張 倩，崔 燕，余四九，何俊峰，潘陽陽，王 萌

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

附睪是促進精子發(fā)育、成熟以及貯藏精子的器官，包含附睪頭、附睪體和附睪尾，輸精管是運輸精子的管道。附睪管和輸精管均由假復(fù)層上皮構(gòu)成，管道之間是間質(zhì)，富含免疫細胞、血管和淋巴管等。哺乳動物附睪易受細菌、病毒和真菌等病原體感染，如附睪受大腸桿菌和衣原體感染后，引起附睪炎和輸精管阻塞，局部免疫穩(wěn)態(tài)被打破，可能會影響精子成熟和運動，導(dǎo)致生殖障礙，降低雄性生育力。牦牛()是青藏高原典型的土著動物之一，也是當(dāng)?shù)啬撩瘾@取奶、肉、皮等畜產(chǎn)品的重要來源。低氧和寒冷是高原地區(qū)最重要的脅迫因素，此外，牦牛的繁殖性能較低，為2年1胎或3年2胎。因此，了解健康雄性牦牛生殖組織的局部免疫狀態(tài)， 對預(yù)防其感染和防治具有重要意義。

免疫細胞不僅能夠維持雄性生殖道精子耐受，而且能夠參與生殖系統(tǒng)抗感染免疫。T淋巴細胞是介導(dǎo)細胞免疫的主要效應(yīng)細胞，B淋巴細胞能夠分化為漿細胞，產(chǎn)生抗體并介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，同時，巨噬細胞可能在附睪和輸精管內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，并負責(zé)吞噬衰老和過量的精子。目前，免疫細胞在雄性生殖道的分布研究在牛、小鼠和人類均有報道，而有關(guān)免疫細胞在雄性牦牛生殖道的表達研究較少，本團隊前期對牦牛睪丸的免疫細胞分布特征進行了研究(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，在此基礎(chǔ)上，本研究運用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法，分析CD68巨噬細胞、CD3T淋巴細胞、CD79αB淋巴細胞、IgA和IgG漿細胞在牦牛附睪和輸精管的分布及其表面標(biāo)志分子的表達水平，以期了解它們在牦牛附睪和輸精管的表達情況，從而推測其相關(guān)局部免疫功能，為進一步研究牦牛附睪和輸精管局部病理及防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

試驗動物來自西寧屠宰場的健康幼齡(5～6月齡)和成年(3～4歲)雄牦牛，各5頭份，采集左側(cè)附睪(頭、體和尾)和輸精管，免疫組織樣品固定于 4%的中性多聚甲醛溶液，qRT-PCR樣品存放于液氮，之后轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱備用。

1.2 qRT-PCR

1.2.1 不同年齡牦牛附睪和輸精管總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 使用 TRIzol試劑(Invitrogen)從牦牛附睪和輸精管組織提取總RNA，使用分光光度計測定提取總RNA濃度和純度(OD/OD=1.8～2.0)。根據(jù)cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，使用特異性引物逆轉(zhuǎn)錄總RNA。

1.2.2 基因引物的合成 qRT-PCR 引物參考GenBank 中牦牛()3ε、79α、、、68和-基因序列設(shè)計的。采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計，并由 TaKaRa公司(大連)合成， qRT-PCR 引物序列和基因序列號如表1所示。

1.3 免疫組織化學(xué)

1.3.1 抗體 CD3單克隆抗體(rabbit anti-CD3，ab16669)、CD79α單克隆抗體(mouse anti CD79α，ab199001)、IgA多克隆抗體(rabbit anti- IgA，ab112630)和 IgG多克隆抗體(rabbit anti- IgG，ab6692)購自英國Abcam公司，CD68多克隆抗體(rabbit anti- CD68，252281)購自美國Abbiotec公司。以上抗體均已進行特異性驗證，適用于牦牛后續(xù)研究。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測 石蠟切片貼于免疫組化防脫切片上，60 ℃烘片3～5 h，切片脫蠟至水，蒸餾水浸泡5 min，PBS浸泡5 min。一抗(見“1.3.1”)均按1∶200稀釋，4 ℃冰箱孵育過夜，生物素化二抗室溫孵育10 min，SABC復(fù)合物室溫孵育10 min。以上各步驟之間均用0.01 mol·L PBS， pH 7.3洗3 min ×3 次。DAB顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染、分化和返藍，最后脫水、透明并用中性樹膠封片?？瞻讓φ沼?.01 mol·LPBS代替一抗，棕黃色為陽性表達。顯微鏡下觀察CD68巨噬細胞、CD3T淋巴細胞、CD79αB淋巴細胞、IgA和 IgG漿細胞的分布位置，并通過Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)觀察分析上述蛋白平均光密度值。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié) 果

