何欣，張燕a，孟慧，魏建和，呂菲菲，劉培衛(wèi)，李浩凌，陳波，黃良明，楊云*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/瀕危藥材繁育國家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護(hù)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 ?？?570311

沉香屬（AquilariaLam.）植物是一類具有極高價(jià)值的非木材資源類樹種，主要以其受傷害后形成的樹脂而聞名，這種含有芳香樹脂的木材被稱為沉香[1-2]。沉香使用歷史悠久，不僅在中國作為傳統(tǒng)名貴藥材及工藝品使用，還常在中東及歐美地區(qū)被作為香料[3-5]。沉香的形成需要受到外界傷害，且需要長時(shí)間積累[6]。由于近年來國際市場對(duì)沉香的需求越來越大，濫砍、濫伐現(xiàn)象頻生，野生資源再生困難，使沉香自然種群瀕臨滅絕[7-8]。目前，所有的沉香屬及擬沉香屬（Gyrinopsspp.）物種均已被列為瀕危物種[9]。

隨著野生資源的瀕危，現(xiàn)有沉香資源已無法滿足人們的需求。為解決市場高品質(zhì)沉香短缺問題、更好地保護(hù)沉香瀕危野生物種，許多亞洲國家開始大面積種植沉香樹。此外，多種人工誘導(dǎo)技術(shù)被開發(fā)用于生產(chǎn)沉香。除傳統(tǒng)的砍傷[10]、鉆孔[11]、火烙[12]、打釘[13]等方法外，人工結(jié)菌法[14]、栽培沉香試劑盒（CA-kit）法[15]及輸液法通體結(jié)香技術(shù)（Agar-WIT）[16-17]等也被應(yīng)用于沉香生產(chǎn)。Agar-WIT 是目前中國及其他產(chǎn)沉香的國家應(yīng)用最廣泛的人工誘導(dǎo)技術(shù)，已應(yīng)用于中國及東南亞國家超過45 萬株沉香樹[18]。其具體方法為在距地面50 cm高的白木香樹樹干上鉆孔，孔深達(dá)木質(zhì)部，通過輸液裝置將結(jié)香液輸入到小孔中，借助樹體的蒸騰作用將安全高效的結(jié)香液輸送至植株的各個(gè)部位，經(jīng)6～12 個(gè)月處理后，即可在樹干中形成沉香，而后整樹伐倒收集沉香[19]。與自然結(jié)香和傳統(tǒng)的人工結(jié)香方式相比，該技術(shù)具有產(chǎn)量高、成本低、操作簡便的優(yōu)勢[20-21]。

近年來，Agar-WIT 被廣泛應(yīng)用于許多國家的沉香生產(chǎn)，本研究通過對(duì)Agar-WIT 處理30 d內(nèi)沉香形成過程進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，從性狀、顯微結(jié)構(gòu)、浸出物、特征圖譜及沉香四醇含量測定方面分析沉香形成規(guī)律，揭示Agar-WIT 運(yùn)用早期植物體內(nèi)發(fā)生的結(jié)構(gòu)、物質(zhì)變化規(guī)律，將有助于指導(dǎo)沉香的采收和高效生產(chǎn)，并為Agar-WIT 的推廣應(yīng)用和技術(shù)升級(jí)提供參考。

1 材料

1.1 樣品

選擇中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所興隆研發(fā)基地3 年生白木香，Agar-WIT 處理結(jié)香，結(jié)香處理第1天起從輸液孔上1 m處每天向下截取厚度為3 cm 的樹段，持續(xù)收集結(jié)香樣品30 d。每次3株平行取樣設(shè)為1 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，空白對(duì)照組為未經(jīng)任何處理的健康白木香樣品。憑證標(biāo)本保存于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標(biāo)本館。

1.2 儀器

ECLIPSE80i 型生物顯微鏡（日本尼康株式會(huì)社）；7890A-5975C 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）儀（美國Agilent 公司）；2695/2475 型高效液相色譜（HPLC）儀［沃特世科技（上海）有限公司］；HH-6 型電熱恒溫水浴鍋（江蘇科技儀器有限公司）；AL104-IC 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Mili-Q 型純水儀（美國Millipore公司）；CM1950 型冰凍切片機(jī)（德國Leica 公司）；SB25-12DTDN 型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 試藥

沉香四醇對(duì)照品（批號(hào)：111980-201904，純度：98.6%）、沉香對(duì)照藥材（批號(hào)：121222-201203）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為HPLC級(jí)；95%乙醇、無水乙醇、乙醚、水合氯醛等均為分析級(jí)；GF254薄層色譜板（批號(hào)：HX69349529，德國Merck公司）。

2 方法

2.1 樣品前處理

砍斷的沉香樹段去掉枝葉及外皮，干燥后剪成約0.5 cm 的方形小塊用于后續(xù)顯微觀察，另取沉香樹段按海南省地方標(biāo)準(zhǔn)《白木香通體結(jié)香樹木剖香技術(shù)規(guī)程》（DB45/T 257—2013）[22]要求，剖取沉香，剪成香片后打粉，分別過二號(hào)篩和三號(hào)篩，備用。

結(jié)香層認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)為宏觀上出現(xiàn)黃棕色環(huán)形沉香層；顯微觀察到木間韌皮部和射線細(xì)胞有黃棕色樹脂[23]；薄層色譜出現(xiàn)與對(duì)照藥材對(duì)應(yīng)的條帶。

