入1~2 mL 含0.04 g/mL 葡萄糖的瓊脂以定向吸引線蟲；（2）將整個裝置置于27 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中以增強線蟲的活力〔17〕。裝置見圖1。

圖1 貝爾曼漏斗改良法2 操作裝置

1.2.3 不同分離方法測定自然農(nóng)田土壤線蟲分離的數(shù)量 按“1.2.2”項下方法分離和測定含不定量線蟲的自然農(nóng)田土壤中線蟲的數(shù)量，每種方法重復(fù)3 次。

1.2.4 不同分離方法分離時長與成本估算 記錄本研究的3 位參與者獨立完成1 份土壤樣品處理的實際操作時長即為操作耗時。分離成本為一次性耗材（擦鏡紙、葡萄糖、瓊脂、液體硅膠等）成本，按照市場價進行估算。

1.3 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)用Excel 軟件進行整理，用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分離方法線蟲分離率以人工添加定量線蟲的土壤樣品為實驗材料，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 懸浮法的分離 率 分 別 為（61.77±2.20）%、（72.44±1.37）%、（80.66±1.09）%、（94.89±2.27）%、（91.11±2.20）%。與其他4 種方法相比，改良法2 對線蟲的分離率分別提高了33.12%、22.45%、14.23%和3.78%。改良法2與淺盤法、貝爾曼漏斗法和改良法1 相比，線蟲分離率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 不同分離方法線蟲分離數(shù)量以自然農(nóng)田土壤樣品（含不定量線蟲）為實驗材料，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1、改良法2 和LUDOX TM 懸浮法分離得到的線蟲數(shù)量分別為（53.00±3.27）、（71.00±2.05）、（83.00±1.63）、（92.00±2.05）、（92.00±3.30）條。與淺盤法、貝爾曼漏斗法和改良法1 等三種方法相比，改良法2 分離出的線蟲數(shù)量分別增加了39、21、9 條，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 不同分離方法的耗時與成本操作單份樣品時，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1 和改良法2 均可在5 min 內(nèi)完成，LUDOX TM 懸浮法則需30~45 min；在分離成本方面，淺盤法、貝爾曼漏斗法、改良法1 和改良法2 分離1 份樣品的成本均在1.0 元以內(nèi)，而LUDOX TM 懸浮法的分離成本為7.5 元。結(jié)合線蟲分離率，改良法2 在操作耗時與成本方面具備更多優(yōu)勢。見表1。

表1 不同分離方法的操作耗時和成本

3 討論

實驗結(jié)果顯示，改良法2 和LUDOX TM 懸浮法的線蟲分離率無顯著差異，但顯著高于其他3 種方法（P<0.01）。LUDOX TM 懸浮法是蔗糖懸浮法的改進〔18〕，其分離原理相似，均利用蟲體與溶液的密度差進行分離〔15〕，但LUDOX TM 懸浮法很好地克服了高滲溶液易使蟲體脫水變形，不利于后續(xù)線蟲鑒定的缺點〔11，14，19〕。與改良法2 相比，LUDOX TM懸浮法在過篩懸浮前需加入熱水，通過高溫殺死土壤中的線蟲，因此該方法不能區(qū)分土壤中的線蟲活體與死體，對于需計數(shù)活體線蟲或需做后續(xù)活體線蟲實驗的研究不適用，加之該方法較為繁瑣，操作耗時和成本較高，不宜大規(guī)模使用。而改良法2 具有操作簡便、操作耗時少、成本低且分離出的線蟲大部分為活體的優(yōu)點，是LUDOX TM 懸浮法較好的替代方法。

貝爾曼漏斗法利用線蟲親水性使之從土壤中游離出來，然后在重力的作用下下沉到收集管中而達到分離線蟲的目的。該方法具有操作簡便、分離出的線蟲懸液雜質(zhì)少等優(yōu)點，是眾多線蟲研究者最常用的方法〔12，14〕。但由于該方法在操作時擦鏡紙等過濾層會緊貼于漏斗內(nèi)壁，增加了漏斗壁上的線蟲存留，不利于線蟲的下沉。因此對該方法進行了改良，產(chǎn)生了改良法1。該方法以圓形不銹鋼篩網(wǎng)支撐樣品，一方面減少了漏斗壁上的線蟲存留，另一方面增加了樣品與水的接觸面積，從而提高了線蟲分離率〔15-16〕。在此基礎(chǔ)上，基于24~30 ℃是線蟲活力最強的溫度的理論〔17〕和線蟲的趨化特性，改良法2 在收集管的末端加入了葡萄糖瓊脂定向吸引線蟲，同時將整個分離裝置置于27 ℃環(huán)境下增加線蟲的活力，使之更快地從土壤中游離出來。實驗結(jié)果顯示，改良法2 雖然略微增加了操作耗時和成本，但對線蟲的分離率明顯高于改良法1，是改良法1 良好的替代方法。

基于改良法2 的分離原理，由于不同類型的線蟲對物質(zhì)的趨化性不同，當需要分離某一特定類群時需對添加的趨化物做一定的調(diào)整。如CuSO4對甜菜孢囊線蟲的二齡幼蟲有極強的吸引作用〔20〕；秀麗隱桿線蟲對氯化鈉或異戊醇均有趨向性，且化學(xué)趨向性隨著溫度的增加而增強〔21〕。因此，在實際操作中可根據(jù)需求，選擇相應(yīng)的趨化物來提高對特定線蟲的分離率。

4 結(jié)論

改良法2 是在改良法1 基礎(chǔ)上改進得到的，其繼承了改良法1 操作簡便的優(yōu)點，在穩(wěn)定環(huán)境溫度提高線蟲游離速度的基礎(chǔ)上，通過趨化物的定向吸引使線蟲分離率得到提高。無論是基于分離率還是操作耗時及成本方面的考量，改良法2 均具備明顯優(yōu)勢，有較高應(yīng)用價值。