2.1 牦牛附睪和輸精管內(nèi)CD68、CD3ε、CD79α、IgA和IgG mRNA水平

qRT-PCR結(jié)果顯示，各年齡組牦牛附睪和輸精管內(nèi)3ε和68 mRNA水平在附睪頭最高(<005)， 之后是附睪體，附睪尾和輸精管的轉(zhuǎn)錄水平較低(圖1A、B)；另外，79α、和mRNA水平在輸精管和附睪尾顯著高于附睪體(<0.05)， 附睪頭mRNA水平最低(<0.05)(圖1C～E)。 此外，在同一部位，3ε、79α、、和68 mRNA水平在成年牦牛顯著高于幼齡牦牛(<005)(圖1A～E)。

2.2 牦牛附睪和輸精管內(nèi)CD68+、CD3+、CD79α+、IgA+和 IgG+細胞分布

2.2.1 分布 CD68巨噬細胞(圖2)、CD3T淋巴細胞(圖3)、CD79αB淋巴細胞(圖4)、IgA(圖5)和 IgG(圖6)漿細胞均主要分布在幼齡和成年牦牛的附睪頭、體、尾部和輸精管的上皮和間質(zhì)，陽性產(chǎn)物主要定位在上述免疫細胞的胞質(zhì)。

2.2.2 光密度分析 光密度分析顯示，CD68和CD3蛋白水平在幼齡和成年牦牛的附睪頭最高(<0.05)， 隨后是附睪體，在附睪尾和輸精管較低。而CD79α、IgA和 IgG蛋白水平在幼齡和成年牦牛的輸精管和附睪尾顯著高于附睪頭和附睪體(<005)。此外，成年牦牛的附睪和輸精管內(nèi)的CD68、CD3、CD79α、IgA和 IgG蛋白水平均顯著高于幼齡牦牛(<005)(圖7)。

3 討 論

附睪和輸精管內(nèi)的免疫細胞在防御病原體和精子耐受方面發(fā)揮著重要作用。本研究關(guān)注了免疫細胞在幼齡和成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管的分布，并檢測了這些細胞表面標(biāo)記物表達量的變化。

CD68是巨噬細胞的表面標(biāo)記物，本研究發(fā)現(xiàn)同一年齡組牦牛附睪和輸精管中，CD68 mRNA和蛋白水平在附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管呈下調(diào)趨勢，這與前人的對牛和人類的研究結(jié)果一致，附睪頭中含有豐富的巨噬細胞。Wang等報道附睪巨噬細胞主要參與構(gòu)成血-附睪屏障，且一般情況下附睪頭的屏障作用強于附睪尾和輸精管。這提示牦牛附睪頭含量較高的巨噬細胞可能與構(gòu)成血-附睪屏障相關(guān)，為抵御外部病原及阻止精子抗原外逃提供了一定保障。另外，巨噬細胞可吞噬和消化精子降解產(chǎn)物，在局部通過釋放如IL-1等可溶性因子參與并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中復(fù)雜的細胞間相互作用，也可發(fā)揮抗原提呈功能。Grigoryeva等發(fā)現(xiàn)，小鼠附睪頭、附睪體及附睪尾黏膜上皮和間質(zhì)內(nèi)分布有巨噬細胞，這與本研究結(jié)果相似，幼齡和成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾及輸精管都可見CD68巨噬細胞，散布于上皮和間質(zhì)，提示附睪和輸精管上皮和間質(zhì)可能是巨噬細胞的主要靶點。

