高玉婷，鄧 巍，張 發(fā)，李飛騰，3，楊曉燕，佘 容*

（1.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003；3.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理 671000）

自1928 年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，人類就開啟了抗生素時(shí)代，并由此改變了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)程，使得醫(yī)生可以治療足以致命的細(xì)菌感染，挽救了無(wú)數(shù)人的生命，使人類的平均壽命延長(zhǎng)到了77 歲〔1-3〕。同時(shí)，抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也發(fā)揮了極大的作用，如防治動(dòng)植物病害、刺激植物生長(zhǎng)〔4〕、作為獸類藥物使用等〔5-7〕，甚至有部分放線菌產(chǎn)生的抗生素還可作為農(nóng)業(yè)除草劑使用〔8〕。

由于抗生素在人類醫(yī)療、畜牧、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)等方面的廣泛使用和耐藥基因可在細(xì)菌間橫向轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，使得許多細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥性〔9〕，抗生素的治療效果顯著降低，耐藥菌株甚至超級(jí)細(xì)菌開始出現(xiàn)〔10〕。《2018 年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)》中指出，中國(guó)臨床分離菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率仍呈增長(zhǎng)趨勢(shì)〔11〕。面對(duì)細(xì)菌耐藥這一世紀(jì)難題，人類已意識(shí)到問(wèn)題的嚴(yán)重性，并加強(qiáng)了對(duì)抗生素使用的管理，盡量減少或避免使用抗生素〔12〕。另一方面，為解決已經(jīng)出現(xiàn)的耐藥問(wèn)題，人類也在積極開發(fā)新的抗生素或抗生素的替代物〔13-14〕。

放線菌是自然界廣泛分布的一類高（G+C）含量、大多數(shù)呈革蘭氏陽(yáng)性的單細(xì)胞原核微生物，多為腐生好氧、少數(shù)為寄生厭氧型〔15〕。它們能夠分解有機(jī)質(zhì)，在自然界的物質(zhì)循環(huán)中起重要作用；同時(shí)能夠產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，如抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑、植物病原真菌抑制劑、酶制劑等〔16〕。截至目前，人類發(fā)現(xiàn)的幾千種抗生素中，70% 以上由放線菌產(chǎn)生〔17〕。而且越來(lái)越多的全基因組測(cè)序結(jié)果顯示，放線菌基因組內(nèi)包含極為豐富的天然產(chǎn)物生物合成基因簇資源，這預(yù)示放線菌仍然是人類抗生素研發(fā)的巨大寶庫(kù)〔18-20〕。本研究從實(shí)驗(yàn)室土壤微生物監(jiān)測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)了4 株對(duì)霉菌具有明顯抑菌能力的放線菌，故對(duì)其進(jìn)行了分離、鑒定，并開展了抑菌活性研究，以確定其作為抗生素開發(fā)資源菌株的可能性。

1 材料

1.1 菌株

1.1.1 受試菌株 從被污染的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)、自然狀態(tài)下對(duì)霉菌有較強(qiáng)抑制能力的灰黃鏈霉菌（Streptomyces flavogriseus），經(jīng)分離純化后共得到4株菌（DL002、DL003、DL004、DL005），現(xiàn)保存于大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫(kù)。

1.1.2 指示菌株 革蘭氏陰性菌：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，BNCC337005）、大腸埃希菌（Escherichia coli ，BNCC133264）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris，BNCC340151）、胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora，BNCC138474）；革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus，BNCC102589）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BNCC109047）；真菌：黑曲霉（Aspergillus niger，BNCC186380）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani，BNCC189975）、白色假絲酵母（Candia albicans，BNCC336485）、新型隱球酵母（Crypto-coccus neoformans，BNCC225501），以上菌株均購(gòu)自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；另有編號(hào)為MM-1 的枝孢屬（Cladosporium）霉菌1 株（為本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)現(xiàn)放線菌菌株DL002 的原始平板上分離純化，經(jīng)形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定為枝孢屬（Cladosporium）霉菌）。所有菌株均保存于大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 培養(yǎng)基改良高氏1 號(hào)培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、YM 培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、改良高氏1 號(hào)液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，均參照文獻(xiàn)〔21〕進(jìn)行配制。

2 方法

2.1 受試菌株的分離純化用接種環(huán)挑取菌體，以3 區(qū)劃線法接種于改良高氏1 號(hào)培養(yǎng)基中，26 ℃培養(yǎng)4~7 d，連續(xù)劃線純化3 次，鏡檢確認(rèn)獲得純培養(yǎng)物后甘油管藏法保種。

2.2 受試菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 將獲得的各菌株的純培養(yǎng)物接種于改良高氏1 號(hào)培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)特征，并對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)特征，參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》進(jìn)行形態(tài)鑒定。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 通過(guò)16S rRNA 序列同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法進(jìn)行分子鑒定。具體方法如下：

