陳靖奕，朱 南，昝佳男，肖子康，鄭 晶，劉 暢，沈 睿，王 芳, *，劉云飛，蔣 玲

1. 南京曉莊學(xué)院電子工程學(xué)院，江蘇 南京 211171 2. 南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 210019 3. 南京林業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210037

引 言

磷酸氯喹(chloroquine phosphate)，利巴韋林(ribavirin)和鹽酸阿比多爾(arbidol hydrochloride)為經(jīng)過臨床試驗(yàn)被認(rèn)為治療新冠肺炎有效的臨床藥物[1-2]，均被列入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中。 自新冠肺炎(COVID-19)疫情發(fā)生以來(lái)，國(guó)內(nèi)外多家研究機(jī)構(gòu)和企業(yè)正在加快推進(jìn)新冠病毒(SARS-CoV-2)抗體藥物的研發(fā)。 藥物多晶型與藥物的熔點(diǎn)、 穩(wěn)定性、 溶解性、 密度等物理化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)，從而影響藥效及藥物間的相互作用[3]。 在制藥工藝中，將這些性質(zhì)與加工特性、 儲(chǔ)存特性結(jié)合在一起考慮是非常必要的。 研究發(fā)現(xiàn)，利巴韋林作為臨床一線抗病毒治療藥物，用于病毒引起的肺炎、 支氣管炎、 皮膚皰疹等疾病的治療。 其存在晶A、 晶B、 晶C、 和晶D四種晶型[4]。 藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，只有晶A型在臨床治療中有顯著優(yōu)勢(shì)。 遠(yuǎn)紅外光譜技術(shù)(以下稱之為： 太赫茲光譜技術(shù))作為一種快速檢測(cè)手段，可表征分子間的弱相互作用，如氫鍵、 范德華力、 晶格間的堆積力等。 多項(xiàng)研究表明[5]，利用太赫茲光譜技術(shù)可以快速篩選出優(yōu)勢(shì)晶型藥物，大大地縮短了研發(fā)時(shí)間，降低了研發(fā)成本。

高溫、 高濕以及暴露時(shí)間均是影響藥物穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，輕則影響治療效果，重則關(guān)乎生命安全。 傳統(tǒng)的藥物穩(wěn)定性檢測(cè)手段包括質(zhì)譜分析法、 拉曼光譜分析法、 紅外光譜分析法(特指中紅外)、 熱重分析法、 X射線粉末衍射分析法以及掃描電子顯微分析法等在判別藥物結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性時(shí)均存在一定的弊端，不能同時(shí)將結(jié)構(gòu)、 晶型、 甚至生產(chǎn)工藝給藥效帶來(lái)的影響反映到圖譜的變化上。

通過測(cè)試和分析三種臨床試驗(yàn)認(rèn)為治療新冠肺炎有效藥物： 磷酸氯喹，利巴韋林和鹽酸阿比多爾的遠(yuǎn)紅外(以下稱之為太赫茲)和中紅外(以下稱之為紅外)光譜，獲取每種藥物光譜中所有特征峰位置，并通過理論分析得到其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式。 不僅可以有效地檢測(cè)藥物結(jié)構(gòu)是否發(fā)生改變，發(fā)生了什么改變，還可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)藥物晶型是否在向其他晶型轉(zhuǎn)變。 該研究對(duì)深入理解磷酸氯喹，利巴韋林和鹽酸阿比多爾等抗病毒藥物的藥學(xué)特性，藥物間相互作用，控制藥物生產(chǎn)過程，指導(dǎo)藥物存儲(chǔ)和使用有重大意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

采用德國(guó)布魯克公司的VERTEX 80V型傅里葉紅外光譜儀，頻譜范圍為： 10～15 500 cm-1，通過不同的光學(xué)選件，來(lái)覆蓋遠(yuǎn)紅外、 中紅外和近紅外光譜區(qū)域。 中紅外波段有效頻率范圍為： 400～4 000 cm-1； 遠(yuǎn)紅外波段配置4個(gè)分束器： 6，25，50和125 μm，本工作選擇的是6 μm分束器，有效頻率范圍為： 30～680 cm-1(0.9～20.4 THz)； 真空環(huán)境下的分辨率可達(dá)2 cm-1； 信噪比優(yōu)于50 000∶1(峰-峰值)。 中紅外光譜測(cè)試時(shí)，光學(xué)腔始終保持在真空環(huán)境，樣品腔處在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下； 遠(yuǎn)紅外光譜測(cè)試時(shí)，通過給樣品腔和光學(xué)腔抽真空的方式減少環(huán)境中水汽對(duì)光譜的影響。 所有測(cè)試均在室溫下完成，測(cè)試原理和方法已經(jīng)在前期研究中詳細(xì)闡述，在這里不再贅述[6]。