A.CD68； B. CD3ε; C. CD79α; D. IgA; E. IgG。不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)A.CD68; B. CD3ε; C. CD79α; D. IgA; E. IgG. Bars with different superscripts are significantly different (P<0.05), same letters mean no significant difference(P>0.05)圖1 幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫細胞表面標(biāo)志分子mRNA水平Fig.1 The mRNA level of CD68, CD3ε, CD79α, IgA and IgG in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

a～d．幼齡牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管； e～h. 成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管；箭頭所示陽性細胞(棕色)。I.間質(zhì)組織； Ep.上皮; M.肌層a-d. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of juvenile yaks. e-h. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of adult yaks. Arrowheads indicate examples of positive cells (brown). I. Interstitial tissue; EP. Epithelium; M. Muscularis圖2 CD68+ 巨噬細胞在幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫組化定位Fig.2 Immunohistochemical localization of CD68 positive macrophages in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

a～d．幼齡牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管； e～h. 成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管；箭頭所示陽性細胞(棕色)。I.間質(zhì)組織； Ep.上皮; M.肌層a-d. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of juvenile yaks. e-h. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of adult yaks. Arrowheads indicate examples of positive cells (brown). I. Interstitial tissue; Ep. Epithelium; M. Muscularis圖3 CD3+ T淋巴細胞在幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫組化定位Fig.3 Immunohistochemical localization of CD3 positive T lymphocytes in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

a～d．幼齡牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管； e～h. 成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管；箭頭所示陽性細胞(棕色)。I.間質(zhì)組織； Ep.上皮；M.肌層a-d. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of juvenile yaks. e-h. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of adult yaks. Arrowheads indicate examples of positive cells (brown). I. Interstitial tissue； Ep. Epithelium; M. Muscularis圖4 CD79α+ B淋巴細胞在幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫組化定位Fig.4 Immunohistochemical localization of CD79α positive B lymphocytes in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

a～d．幼齡牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管； e～h. 成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管；箭頭所示陽性細胞(棕色)。I.間質(zhì)組織； Ep.上皮; M.肌層a-d. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of juvenile yaks. e-h. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of adult yaks. Arrowheads indicate examples of positive cells (brown). I. Interstitial tissue; Ep. Epithelium; M. Muscularis圖5 IgA+ 漿細胞在幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫組化定位Fig.5 Immunohistochemical localization of IgA positive plasmocytes in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

a～d．幼齡牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管； e～h. 成年牦牛附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管；箭頭所示陽性細胞(棕色)。I.間質(zhì)組織； Ep.上皮；M.肌層a-d. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of juvenile yaks. e-h. The caput, corpus, cauda epididymis and vas deferens of adult yaks. Arrowheads indicate examples of positive cells (brown). I. Interstitial tissue； Ep. Epithelium; M. Muscularis圖6 IgG+ 漿細胞在幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫組化定位Fig.6 Immunohistochemical localization of IgG positive plasmocytes in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

A.CD68； B. CD3ε; C. CD79α; D. IgA; E. IgG。不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)A.CD68； B. CD3ε; C. CD79α; D. IgA; E. IgG. Bars with different superscripts are significantly different (P< 0.05), same letters mean no significant difference(P>0.05)圖7 幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的免疫細胞表面標(biāo)志分子蛋白表達水平Fig.7 The expression level of CD68, CD3ε, CD79α, IgA and IgG protein in the epididymis and vas deferens of juvenile and adult yaks

CD3能夠與T淋巴細胞受體(TCR)結(jié)合，在T細胞膜上形成一個CD3-TCR復(fù)合物，參與抗原識別和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并參與哺乳動物T細胞的成熟和激活，本研究選用CD3標(biāo)記T淋巴細胞，結(jié)果顯示同一年齡組牦牛附睪和輸精管中，CD3 mRNA和蛋白水平在附睪頭、附睪體、附睪尾和輸精管依次下降，這與前人的研究結(jié)果一致，即附睪頭T淋巴細胞比輸精管豐富。Ritchie等報道上皮內(nèi)T淋巴細胞具有細胞免疫和耐受功能，提示牦牛附睪頭可能是T細胞發(fā)揮效應(yīng)的主要位置。另外，本研究還顯示CD3T淋巴細胞出現(xiàn)在幼齡和成年牦牛附睪及輸精管上皮和間質(zhì)區(qū)，這與CD68巨噬細胞的分布位置一樣，Voisin等報道巨噬細胞和淋巴細胞之間的相互作用對抗原的攝取和免疫功能的發(fā)揮非常重要，推測附睪和輸精管上皮和間質(zhì)區(qū)巨噬細胞和T淋巴細胞可能存在活躍的相互作用。另外，本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)牦牛睪丸生精小管上皮無免疫細胞浸潤，而在附睪上皮內(nèi)經(jīng)常觀察到免疫細胞，可能由于血-附睪屏障相對血-睪屏障來說功能較弱。

