楊巧玲，陳 沁，鈕 冰，鄧曉軍，馬金鴿，古淑青，于永愛, 郭德華，張 峰

1. 上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海 200444 2. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444 3. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135 4. 上海如海光電科技有限公司，上海 201201 5. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176

引 言

近十年來，“三聚氰胺毒奶粉”事件使乳制品的質(zhì)量安全成為消費(fèi)者和科學(xué)研究關(guān)注的焦點(diǎn)，并促使相關(guān)部門建立對乳制品質(zhì)量進(jìn)行更加嚴(yán)格的監(jiān)管措施[1]。 乳制品的進(jìn)口量呈現(xiàn)出快速增長的趨勢。 2010年—2019年間，乳制品年均復(fù)合增長率達(dá)16.5%，其中2020年散裝奶粉進(jìn)口量達(dá)131.0萬t，同比增長10.2%[2]。 而進(jìn)口奶粉中的蛋白摻假事件近期也屢有發(fā)生，如2013年新西蘭進(jìn)口奶粉中檢出雙氰胺污染[1]。 面對乳制品質(zhì)量安全的嚴(yán)格管控以及大批次散裝奶粉的進(jìn)口通關(guān)，口岸現(xiàn)場監(jiān)管只能采用隨機(jī)抽樣后送實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的方式，監(jiān)管流程長效率低，缺乏現(xiàn)場快速實(shí)時(shí)評價(jià)的技術(shù)手段。

硫脲是一種含氮量高的重要化工原料，常用于制造樹脂、 染料、 壓塑粉、 橡膠的硫化促進(jìn)劑等。 而在食品領(lǐng)域，非法商家使用硫脲增加奶粉的表觀蛋白質(zhì)含量。 研究表明，長期接觸或食用硫脲會導(dǎo)致白細(xì)胞減少、 甲狀腺功能減退以及其他甲狀腺類疾病[3]，美國環(huán)境保護(hù)署[4]和國際癌癥研究機(jī)構(gòu)[5]將硫脲及其衍生物分類為對人類有毒和致癌的物質(zhì)。 目前食品、 污水、 空氣、 土壤中硫脲的檢測主要有高效液相色親法[6]、 比色法[7]、 傅里葉變換紅外光譜法[8]等。 舒友琴等[6]用高效液相色譜法成功對面粉中的硫脲進(jìn)行定量分析，樣品的檢出限和定量限分別為1.2和4.0 mg·kg-1。 現(xiàn)有的檢測方法普遍存在前處理復(fù)雜、 檢測成本高、 周期長、 效率較低等問題，不適用于口岸現(xiàn)場大批次樣品中硫脲的快速篩查。

近年來，基于光譜成像的可視化無損快檢方法發(fā)展迅速，如近紅外光譜成像技術(shù)、 拉曼光譜成像技術(shù)、 傅里葉變換紅外光譜成像技術(shù)等。 這些技術(shù)能同時(shí)獲得樣品的光譜特征和圖像信息，具有無損、 快速、 可視化等優(yōu)點(diǎn)[9]，廣泛應(yīng)用于食品質(zhì)量安全領(lǐng)域如非法添加物的檢測[10]、 營養(yǎng)成分的鑒定[11]、 摻偽物質(zhì)的篩查[12]等。 其中點(diǎn)掃描拉曼光譜成像是拉曼光譜技術(shù)和點(diǎn)掃描成像技術(shù)的結(jié)合，通過采集空間中每個(gè)像素點(diǎn)的拉曼光譜信息，將分子信息在空間上展現(xiàn)，并定性、 定量、 定位地分析物質(zhì)分子。

本工作采用自主搭建的便攜式點(diǎn)掃描二維拉曼高光譜成像儀器對不同濃度梯度(0.005%～2.000%)的硫脲奶粉混合物進(jìn)行檢測，結(jié)合自主研發(fā)的軟件系統(tǒng)，對硫脲進(jìn)行在線實(shí)時(shí)的定性、 定量和污染物分布分析，并進(jìn)一步預(yù)測奶粉中硫脲的濃度。 本研究為開發(fā)快速、 無損、 可視化檢測奶粉中非法添加物提供技術(shù)支持，可應(yīng)用于口岸現(xiàn)場散裝奶粉的通關(guān)檢測，確保進(jìn)出口奶粉質(zhì)量品質(zhì)檢測的科學(xué)性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品與試劑