1.2 樣品制備

三種抗病毒藥物磷酸氯喹(C18H26ClN3·2H3PO4)，利巴韋林(C8H12N4O5)和鹽酸阿比多爾(C22H25BrN2O3S·HCl)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，純度99%以上，樣品測(cè)試前均未經(jīng)進(jìn)一步純化。 由于樣品在遠(yuǎn)紅外波段的吸收很強(qiáng)，光譜測(cè)試前，將純樣與聚乙烯粉末以1∶10的質(zhì)量比混合，研磨均勻后壓成0.5～1 mm厚，直徑為13 mm的薄片。 同時(shí)制備純聚乙烯樣品薄片作為測(cè)試背景，純聚乙烯樣品的質(zhì)量需與測(cè)試樣品中聚乙烯含量(質(zhì)量)相同，這樣可以排除聚乙烯吸收的影響。 中紅外光譜測(cè)試前樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單，只需將一定質(zhì)量的樣品跟溴化鉀混合，充分研磨后壓成直徑為13 mm的透明薄片即可。

1.3 方法

以利巴韋林為例，計(jì)算了其基于晶體結(jié)構(gòu)的振動(dòng)光譜； 初始晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自劍橋晶體庫(kù)，對(duì)應(yīng)的refcode為VIRAZL[7]，正交(斜方)晶型，晶格參數(shù)為：a=14.863，b=7.512，c=8.788，α=90.000，β=90.000，γ=90.000。 其單分子和單晶胞結(jié)構(gòu)如圖1所示，每個(gè)晶胞包含4個(gè)單分子。 利用Crystal14軟件計(jì)算得到優(yōu)化后結(jié)構(gòu)的振動(dòng)光譜，計(jì)算結(jié)果無(wú)虛頻，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，同時(shí)添加了GRIMME倫敦色散校正系數(shù)，TOLINTEG=(10 10 10 10 20)。

圖1 利巴韋林單分子(優(yōu)化后, a)和晶體(b)結(jié)構(gòu)Fig.1 The monomer (after optimization, a) andcrystal structure (b) of Ribavirin

因磷酸氯喹和鹽酸阿比多爾分子量較大，需要耗費(fèi)較多的計(jì)算資源，且劍橋晶體庫(kù)中沒有合適的晶體結(jié)構(gòu)，故只計(jì)算了其優(yōu)化后單分子結(jié)構(gòu)的振動(dòng)光譜。 優(yōu)化前和優(yōu)化后的磷酸氯喹和鹽酸阿比多爾單分子結(jié)構(gòu)見圖S1，磷酸氯喹經(jīng)優(yōu)化后磷酸分子中O—H鍵均被拉長(zhǎng)，其中O50—H53鍵拉長(zhǎng)后發(fā)生斷裂，使得N16—H53之間形成了氫鍵。 利用Guassian16軟件，結(jié)合密度泛函理論(density functional theory，DFT)，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組進(jìn)行理論振動(dòng)光譜分析，計(jì)算結(jié)果無(wú)虛頻，擬合半寬高均為4 cm-1。

圖S1 優(yōu)化前(a)和優(yōu)化后(b)的鹽酸阿比多爾和 磷酸氯喹單分子結(jié)構(gòu)Fig.S1 The structures of Arbidol hydrochloride and Chloroquine phosphate before (a) and after (b) optimization