CD79α在B淋巴細胞抗原受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育、穩(wěn)定和功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究選用CD79α標(biāo)記牦牛附睪和輸精管的B淋巴細胞，結(jié)果顯示，不同于CD68和CD3ε，CD79α在附睪尾和輸精管的表達量顯著高于附睪頭和體。Stern等報道病原體一般通過附睪尾進入并感染組織，推測牦牛附睪尾和輸精管數(shù)量豐富的B淋巴細胞可能通過介導(dǎo)體液免疫，防止上行病原體感染附睪和睪丸。此外，本研究還在幼齡和成年牦牛附睪和輸精管的上皮和間質(zhì)檢測到CD79αB淋巴細胞，這與T淋巴細胞和巨噬細胞相似。Tanaka等報道B細胞可以調(diào)節(jié)T淋巴細胞的分化和生存、募集，以及產(chǎn)生調(diào)節(jié)性和促炎細胞因子，提示牦牛附睪和輸精管中的B淋巴細胞可能與其他免疫細胞互作，發(fā)揮調(diào)節(jié)局部免疫的功能。

IgG和IgA的表達水平與抗體分泌水平直接相關(guān)，它們能夠干擾微生物表面與宿主表面受體互補的黏附素間的特定相互作用，是抵御雄性生殖道感染的第一道重要防線。本研究觀察到幼齡和成年牦牛附睪頭、體、尾及輸精管的間質(zhì)和上皮均出現(xiàn)少量IgA和IgG漿細胞。JIRI報道正常射精過程約60%～70%精子通過輸精管射出，剩余精子降解被吸收，而附睪和輸精管中降解的精子抗原產(chǎn)物具有免疫原性，能夠啟動免疫反應(yīng)，隨后發(fā)生對這些抗原的免疫耐受。另外，Sirigu等報道正常情況下精漿中可檢測到IgG和IgA。Moldoveanu等報道附睪和輸精管的上皮細胞可以表達主要的組織相容性復(fù)合體II類和pIgR，這是一種負責(zé)運輸IgA和IgG穿過黏膜表面的分子。以上提示牦牛附睪和輸精管局部少量漿細胞可能是B淋巴細胞受正常精原抗體刺激產(chǎn)生的，也可能是運輸免疫球蛋白的上皮細胞。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)IgA和IgG mRNA和蛋白水平在從附睪頭到輸精管呈上調(diào)趨勢，即附睪尾和輸精管的表達量較高。GUDISA報道前列腺分泌物中可檢測到大量的IgA 和IgG，而輸精管處不僅有大量前列腺分泌物回流至此，還殘留有未射出的降解的精子抗原，提示牦牛輸精管局部略高的IgA和IgG水平可能與此相關(guān)，具體機制仍需進一步研究。

此外，本研究結(jié)果顯示，成年牦牛附睪和輸精管內(nèi)免疫細胞表面標(biāo)記物CD68、CD3、CD79α、IgA和 IgG mRNA和蛋白水平高于幼齡牦牛，與前人對小鼠的研究結(jié)果一致，小鼠附睪的巨噬細胞數(shù)量會隨著增齡而上升。作者推測，成年牦牛免疫系統(tǒng)發(fā)育較幼齡完善，更豐富的免疫細胞在附睪和輸精管維持免疫穩(wěn)態(tài)和形成免疫屏障以保護精子。

4 結(jié) 論

各年齡組牦牛附睪和輸精管內(nèi)，CD68和CD3 mRNA和蛋白水平從附睪頭到輸精管依次下降；相反，CD79α、IgA和IgG表達水平逐漸上升；此外，幼齡牦牛附睪和輸精管內(nèi)上述免疫細胞表達均顯著高于成年牦牛。上述結(jié)果提示，牦牛附睪頭細胞免疫效應(yīng)可能強于附睪尾和輸精管，而附睪尾和輸精管的體液免疫功能可能更占優(yōu)勢，另外，成年牦牛局部免疫可能發(fā)育更完善，以上數(shù)據(jù)可為進一步探究牦牛局部生殖免疫機制和病理研究提供形態(tài)學(xué)資料。