檢測所用樣品為奶粉(市售奶粉)，試劑為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%； 購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

1.2 便攜式點(diǎn)掃描拉曼高光譜顯微系統(tǒng)

硬件裝置主要由高精度定位掃描裝置、 光學(xué)顯微鏡平臺、 拉曼光譜儀模塊三部分組成，如圖1所示。 高精度定位掃描裝置由一個(gè)定位精度優(yōu)于5 μm的二維微區(qū)定位電動平臺和一個(gè)最小步長為0.1 μm的電動對焦平臺組成。 光學(xué)顯微鏡使用無限遠(yuǎn)校正物鏡，方便在顯微鏡光路中插入拉曼光譜儀模塊。 拉曼光譜儀模塊通過一個(gè)分束器與顯微鏡光路結(jié)合，拉曼探頭發(fā)射的平行光束通過分束器反射后經(jīng)顯微物鏡聚焦于樣品，用CMOS相機(jī)可以觀察到激光光斑和樣品的成像。 點(diǎn)掃描激光器的激發(fā)光波長為785 nm，最大輸出功率為600 mW，譜寬0.076 nm，對應(yīng)的拉曼成像光譜儀采集范圍為200～3 200 cm-1，光譜分辨率為0.7 nm； 電動載物平臺的最大速度為20 mm·s-1，定位精度≤±5 μm，最小步長為0.1 μm； CMOS相機(jī)的分辨率為2 048×1 536，采集的像素點(diǎn)尺寸為3.2×3.2。 采集高光譜圖像時(shí)，點(diǎn)激光經(jīng)二向色鏡反射到樣本表面，CMOS相機(jī)和光譜儀采集對應(yīng)點(diǎn)的樣本數(shù)據(jù)，隨著電動載物臺沿X和Y軸移動最終完成整個(gè)樣本的掃描。

軟件系統(tǒng)為自主研發(fā)的拉曼高光譜信息采集軟件，可以控制電動載物臺的平移、 調(diào)整拉曼高光譜采集參數(shù)、 切換拉曼光譜預(yù)處理方式等，同時(shí)還具有數(shù)據(jù)庫相似度匹配功能，對盲樣物質(zhì)進(jìn)行初步的定性判別。 本實(shí)驗(yàn)中的采集參數(shù)為激光功率300 mW，積分時(shí)間1 000 ms，此時(shí)完成一種質(zhì)量分?jǐn)?shù)樣本的數(shù)據(jù)采集需要約6 min。

圖1 點(diǎn)掃描二維拉曼光譜成像系統(tǒng)原理圖Fig.1 Schematic diagram of point scanning two-dimensional Raman spectroscopy imaging system

1.3 方法

1.3.1 樣本制備

樣本分為拉曼信號穿透厚度檢測的雙層樣本和硫脲含量測定的奶粉混合樣本，樣本制備過程如圖2所示。 圖2(a)為穿透深度檢測中樣本制備模具，體積75 mm×25 mm×8 mm，中央的樣本盛放池尺寸24 mm×24 mm×7 mm，中間鏤空的圓洞直徑14 mm，金屬墊片體積為24 mm×24 mm×1 mm。 通過增減金屬墊片的數(shù)目可以調(diào)整樣本盛放池的深度，鏤空的圓洞方便金屬墊片的拿取。 圖2(b1)為雙層樣本，上層為奶粉，下層為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品，制備過程中在樣本盛放池底部放一個(gè)金屬墊片，加入1 mm厚度的硫脲標(biāo)準(zhǔn)品粉末，鋪上奶粉層進(jìn)行高光譜采集，保持硫脲標(biāo)準(zhǔn)品厚度不變，依次增加金屬墊片的數(shù)目，控制奶粉層的厚度，直至奶粉層與樣本盛放池頂部平齊，完成拉曼信號在奶粉層的穿透厚度檢測。