2 結(jié)果與討論

2.1 太赫茲光譜表征研究

鹽酸阿比多爾、 利巴韋林和磷酸氯喹等三種抗病毒藥物的太赫茲理論(基于單分子結(jié)構(gòu))和實(shí)驗(yàn)光譜，如圖2所示。 因理論計(jì)算初始結(jié)構(gòu)基于單分子，只考慮了分子內(nèi)的相互作用力； 而實(shí)驗(yàn)光譜基于無(wú)定形固態(tài)晶體結(jié)構(gòu)，除了分子內(nèi)的相互作用力外，還存在分子間的相互作用力，理論研究表明這些分子間的弱相互作用力(如晶胞堆積力、 氫鍵和范德華力等)均落在太赫茲波段[8]，這就造成了理論和實(shí)驗(yàn)光譜之間存在一定的偏差。 從圖2(b)可以看出，鹽酸阿比多爾特征峰主要位于： 2.24，3.14，3.72，4.25和5.38 THz附近； 利巴韋林特征峰主要位于： 2.01，2.68，3.37，4.05，4.83，5.45，5.92，6.42和7.14 THz附近； 磷酸氯喹特征峰主要位于： 1.26，1.87，2.37，3.06，3.78，5.09和6.06 THz附近。 鹽酸阿比多爾主要振動(dòng)模式源于HCl和H2O分子的面外搖擺，除此之外還伴隨著苯硫甲基、 吲哚、 二甲氨甲基和羥基的振轉(zhuǎn)動(dòng)； 利巴韋林的主要振動(dòng)模式來(lái)自集體振動(dòng)以及呋喃核糖基和羧酰胺的面外搖擺； 磷酸氯喹的主要振動(dòng)模式源自磷酸分子和二乙基的振轉(zhuǎn)動(dòng)。

圖2 三種抗病毒藥物的理論(a, 基于單體)和 實(shí)驗(yàn)光譜(b)對(duì)比Fig.2 Comparison of theoretical (a, based on the monomer) and experimental (b) spectra of three antiviral drugs

前期，我們對(duì)構(gòu)成DNA/RNA的堿基、 堿基對(duì)、 特征片段的太赫茲光譜詳細(xì)研究[9-13]后發(fā)現(xiàn)，太赫茲光譜反映的是分子內(nèi)和分子間的一種集體振動(dòng)，無(wú)論是單體、 二聚體還是多聚體的理論光譜均不能很好的重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 只有將考慮了周期性邊界條件的晶體結(jié)構(gòu)作為理論計(jì)算的初始構(gòu)型，才能讓理論和實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致吻合。 圖3為利巴韋林理論(基于晶體)和實(shí)驗(yàn)光譜對(duì)比圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，除部分特征峰發(fā)生了簡(jiǎn)并外，理論與實(shí)驗(yàn)光譜較為吻合，說(shuō)明考慮了周期性邊界條件的密度泛函理論可以較好地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3 利巴韋林太赫茲實(shí)驗(yàn)和理論(基于晶體)光譜對(duì)比Fig.3 Comparison of experimental and calculation (based on the crystal) THz spectra of Ribavirin

表1給出了利巴韋林實(shí)驗(yàn)和理論(基于晶體)太赫茲光譜中所有特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式，從表中可以看出，10 THz以下的振動(dòng)模式均表現(xiàn)為晶胞中所有分子參與的集體振動(dòng)，以三氮唑的面外彎曲、 羧酰胺的面外擺動(dòng)和呋喃核糖基的弱面內(nèi)伸縮為主。

表1 利巴韋林實(shí)驗(yàn)和理論(基于晶體)太赫茲光譜特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式

2.2 中紅外光譜表征研究

太赫茲光譜主要源于分子的集體振動(dòng)，分子結(jié)構(gòu)和晶型的改變、 甚至生產(chǎn)工藝上的差異均能使其光譜發(fā)生變化，但也因其振動(dòng)模式過于復(fù)雜，難以精準(zhǔn)解析。 中紅外光譜主要源自部分基團(tuán)或者原子的振動(dòng)，雖只能將結(jié)構(gòu)的變化反映到光譜的變化上，但因其振動(dòng)模式簡(jiǎn)單，可對(duì)光譜精準(zhǔn)解析。 將太赫茲光譜和中紅外光譜相結(jié)合，既可以從結(jié)構(gòu)、 晶型、 生產(chǎn)工藝上發(fā)現(xiàn)分子間的差異，還可對(duì)光譜進(jìn)行比較深入的解析。

圖4為鹽酸阿比多爾實(shí)驗(yàn)和理論(基于單體)中紅外光譜圖，有效頻率范圍為400～4 000 cm-1，因1 800～2 800 cm-1范圍內(nèi)無(wú)特征，故略去。 從圖中可以看出，理論和實(shí)驗(yàn)光譜較為吻合。 因理論計(jì)算基于諧振子模型，而實(shí)驗(yàn)環(huán)境復(fù)雜，一般會(huì)通過給理論光譜乘上一個(gè)頻率校正因子，來(lái)消除理論偏差，校正因子的大小取決于選擇的理論計(jì)算方法和基組。 文中選擇基于密度泛函理論(DFT)的B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，故乘上了0.977的頻率校正因子[14]。

