魏 磊， 景炳年， 王品勝， 高正龍， 謝曉陽， 陳譚星， 孟慶法， 王 偉

（1.河南省植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450002；2.河南省高新技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司，河南鄭州 450002；3.河南省科學(xué)院地理研究所，河南鄭州 450052）

禽大腸桿菌病、 沙門菌病和葡萄球菌病是嚴(yán)重?fù)p害家禽生長(zhǎng)的細(xì)菌性傳染病， 具有常見性和高發(fā)性，主要包括氣囊炎、腦膜炎、臍炎、敗血癥、傷寒、腸炎、白痢、化膿性關(guān)節(jié)炎、各臟器嚴(yán)重感染等癥狀 （吳陳俊，2021； 商春穎，2020； 何松芳，2017），是由禽致病性細(xì)菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌等引起，給家禽產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也嚴(yán)重威脅著禽產(chǎn)品消費(fèi)者的健康安全。 使用抗生素可有效改善這些癥狀， 但會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)及其制品中殘留從而直接威脅人類健康， 尤其長(zhǎng)期低劑量地在飼料中進(jìn)行添加更易產(chǎn)生耐藥性的超級(jí)細(xì)菌（王云鵬等，2008）。因此在飼料及飼料添加劑行業(yè)尋找安全、高效、穩(wěn)定、易得的抗生素替代品迫在眉睫。天然植物及其提取物以其資源豐富、來源廣泛、毒副作用低、殘留少和不易產(chǎn)生耐藥性等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)作為飼料或飼料添加成分備受青睞（劉華等，2020；Mulat 等，2019）。

研究表明， 沙棘黃酮可提高飼料中蛋白質(zhì)和鈣的利用率，提高肉雞胴體品質(zhì)（李垚等，2008）。艾葉黃酮可提高肉雞小腸抗氧化能力， 抑制腸道內(nèi)產(chǎn)酸克雷伯菌生長(zhǎng)（Wan 等，2016）。 青蒿黃酮可提高肉雞血清中抗氧化酶活性， 降低丙二醛的含量（Zhao 等，2016）。 槲皮素可促進(jìn)IgY 抗體分泌， 提高肉雞免疫性能 （Hager-Theodorides 等，2014）。黃芩黃酮對(duì)雞大腸桿菌和雞白痢具有明顯的體內(nèi)抑菌作用, 并對(duì)人工誘發(fā)的雞大腸桿菌病和雞白痢有明顯的防治效果（梁英等，2007）。 總之， 植物黃酮作為飼料添加成分進(jìn)行研發(fā)應(yīng)用的前景廣闊。

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera），為?？茦?gòu)樹屬多年生落葉喬木或灌木。 構(gòu)葉以其蛋白質(zhì)含量豐富，適口性好，成為豬、牛、羊、雞等畜禽養(yǎng)殖的新型飼料（邳植等，2018），含有的天然活性成分主要為黃酮和多糖等物質(zhì)。 雜交構(gòu)樹是中國科學(xué)院通過野生構(gòu)樹雜交和太空搭載等技術(shù)手段培育出的構(gòu)樹新品種。相較普通構(gòu)樹，雜交構(gòu)樹蛋白質(zhì)含量更高、纖維素含量更低、生長(zhǎng)快耐刈割（黃炎坤等，2020）。 2015 年雜交構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)被評(píng)為國家十大精準(zhǔn)扶貧項(xiàng)目之一。 目前僅有雜交構(gòu)樹樹皮黃酮對(duì)真菌抑制作用研究（開偉華等，2015）及普通構(gòu)樹葉黃酮和根黃酮對(duì)大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌和弧菌的抑制作用研究（徐夢(mèng)宇等，2011； 李萬倉，2008），針對(duì)雜交構(gòu)樹葉片黃酮的響應(yīng)面結(jié)合超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其對(duì)禽主要致病菌的抑制作用鮮見報(bào)道。