圖2 樣本制備示意圖(a)： 雙層樣本所需模具圖；(b1)： 雙層樣本圖； (b2)： 混合樣本圖Fig.2 Schematic diagram of sample preparation(a): Mold drawing required for double-layer sample;(b1): Double-layer sample drawing; (b2): Mixed sample drawing

根據(jù)硫脲標(biāo)準(zhǔn)品拉曼信號在奶粉層中穿透厚度的檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室定制了一種鋁合金材質(zhì)的樣本檢測模具用于制備硫脲奶粉混合樣本。 樣本檢測模具體積為24 mm×24 mm×2 mm，樣本盛放池尺寸為24 mm×24 mm×1 mm，硫脲奶粉混合樣本制備如圖2(b2)所示。 實(shí)驗(yàn)制備硫脲奶粉混合樣本共11份，濃度(W/W)范圍為0.005%～2.000%，每份樣本質(zhì)量為1 g。 制備樣本前，用研缽將奶粉和硫脲標(biāo)準(zhǔn)品顆粒分別研磨2 min，稱量取樣，倒入5 mL離心管中，渦旋5 min得到硫脲奶粉混合樣本。 高光譜采集時(shí)，一份相同添加濃度的奶粉混合樣本分三次放入樣本盛放池中，用載玻片刮平表面，樣本放在電動平移臺上重復(fù)采集三次，光譜數(shù)據(jù)平均求和得到感興趣區(qū)域內(nèi)樣本的拉曼高光譜信息。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理與分析

點(diǎn)掃描拉曼高光譜顯微成像系統(tǒng)采集的信息是含有2 048個(gè)波段的三維數(shù)據(jù)，為了減小高光譜數(shù)據(jù)處理的運(yùn)算量，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理后再進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)處理流程如下：

(1)單光譜有效數(shù)據(jù)截取。 從2 048個(gè)波段中提取921個(gè)有效波段(330～2 199 cm-1)進(jìn)行處理，波段選取在軟件UspectralPlus5.1.0(上海如海光電科技有限公司研發(fā))中完成。

(2)光譜平滑和熒光背景去除。 利用軟件系統(tǒng)中的Whittaker平滑方法[13-14]和自適應(yīng)迭代重加權(quán)懲罰最小二乘算法[15](adaptive iteratively reweighted penalized least squares，airPLS)消除背景隨機(jī)噪音信號和熒光背景干擾。

(3)峰值識別。 提取硫脲特征峰[(732±5) cm-1]處的全部拉曼光譜數(shù)據(jù)，按照感興趣區(qū)域內(nèi)樣本的采集方向，對數(shù)據(jù)進(jìn)行10×10矩陣的重新排列。

(4)空間多維光譜組裝和可視化。 將奶粉在732 cm-1(±5 cm-1)波數(shù)處的最大拉曼強(qiáng)度值設(shè)為閾值。 當(dāng)像素點(diǎn)在732 cm-1波數(shù)處的拉曼強(qiáng)度高于閾值判定為硫脲顆粒并在二值圖像上用黑紅色顯示，低于閾值判定為奶粉背景用白色顯示，得到感興趣區(qū)域內(nèi)樣本的二值圖像，通過二值圖像可以清晰地展示出硫脲顆粒的檢出情況和空間分布。 單波段圖像二值化處理過程在軟件Prism8.0(GraphPad Software .USA)中進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 點(diǎn)掃描拉曼高光譜成像儀器的采集參數(shù)確定

分別以固態(tài)標(biāo)準(zhǔn)品硫脲和奶粉為樣品，在不同的激光功率和積分時(shí)間下，采集拉曼光譜，結(jié)果圖3所示。 不同激光功率、 積分時(shí)間下硫脲的拉曼原始光譜圖如圖3(a)所示。 由圖可知，隨著激光功率和積分時(shí)間的增加，硫脲標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼特征峰不斷增強(qiáng)，當(dāng)積分時(shí)間為1 000 ms，積分功率分別為400和500 mW時(shí)，475 cm-1處的峰強(qiáng)度值達(dá)到最大值[圖3(a2)]，由于信息溢出會影響拉曼特征峰強(qiáng)度的準(zhǔn)確判斷，故選擇硫脲標(biāo)準(zhǔn)品的最佳采集參數(shù)為激光功率300 mW、 積分時(shí)間1 000 ms。