表2列出了鹽酸阿比多爾在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)中紅外光譜中所有特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的主要振動(dòng)模式。 從表中可以看出，鹽酸分子的振動(dòng)峰在483 cm-1附近； 苯硫甲基的振動(dòng)峰主要在687，741和3 117 cm-1附近； 吲哚、 二甲氨甲基、 羧酸乙酯和甲基的振動(dòng)貫穿整個(gè)中紅外波段。 2 800 cm-1以下，基團(tuán)的振動(dòng)以面內(nèi)外彎曲和搖擺為主； 2 800 cm-1以上，基團(tuán)的振動(dòng)過渡為面內(nèi)伸縮。

圖5為磷酸氯喹實(shí)驗(yàn)和理論(基于單體)中紅外光譜圖，有效頻率范圍為400～4 000 cm-1，因1 800～2 400 cm-1范圍內(nèi)無(wú)特征，故略去。 從圖中可以看出，理論和實(shí)驗(yàn)光譜較為吻合。 為了消除理論計(jì)算帶來(lái)的偏差，同樣乘上0.977的頻率校正因子[14]。

圖4 鹽酸阿比多爾實(shí)驗(yàn)(a)和理論(b, 基于單體)中紅外光譜對(duì)比圖，頻率范圍400～4 000 cm-1Fig.4 Comparison of the experimental (a) and calculated (b, based on the monomer) MIR spectraof Abidol hydrochloride ranging between 400 and 4 000 cm-1

表2 鹽酸阿比多爾實(shí)驗(yàn)和理論(基于單體)中紅外光譜特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式Table 2 Experimental and calculated (based on the monomer) MIR vibration frequenciesand corresponding vibrational modes for Abidol hydrochloride

續(xù)表2

圖5 磷酸氯喹實(shí)驗(yàn)(a)和理論(b, 基于單體)中紅外光譜對(duì)比圖，頻率范圍400～4 000 cm-1Fig.5 Comparison of the experimental (a) and calculated (b, based on the monomer) MIR spectraof Chloroquine phosphate ranging between 400 and 4 000 cm-1

表S1列出了磷酸氯喹在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)中紅外光譜中所有特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的主要振動(dòng)模式。 從表中可以看出，磷酸的振動(dòng)峰主要集中在500～1 400 cm-1范圍內(nèi)，呈現(xiàn)面內(nèi)外彎曲和搖擺； 1 400～1 600 cm-1范圍內(nèi)，以喹啉基、 二乙基和戊二胺的面內(nèi)搖擺和彎曲為主； 2 600 cm-1以上，基團(tuán)的振動(dòng)過渡為N—H，O—H和 C—H鍵面內(nèi)伸縮。

圖6為利巴韋林實(shí)驗(yàn)(與《藥品紅外光譜集第一卷》結(jié)果吻合，光譜號(hào)22)和理論(基于單體和晶體)中紅外光譜圖，有效頻率范圍為400～4 000 cm-1，因1 800～2 800 cm-1范圍內(nèi)無(wú)特征，故略去。 為了消除理論計(jì)算帶來(lái)的偏差，也乘上0.977的頻率校正因子[14]。 與前面不同的是，用于理論計(jì)算的初始結(jié)構(gòu)除了單體外，還對(duì)比了考慮周期性邊界條件的晶體。 我們發(fā)現(xiàn)，考慮了周期性邊界條件的晶體結(jié)構(gòu)的理論光譜與實(shí)驗(yàn)光譜吻合得更好，尤其是400～1 000 cm-1。 這說(shuō)明，即便中紅外光譜主要來(lái)自基團(tuán)的振動(dòng)，分子內(nèi)作用力起主導(dǎo)作用，也不可忽視分子間的作用力，尤其在1 000 cm-1以下的低頻段。 要精準(zhǔn)地描述中紅外光譜中特征峰的振動(dòng)模式，最好以晶體結(jié)構(gòu)作為理論計(jì)算的初始構(gòu)型。

表S1 磷酸氯喹實(shí)驗(yàn)和理論(基于單體)中紅外光譜特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式Table S1 Experimental and calculated (based on the monomer) MIR vibration frequenciesand corresponding vibrational modes for Chloroquine phosphate

圖6 利巴韋林實(shí)驗(yàn)(a)和理論(b, 基于單體; c, 基于晶體)中紅外光譜對(duì)比圖，頻率范圍400～4000 cm-1Fig.6 Comparison of the experimental (a) and calculated (b, based on the monomer and (c) based on the crystal)MIR spectra of Ribavirin ranging between 400 and 4 000 cm-1