（1）基因組DNA 提?。河肊zup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒提取基因組DNA。

（2）目的序列的PCR 擴(kuò)增：以細(xì)菌16S rRNA基因通用引物27F/1492R 擴(kuò)增16S rRNA 序列；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（50 μL）：PCR Buffer（10×）5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，dNTP（10 mmol）1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.6 μL，上游引物（10 μmol/μL）1.5 μL，下游引物（10 μmol/μL）1.5 μL，DNA 模板2 μL，無(wú)菌超純水33 μL；PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，54 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2.5 min，共32 個(gè)循環(huán)，72 ℃補(bǔ)平延伸10 min。

（3）PCR 產(chǎn)物直接檢測(cè)及測(cè)序：采用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，操作參照文獻(xiàn)〔22〕進(jìn)行，PCR 產(chǎn)物委托生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

（4）DNA 序列同源性比對(duì)：將所測(cè)得的DNA 序列導(dǎo)入NCBI 網(wǎng)站中用Blast 工具進(jìn)行同源性比對(duì)，下載親緣關(guān)系較近物種（同源性高于97%）的16S rRNA 序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析以確定所屬物種。

（5）系統(tǒng)發(fā)育分析：選擇親緣關(guān)系較近的鏈霉菌屬物種（29 株）用于系統(tǒng)發(fā)育分析，部分16S rRNA 數(shù)據(jù)集包括1 377 個(gè)堿基，其中保守位點(diǎn)1 017 個(gè)，變化位點(diǎn)217 個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)87 個(gè)。將下載好的待分析序列文件導(dǎo)入Mafft version 7 軟件中生成16S rRNA 多序列比對(duì)矩陣，用Bioedit v7.2.3 工具分別對(duì)多序列比對(duì)矩陣進(jìn)行手動(dòng)調(diào)整以提高其準(zhǔn)確度，用Jmodeltest v2.1.10 軟件對(duì)序列矩陣的最佳核酸替代模型進(jìn)行選擇；在IQ-Tree v1.6.5軟件中用最大似然法（maximum likelihood method，ML）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行構(gòu)建；最后用FigTree v1.3.1、Word 和Photoshop 軟件對(duì)上一步生成的系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行后期加工和美化。

2.3 受試菌株抑菌活性測(cè)定

2.3.1 絲狀真菌指示菌株的抑菌活性測(cè)定 在綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中同時(shí)接入受試菌株和立枯絲核菌（R.solani），接種位點(diǎn)相距2.5 cm；在馬丁培養(yǎng)基中同時(shí)接入受試菌株和黑曲霉（A.niger），接種位點(diǎn)相距2.5 cm，26 ℃培養(yǎng)，每天觀察菌株生長(zhǎng)情況2 次，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3 次重復(fù)的平均值表示。

2.3.2 單細(xì)胞真菌指示菌株的抑菌活性測(cè)定 受試菌株種子液制備：勾取受試菌株菌體，接入改良高氏1 號(hào)液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)4 d，備用。

白色假絲酵母（C.albicans）種子液制備：勾取菌體接入改良馬丁液體培養(yǎng)基中，35 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h 后，用無(wú)菌改良馬丁液體培養(yǎng)基稀釋至1.5 麥?zhǔn)媳葷岫?，備用?/p>

新型隱球酵母（C.neoformans）種子液制備：使用YM 液體培養(yǎng)基，制備方法與白色假絲酵母種子液相同。

抑菌活性測(cè)定：將無(wú)菌濾紙片（φ=8 mm）浸泡至受試菌株種子液中培養(yǎng)24 h 后備用；吸取受試菌株稀釋液200 μL 至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，涂布，再將浸有受試菌株種子液的濾紙片貼至其上，每個(gè)平板貼3 片，相距2.5 cm。28 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔8 h 觀察抑菌圈并測(cè)定其大小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以3 次重復(fù)的平均值表示。

2.3.3 細(xì)菌指示菌株的抑菌活性測(cè)定 受試菌株種子液制備：按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備。

細(xì)菌指示菌株種子液制備：使用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，制備方法與“2.3.2”項(xiàng)下白色假絲酵母種子液相同。

抑菌活性測(cè)定：按“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定。

3 結(jié)果

3.1 受試菌株鑒定結(jié)果形態(tài)鑒定結(jié)果：測(cè)試的4株放線菌菌株（DL002、DL003、DL004、DL005）均為革蘭氏陽(yáng)性菌；在改良高氏1 號(hào)培養(yǎng)基中形成的菌落形態(tài)均不規(guī)則，表面干燥粗糙；生長(zhǎng)12 周后逐漸變?yōu)榛疑?/p>

分子生物學(xué)鑒定結(jié)果：成功獲得4 株待測(cè)菌株16S rRNA 部分序列，上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（序列號(hào) 分 別 為 DL002：MZ216706；DL003：MZ216707；DL004：MZ216708；DL005：MZ216709），4 株待測(cè)菌與黃灰鏈霉菌相似度都達(dá)到99%，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示這4 株菌與灰黃鏈霉菌聚為1 支（自舉檢測(cè)支持度為88%），確定其為該種屬菌株。見圖1。