因此， 本文結(jié)合響應(yīng)面法和超聲波法優(yōu)化雜交構(gòu)葉黃酮的乙醇提取工藝， 并檢測(cè)雜交構(gòu)葉黃酮對(duì)5 種禽致病菌即雞源大腸桿菌、 鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、雞源金黃色葡萄球菌的抑制作用， 旨在為雜交構(gòu)葉黃酮開發(fā)為天然植物飼料添加成分及加速雜交構(gòu)葉資源的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 構(gòu)葉為中國科學(xué)院植物研究所培育的兩年生雜交構(gòu)樹“科構(gòu)101”葉片，采自河南省開封市蘭考中科華構(gòu)生物科技有限公司生產(chǎn)基地，陰干后粉碎備用；禽致病菌包括：雞源金黃色葡萄球菌CVCC 548、 雞源大腸桿菌CVCC 1555、雞白痢沙門菌CVCC 1887、鼠傷寒沙門菌CVCC 3384、雞傷寒沙門菌QAU 0320，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；蘆丁，購自中國藥品生物制品檢定所；牛肉浸膏，購自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；胰蛋白胨，購自上海保錄生物科技有限公司；96 孔板，購自美國Corning 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雜交構(gòu)葉黃酮提取 稱定1.00 g 雜交構(gòu)葉粉，倒入100 mL 三角瓶中，加入一定料液比、一定濃度乙醇溶液，在一定溫度下超聲一定時(shí)間，重復(fù)提取3 次，濾液合并后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，定容至25 mL， 取20 μL 進(jìn)行黃酮濃度和含量的測(cè)定。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及黃酮含量測(cè)定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法測(cè)定黃酮含量。縱坐標(biāo)為吸光度（A），橫坐標(biāo)為蘆丁質(zhì)量濃度（C），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液黃酮含量。 黃酮提取得率計(jì)算公式為：

提取得率/%=黃酮質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)×100/雜交構(gòu)葉質(zhì)量。

1.2.3 雜交構(gòu)葉提取黃酮單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì) 單因素試驗(yàn)包括乙醇濃度（A） 、料液比（B） 、超聲溫度（C）和超聲時(shí)間（D）四個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)，再根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，按照Design-Expert 8 軟件安排29 組試驗(yàn)并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到雜交構(gòu)葉黃酮提取優(yōu)化方案。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平和29 組試驗(yàn)結(jié)果分別見表1 和表2。

表1 因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果

1.2.4 雜交構(gòu)葉黃酮制備工藝 按照上述響應(yīng)面優(yōu)化后的提取工藝提取雜交構(gòu)葉黃酮， 抽濾濃縮至一定體積后加入該體積2 倍的無水乙醇， 低溫靜置24 h 去除多糖后真空冷凍干燥，即得雜交構(gòu)葉黃酮樣品。

1.2.5 雜交構(gòu)葉黃酮對(duì)禽致病菌抑制作用

1.2.5.1 菌懸液制備 5 種禽致病菌37 ℃搖床復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基上， 過夜培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落混懸于液體培養(yǎng)基中， 使用麥?zhǔn)媳葷醿x檢測(cè)菌液濃度， 將各菌株調(diào)制成106～108CFU/mL 的菌懸液。

1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 MIC 采用二倍稀釋法進(jìn)行測(cè)定。將1.2.4 項(xiàng)下雜交構(gòu)葉黃酮配制成400 mg/mL 母液后用0.22 μm 濾膜過濾，再依次倍比稀釋9 個(gè)濃度，依次為200、100、50、25、

12.5 、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL。 將10 個(gè)濃度梯度黃酮藥液各100 μL 分別加入96 孔板中， 再分別加入100 μL 1.2.5.1 項(xiàng)下制備好的各種菌懸液。 陽性對(duì)照加入100 μL 菌懸液和100 μL液體培養(yǎng)基，陰性對(duì)照加入200 μL 液體培養(yǎng)基。96 孔板加蓋密封后37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果，無菌生長(zhǎng)的最小濃度為MIC 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.2608C-0.0276，R2=0.9985，線性關(guān)系良好， 結(jié)果如圖1 所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度 當(dāng)料液比1：20 g/mL、 超聲溫度30 ℃、時(shí)間20 min 時(shí)，考察乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%） 對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率的影響，結(jié)果如圖2A。在乙醇濃度為60%時(shí)得率最大，根據(jù)相似相溶原理推測(cè)雜交構(gòu)葉黃酮極性與60%乙醇相似，故最佳乙醇濃度為60%。