圖3 不同積分時(shí)間、 激光功率下硫脲和奶粉的拉曼光譜圖Fig.3 Raman spectra of thiourea and milk powder under different integration time and laser power

不同激光功率、 積分時(shí)間下奶粉的拉曼原始光譜圖如圖3(b)所示。 由圖可知，奶粉的拉曼特征峰強(qiáng)度隨著激光功率和積分時(shí)間的增加而增強(qiáng)，且未出現(xiàn)信號值飽和現(xiàn)象，由于拉曼特征峰強(qiáng)度越高越有利于特征峰辨別和數(shù)據(jù)處理，對比圖3(b1)和(b2)可知，采集奶粉的最佳儀器參數(shù)是激光功率500 mW、 積分時(shí)間1 000 ms。 綜合考慮，點(diǎn)掃描二維拉曼光譜儀器采集硫脲奶粉混合樣本的最佳參數(shù)為激光功率300 mW、 積分時(shí)間1 000 ms。

2.2 硫脲拉曼信號在奶粉層的穿透厚度分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置雙層樣本，上層為奶粉，下層為硫脲標(biāo)準(zhǔn)品，奶粉厚度分別為0，1，2，3，4和5 mm。 利用點(diǎn)掃描拉曼光譜成像儀器分別采集雙層樣本表面拉曼光譜信息以及24 mm×24 mm區(qū)域內(nèi)10×10個(gè)像素點(diǎn)的高光譜信息，結(jié)果如圖4和圖5所示。 雙層樣本表面的拉曼光譜信息如圖4所示，由圖可知，隨著奶粉厚度的增加，732 cm-1的強(qiáng)度值越來越低，說明激光的能量在穿透奶粉的過程中不斷被削弱，當(dāng)奶粉厚度為2 mm時(shí)，特征峰732 cm-1基本消失，此時(shí)無法檢測到下層硫脲的拉曼信息。

圖4 不同奶粉厚度下雙層樣本表面拉曼光譜圖(n=3)Fig.4 Raman spectra of double-layer samples with different milk powder thickness (n=3)

雙層樣本的拉曼高光譜數(shù)據(jù)經(jīng)過二值化處理后得到二值熱圖，結(jié)果如圖5所示。 由圖可知，隨著奶粉厚度的增加，感興趣區(qū)域內(nèi)含硫脲的像素點(diǎn)數(shù)目即硫脲檢測點(diǎn)越來越少，當(dāng)奶粉厚度為1 mm時(shí)，硫脲檢測點(diǎn)數(shù)目為100，當(dāng)奶粉厚度大于2 mm時(shí)，硫脲的檢出概率低于100并不斷降低，說明在本實(shí)驗(yàn)參數(shù)下，硫脲標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的拉曼信號能夠穿透2 mm厚的奶粉層。 為了確保最底部硫脲顆粒產(chǎn)生的拉曼信號能被系統(tǒng)完全采集到，避免樣本信息的丟失，研究定制樣本模具使檢測樣本的厚度維持在1 mm左右。

圖5 不同奶粉厚度下雙層樣本的二值圖像(n=3)Fig.5 Binary images of double-layer samples withdifferent milk powder thickness (n=3)

2.3 散裝奶粉中硫脲的可視化快速檢測

2.3.1 奶粉中硫脲的定性分析

以硫脲標(biāo)準(zhǔn)品為添加劑，分別制備添加濃度(W/W)為0.005%，0.010%，0.050%，0.250%，0.500%，0.750%，1.000%，1.250 0%，1.500%，1.750%和2.000%的硫脲奶粉混合樣本，采集混合樣本24 mm×24 mm區(qū)域內(nèi)100個(gè)像素點(diǎn)的拉曼高光譜信息，經(jīng)過閾值處理后的二值熱圖如圖6所示。 由圖可知，在感興趣區(qū)域內(nèi)，隨著添加物濃度的增加，硫脲檢測點(diǎn)數(shù)目增多。 當(dāng)添加濃度為0.050%時(shí)，感興趣區(qū)域內(nèi)可檢測到1個(gè)硫脲檢測點(diǎn)，說明基于該實(shí)驗(yàn)參數(shù)，硫脲在奶粉中的最低檢出濃度為0.050%，比已有研究中的檢出限(0.1%)更低[16]，采集時(shí)間(20 min)更短[17]。