圖1 鏈霉菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3.2 受試菌株抑菌活性篩查結(jié)果

3.2.1 對(duì)真菌的抑菌活性 受試菌株DL002 對(duì)新型隱球酵母有抑菌活性，對(duì)白色假絲酵母無(wú)抑菌活性，而受試菌株DL003、DL004、DL005 對(duì)新型隱球酵母和白色假絲酵母均無(wú)抑菌活性。見表1。

表1 受試菌株對(duì)單細(xì)胞真菌的抑菌效果（抑菌圈直徑/菌落直徑）

4 株受試菌株對(duì)黑曲霉、立枯絲核菌及枝孢屬霉菌MM-1 均有明顯的抑制作用，且都能抑制黑曲霉產(chǎn)孢。見表2、圖2。

圖2 菌株對(duì)黑曲霉產(chǎn)孢的抑制效果（A）和立枯絲核菌的抑菌效果（B）圖

表2 受試菌株對(duì)絲狀真菌的抑菌效果

測(cè)試的4 株菌株與枝孢屬霉菌MM-1 在玉米培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 后均開始出現(xiàn)抑制MM-1 生長(zhǎng)的現(xiàn)象，培養(yǎng)至14 d，DL002 對(duì)MM-1 的抑制現(xiàn)象最為明顯。見圖3。

圖3 DL002 對(duì)枝孢屬霉菌MM-1 的抑菌效果圖

3.2.2 對(duì)細(xì)菌的抑菌活性 4 株受試菌株對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌以及銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)均有抑制作用；菌株DL002 對(duì)普通變形桿菌及枯草芽孢桿菌抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)35 mm。4 株菌株對(duì)金黃色葡萄球菌均無(wú)抑制效果。見表3、圖4。

表3 受試菌株對(duì)細(xì)菌的抑菌效果（抑菌圈直徑/菌落直徑）

圖4 菌株對(duì)部分細(xì)菌的抑制效果圖

4 討論

本研究分離得到的4 株放線菌菌株DL002、DL003、DL004、DL005 均為黃灰鏈霉菌。經(jīng)抑菌活性檢測(cè)確認(rèn)，4 株菌對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌及真菌均具有廣泛的抗菌活性，對(duì)黑曲霉的產(chǎn)孢均有抑制作用。其中，菌株DL002 對(duì)黑曲霉的產(chǎn)孢抑制作用最強(qiáng)。部分黑曲霉會(huì)侵染農(nóng)作物及水果〔23-25〕，病害嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物顯著減產(chǎn)，甚至絕收〔26〕。同時(shí)，菌株DL002 對(duì)普通變形桿菌的抑制作用非常顯著，普通變形桿菌在夏秋季節(jié)引起食物中毒的能力僅次于沙門氏菌（salmonella）〔27〕，因此，DL002 號(hào)菌株可以作為開發(fā)新型抑菌藥物的優(yōu)選菌株。

鏈霉菌是目前放線菌中產(chǎn)生抗生素等活性物質(zhì)種類最多的菌種，至今各國(guó)研究者仍在不斷地從鏈霉菌屬中篩選新的天然生物活性物質(zhì)〔28〕。研究表明，大多數(shù)的鏈霉菌都具有酶活性、抗菌活性及廣譜抗菌性〔29〕，對(duì)細(xì)菌性病原菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉均能表現(xiàn)出明顯的抑制效果〔30-31〕。但本實(shí)驗(yàn)中分離得到的4 株黃灰鏈霉菌均對(duì)金黃色葡萄球菌無(wú)抑制活性，且4 株菌株對(duì)同一種病原菌的抑制活性存在較大差異，說(shuō)明同種不同株的黃灰鏈霉菌菌株之間抗菌性能差異較大。這可能是菌株生境不同導(dǎo)致，也可能是在相同環(huán)境中不同菌株間生理性狀不同而產(chǎn)生的基因或代謝水平上的表達(dá)差異所致〔32-33〕?；诖?，對(duì)于黃灰鏈霉菌的研究一方面需加大對(duì)不同生境來(lái)源菌株的抑菌活性物質(zhì)篩選，另一方面也可借助全基因組測(cè)序研究，全面分析黃灰鏈霉菌潛在的抗生素相關(guān)基因，以充分挖掘黃灰鏈霉菌的抗生素開發(fā)潛能。

致謝：感謝大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院楊旭教授、肖文研究員在本研究過(guò)程中提供的指導(dǎo)和幫助。感謝大理大學(xué)三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、中國(guó)三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心、大理大學(xué)云嶺滇金絲猴野外科學(xué)觀測(cè)研究站對(duì)本研究的支持。