2.2.2 料液比 當(dāng)乙醇濃度60%、超聲溫度30 ℃、時(shí)間20 min 時(shí)， 考察料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率的影響，結(jié)果如圖2B。 得率隨提取試劑體積增加而升高，在料液比為1:50 g/mL 時(shí)達(dá)到最大， 因此選擇最佳料液比為1:50 g/mL。

2.2.3 超聲溫度 當(dāng)乙醇濃度60%、料液比1:50 g/mL、 超聲時(shí)間20 min 時(shí)， 考察溫度（20、30、40、50、60 ℃） 對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率的影響，結(jié)果如圖2C。40 ℃時(shí)得率最高，50 ～60 ℃時(shí)得率下降， 推測(cè)溫度過高會(huì)影響黃酮分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性而發(fā)生轉(zhuǎn)化或降解，因此選擇40 ℃為最佳提取溫度。

2.2.4 超聲時(shí)間 當(dāng)乙醇濃度60%、料液比1:50 g/mL、超聲溫度40 ℃，考察提取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率的影響，結(jié)果如圖2D。 得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高，30 min 達(dá)到最大，此后略有下降。推測(cè)超聲時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)增加雜質(zhì)溶出，降低提取效果，故選擇30 min 為最佳超聲時(shí)間。

圖2 乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）、超聲時(shí)間（D）對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 采用Design-Expert 8 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析， 求得擬合回歸方程：Y=1.69118 +0.045317A -0.13675B +0.12140C -0.13302D-0.080900AB-0.031100AC+0.023600AD-0.072550BC-0.15110BD-0.13500CD-0.34897A2-0.24237B2-0.31140C2-0.12105D2。 對(duì)擬合模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 回歸模型系數(shù)檢驗(yàn)

由表3 可知，模型P＜0.0001，差異極顯著（P＜0.01）。 決定系數(shù)R2=0.9632，說明96.32%的雜交構(gòu)葉黃酮提取得率變化符合該模型， 模型擬合程度良好，表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ统闪ⅰ?信噪比Adeq Precision 為15.462，遠(yuǎn)大于4，說明方程的擬合度和可信度較高，試驗(yàn)誤差較小。 由各因素F 值可知四個(gè)因素對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率影響顯著性順序?yàn)榱弦罕龋˙）＞超聲時(shí)間（D）＞超聲溫度（C）＞乙醇濃度（A），B、C 和D 之間交互作用極顯著，A與B、C、D 之間交互作用不顯著，表明雜交構(gòu)葉多糖提取得率與各因素間不單單是線性關(guān)系。 失擬項(xiàng)P值0.1030 ＞0.05，不顯著，表明模型與具體試驗(yàn)結(jié)果吻合程度高。 因此該模型可對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

利用Design-Expert 8 軟件作出響應(yīng)面圖，如圖3 所示。 響應(yīng)面均開口向下，存在極高值。 響應(yīng)面坡度陡峭程度反映交互作用強(qiáng)弱，越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)因素改變?cè)矫舾校?反之影響越?。◤埶龋?015）。 圖3 直觀反映了各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，料液比和超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間交互作用曲面陡峭， 表明其對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率交互作用明顯。

圖3 兩因素交互作用對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮提取得率影響的響應(yīng)面圖