表S2列出了利巴韋林在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)中紅外光譜中所有特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的主要振動(dòng)模式。 從表中可以看出，1 000 cm-1以內(nèi)既存在分子內(nèi)作用力，也存在一些分子間作用力，如： 432 cm-1對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式中，呋喃核糖上O—H鍵面內(nèi)搖擺屬于分子內(nèi)作用，羧酰胺上NH2鍵面外搖擺來(lái)自分子間作用。 1 000 cm-1以下的振動(dòng)模式主要源自呋喃核糖基、 三氮唑和羧酰胺的面內(nèi)外彎曲和搖擺，1 000 cm-1以上的振動(dòng)模式主要來(lái)自C—H，O—H，N—H和NH2鍵的面內(nèi)搖擺和伸縮。 同樣，2 800 cm-1以上，基團(tuán)的振動(dòng)過渡為面內(nèi)伸縮。

表S2 利巴韋林實(shí)驗(yàn)和理論(基于單體*和晶體#)中紅外光譜特征峰位置及其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式

續(xù)表S2

3 結(jié) 論

以磷酸氯喹，利巴韋林和鹽酸阿比多爾這三種廣譜抗病毒藥物為例，研究了它們的太赫茲和中紅外振動(dòng)光譜，獲得了光譜中所有特征峰信息。 既可以從結(jié)構(gòu)、 晶型、 生產(chǎn)工藝上發(fā)現(xiàn)分子間的差異，還可以對(duì)光譜進(jìn)行比較深入的解析。

藥物多晶是藥物研發(fā)的壁壘之一，生產(chǎn)、 存儲(chǔ)和使用環(huán)境也是影響藥物穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。 紅外光譜技術(shù)可同時(shí)將結(jié)構(gòu)和晶型的變化反映到紅外圖譜上。 我們前期研究一種治療高磷酸鹽血癥藥物，四水合碳酸鑭時(shí)還發(fā)現(xiàn)，三種不同工藝獲得的藥物，擁有同樣的PXRD圖譜，但藥效卻相差甚遠(yuǎn)，利用太赫茲光譜可快速作出鑒別(與南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司合作，已申請(qǐng)發(fā)明專利)，篩選出最優(yōu)藥物[15]。

以考慮了周期性邊界條件的利巴韋林晶體結(jié)構(gòu)為例，結(jié)合密度泛函理論和Crystal14軟件，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d, p)基組，考慮倫敦色散校正系數(shù)，對(duì)其太赫茲和中紅外光譜進(jìn)行了表征。 研究表明，理論和實(shí)驗(yàn)光譜一致吻合，太赫茲波段所有特征峰對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式均源自所有原子參與的集體振動(dòng)，主要表現(xiàn)為三氮唑的面外彎曲、 羧酰胺的面外搖擺和呋喃核糖基的弱面內(nèi)伸縮。 中紅外波段，以晶體結(jié)構(gòu)作為理論計(jì)算初始構(gòu)型的振動(dòng)光譜比單分子結(jié)構(gòu)計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)光譜更加吻合，尤其是400～1 000 cm-1的低頻波段，說(shuō)明雖然中紅外光譜主要來(lái)自分子內(nèi)基團(tuán)和部分原子的振動(dòng)，卻也有分子間的相互作用存在，要想精準(zhǔn)的表征特征峰的振動(dòng)模式，最好選擇晶體結(jié)構(gòu)作為初始計(jì)算構(gòu)型。

結(jié)合密度泛函理論和Gaussian16軟件，選擇B3LYP雜化泛函和6-311++G(d,p)基組，對(duì)三種抗病毒藥物的中紅外光譜進(jìn)行了詳細(xì)表征，得到了所有特征峰對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式。 發(fā)現(xiàn)，2 800 cm-1以下，振動(dòng)模式主要源自基團(tuán)的面內(nèi)外彎曲和搖擺； 2 800 cm-1以上，振動(dòng)模式過渡為C—H，O—H和N—H鍵的面內(nèi)伸縮。

我們期望，該項(xiàng)研究可以為藥物生產(chǎn)和存儲(chǔ)過程中控制生成目標(biāo)晶型藥物，抑制優(yōu)勢(shì)藥物晶型向其他晶型的轉(zhuǎn)化的快速檢測(cè)提供幫助； 為研究藥物的藥學(xué)特性、 藥物間相互作用，同時(shí)，為解決類似生產(chǎn)工藝等導(dǎo)致藥物藥效發(fā)揮等疑難雜癥問題提供借鑒。