圖6 硫脲奶粉混合樣本的二值熱圖(n=6)Fig.6 Binary heat map of mixed sample ofthiourea milk powder (n=6)

2.3.2 奶粉中硫脲的定量分析

研究將感興趣區(qū)域內(nèi)硫脲像素點(diǎn)數(shù)目與添加濃度進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如圖7所示。 由圖可知，線性擬合的決定系數(shù)(R2)為0.991 3，具有很好的線性關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)中的樣本厚度為1 mm，比文獻(xiàn)中樣本厚度小[17]，系統(tǒng)能完全采集到底部樣本信息(圖5)，不存在樣本信息遺漏，且平行多次混合后采樣能讓表層和亞表層樣本信息全部采集到，減少樣本信息覆蓋的誤差，因此隨著添加濃度的增加，樣本中硫脲檢測點(diǎn)

圖7 硫脲濃度與像素點(diǎn)數(shù)目的線性擬合圖Fig.7 Linear fitting graph of thiourea concentration and the number of pixels

的數(shù)目呈線性增長[18]，可以根據(jù)感興趣區(qū)域內(nèi)硫脲檢測點(diǎn)數(shù)目預(yù)測奶粉中硫脲的添加濃度。

2.3.3 方法的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，以三種不同品牌奶粉為基質(zhì)，制備4個(gè)不同濃度的硫脲奶粉混合樣本，分別為0.25%，0.60%，1.20%和1.50%，重復(fù)制樣6次，采集拉曼高光譜信息并進(jìn)行二值化處理，記錄硫脲檢測點(diǎn)的數(shù)目并利用圖7的線性關(guān)系預(yù)測硫脲的濃度，結(jié)果如表1所示。 由表1可知，在0.25%，0.60%，1.20%和1.50%的添加水平下，預(yù)測濃度的相對誤差范圍為-9.41%～4.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于7%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可以用于檢測奶粉中添加物的濃度。

表1 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證表Table 1 Methodaccuracy verification form

3 結(jié) 論

搭建了一套便攜式點(diǎn)掃描拉曼高光譜成像檢測系統(tǒng)，針對奶粉中的硫脲進(jìn)行快速無損檢測研究，結(jié)果顯示該檢測方法的檢出限為0.05%，硫脲像素點(diǎn)數(shù)目與添加濃度呈線性增長趨勢，線性決定系數(shù)為0.991 3，預(yù)測濃度的相對誤差范圍為-9.41%～4.01%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7%，能準(zhǔn)確預(yù)測硫脲在奶粉中的濃度。 相比傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，本研究開發(fā)的硫脲快檢方法具有以下優(yōu)勢： (1)儀器便攜，綠色環(huán)保，可在口岸現(xiàn)場操作。 避免采用常規(guī)色譜、 光譜方法所需的前處理過程，測定過程基本無有機(jī)試劑等有害化合物的使用； (2)方法檢測時(shí)間短，效率高。 整個(gè)檢測過程包括前處理能在10 min內(nèi)完成，而且結(jié)果直觀可視。 高效液相色譜法包括前處理過程至少需要50 min[6]，劉宸等[17]利用線掃描拉曼高光譜成像檢測奶粉中的硫氰酸鈉需要20 min。 同時(shí)利用二值熱圖法可以清晰地展示添加物質(zhì)的空間分布； (3)準(zhǔn)確性好，穩(wěn)定性高，成功預(yù)測添加水平下硫脲濃度，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%； (4)方法檢出限(0.05%)低于現(xiàn)有高光譜方法，靈敏度高。 陳秀明[16]等利用近紅外光譜成像技術(shù)結(jié)合Adulterant Screen 算法對嬰幼兒奶粉中的硫脲進(jìn)行檢測，檢出限為0.1%。 本研究搭建的便攜式點(diǎn)掃描拉曼光譜成像系統(tǒng)不僅適用口岸現(xiàn)場奶粉中非法添加物的快速篩查，在其他固體顆粒摻假中也具有較好應(yīng)用前景。