用響應(yīng)面軟件得出雜交構(gòu)葉黃酮最佳提取工藝為：乙醇濃度60.8%，料液比1：48.6 g/mL，超聲溫度33.5 ℃，超聲時(shí)間23.5 min，在此預(yù)測(cè)工藝條件下，黃酮提取得率為1.77%。為便利試驗(yàn)操作修正為：乙醇濃度60%，料液比1：49 g/mL，超聲溫度34 ℃，超聲時(shí)間24 min，在此條件下重復(fù)3 次試驗(yàn)，得到雜交構(gòu)葉黃酮平均提取得率為1.75%，達(dá)到預(yù)測(cè)值的98.87%，說明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化雜交構(gòu)葉黃酮的超聲輔助提取工藝模型有效， 參數(shù)可靠，具有一定參考價(jià)值，為雜交構(gòu)葉黃酮的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

2.4 抑菌試驗(yàn)結(jié)果 雜交構(gòu)葉黃酮對(duì)5 種禽致病菌抑制作用結(jié)果見表4。 對(duì)所選5 種禽致病菌的MIC 為6.25 ～50 mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為殺死99.9% （降低3 個(gè)數(shù)量級(jí)）的供試菌種所需的最低藥物濃度，其范圍為12.5 ～100 mg/mL，整體抑菌作用較強(qiáng)， 尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌抑制作用最強(qiáng)。

表4 雜交構(gòu)葉黃酮對(duì)5 種禽致病菌MIC和MBC 檢測(cè)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本研究通過響應(yīng)面法對(duì)雜交構(gòu)葉黃酮超聲輔助提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，對(duì)乙醇濃度，料液比，超聲溫度，超聲時(shí)間進(jìn)行了單因素試驗(yàn)，得出雜交構(gòu)葉黃酮提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度60%，料液比1：49 g/mL，超聲溫度34 ℃，超聲時(shí)間24 min，在此條件下，雜交構(gòu)葉黃酮提取得率為1.75%，試驗(yàn)誤差小，說明所得優(yōu)化提取工藝參數(shù)可靠性高。朱開梅等（2011）采用微波輔助提取結(jié)合正交法優(yōu)化提取構(gòu)葉黃酮， 其最佳工藝為提取溫度45 ℃，時(shí)間15 min， 料液比1：10 g/mL， 微波功率350 W，此條件下，黃酮提取量為1.39 mg/g（相當(dāng)于提取得率0.139%），該工藝的提取效率低于本試驗(yàn)。而楚芳冰等（2015）采用超聲輔助提取結(jié)合正交法優(yōu)化提取構(gòu)葉黃酮，確定的最佳工藝為料液比1：30 g/mL，超聲時(shí)間40 min，乙醇濃度50%，溫度50 ℃，此條件下黃酮提取得率可達(dá)4.01%，高于本試驗(yàn)。 由此可見，不同方法、構(gòu)樹品種、產(chǎn)地、樹齡及采摘季節(jié)都會(huì)影響黃酮類物質(zhì)在體內(nèi)的生成和積累， 應(yīng)深入研究變化規(guī)律才能在最佳時(shí)節(jié)采收。

目前， 在雛雞和青年雞階段多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)使用大量抗生素，控制傳染性細(xì)菌病的發(fā)生，但忽視對(duì)傳染源和傳播途徑的綜合防控， 最終導(dǎo)致致病菌對(duì)常規(guī)抗生素的敏感性降低，耐藥性加大，藥物治療效果變差，養(yǎng)殖成本增加。本研究中雜交構(gòu)葉黃酮對(duì)5 種重要致病菌的抑制作用由強(qiáng)到弱分別為：金黃色葡萄球菌MIC=6.25 mg/mL、鼠傷寒沙門菌MIC=12.5 mg/mL、大腸埃希菌MIC=25 mg/mL、雞白痢沙門菌MIC=25 mg/mL、 雞傷寒沙門菌MIC=50 mg/mL，整體抑菌效果顯著，作為雞飼料添加成分防治傳染性細(xì)菌病前景廣闊。 本研究為雜交構(gòu)葉黃酮類物質(zhì)開發(fā)為飼料添加成分的進(jìn)一步研究與應(yīng)用提供理論參考。