2.2 沉香結(jié)香率計(jì)算

結(jié)香處理后的沉香樹段截為3 段，每段上切取厚度為1 cm 的莖段。正上方分別拍取3 個(gè)莖段下截面橫截面圖，利用Photoshop像素法算出每株樹的橫截面平均像素（NC）和結(jié)香區(qū)域平均像素（NA），結(jié)香層面積（SA）與橫截面面積（SC）之比等于結(jié)香區(qū)域與橫截面像素?cái)?shù)之比。每株樹的結(jié)香率按公式（1）計(jì)算。

本研究中結(jié)香材料皆為胸徑樹齡相似的筆直單桿白木香樹，假設(shè)每棵樹的樹干為上下均等的標(biāo)準(zhǔn)圓柱體，且每棵樹樹干的結(jié)香率整體保持一致。

2.3 顯微鑒別

將沉香樣品（包含白木層、沉香層和腐爛層）剪成方形小塊，置于包埋盒中，70 ℃熱水浴浸泡6 h 至沉香樣品塊完全軟化。冷凍切片機(jī)切取50 μm左右的薄片，放入水合氯醛透化劑中透化8 h，裝片，置于顯微鏡下觀察。

2.4 薄層鑒別

稱取沉香樣品粉末（過二號(hào)篩）0.5 g，乙醚30 mL 提取，超聲處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL 溶解，作為供試品溶液。另取沉香對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版薄層色譜法（通則0502）[24]，吸取上述2 種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）條件下展開，取出后晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.5 特征圖譜和沉香四醇含量測定

按照《中國藥典》2020 年版方法[24]測定特征圖譜和沉香四醇含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取沉香四醇對(duì)照品適量，精密稱定，加無水乙醇分別制成質(zhì)量濃度為0.2、0.4、1.0、2.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg·mL-1的溶液，再用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。以峰面積（Y）對(duì)沉香四醇質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 GC-MS檢測

樣品溶液制備：稱取沉香粉碎樣品和健康白木香粉碎樣品各0.5 g，置50 mL 錐形瓶中，加入乙醚8 mL 冰浴超聲處理3 次（功率250 W，頻率40 kHz），每次0.5 h，靜置5 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，合并3 次濾液，室溫下?lián)]干，乙醚2 mL 溶解，即得。

GC-MS 條件：色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Silox 毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始柱溫60 ℃，保持2 min；4 ℃·min-1升至250 ℃。進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣為氦氣；流速為1 mL·min-1；分流比為20∶1；溶劑延遲4 min；電子轟擊（EI）離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；接口溫度為260 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z40～300。

通過MSD 工作站，結(jié)合NIST11 標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)總離子流圖進(jìn)行分析和檢索，確定沉香提取物各組分成分。

3 結(jié)果

3.1 性狀

未經(jīng)傷害處理的白木香樹橫截面顏色為乳白色。經(jīng)Agar-WIT 處理30 d，白木香橫截面出現(xiàn)明顯顏色變化（圖1）。由外至內(nèi)可劃分為白木層、過渡層、沉香層和腐爛層。處理第4～5 天可觀察到1 圈淺棕色的沉香層，且顏色隨處理時(shí)間延長而逐漸加深，厚度也隨之增加，處理第9 天可在沉香層內(nèi)側(cè)觀察到腐爛層，且腐爛層在30 d 內(nèi)逐漸充滿沉香層內(nèi)部空間，說明Agar-WIT 處理30 d可形成明顯的沉香層結(jié)構(gòu)。

圖1 Agar-WIT處理30 d所產(chǎn)沉香性狀

3.2 結(jié)香率

Agar-WIT 處理30 d，沉香的平均結(jié)香率為8.04%，總體呈波動(dòng)上升趨勢。觀察發(fā)現(xiàn)處理第4～5 天和第28～30 天時(shí)結(jié)香率均呈現(xiàn)顯著上升趨勢。其中，第4～5 天的結(jié)香率由4.31%急劇上升至8.11%（圖2）。

圖2 Agar-WIT處理30 d所產(chǎn)沉香的結(jié)香率（n=3）

3.3 顯微特征

觀察Agar-WIT 處理1～30 d 沉香橫切面顯微特征發(fā)現(xiàn)，Agar-WIT 處理第4 天在木間韌皮部和射線細(xì)胞中均觀察到有黃棕色樹脂出現(xiàn)，且黃棕色樹脂隨處理時(shí)間延長逐漸充滿木間韌皮部，顏色也隨之加深，與性狀觀察結(jié)果相符。觀察發(fā)現(xiàn)，處理第4天開始產(chǎn)生沉香，處理30 d 可形成明顯的沉香層結(jié)構(gòu)（圖3）。

3.4 沉香的薄層色譜

如圖4 所示，Agar-WIT 處理第1～4 階段沉香樣品的熒光斑點(diǎn)數(shù)量隨處理時(shí)間延長而隨之增加，結(jié)香第3階段和第4階段樣品薄層色譜上的熒光斑點(diǎn)與沉香對(duì)照藥材（CK）一致。

3.5 沉香四醇含量測定

處理30 d 所產(chǎn)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化見圖5。處理30 d 內(nèi)沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.001%增長至0.034%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.017%，整體呈顯著上升趨勢。

圖5 Agar-WIT處理30 d所產(chǎn)沉香的沉香四醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）

3.6 特征圖譜

處理30 d 內(nèi)所產(chǎn)沉香的特征圖譜見圖6。其中，S1～S12 為處理第1～4 階段的沉香樣品。隨著處理時(shí)間的增加，沉香的6個(gè)特征峰逐漸出現(xiàn)，第3階段時(shí)所有特征峰均已顯現(xiàn)。Agar-WIT 處理30 d 所產(chǎn)沉香的特征圖譜與CK一致。

圖6 Agar-WIT結(jié)香30 d所產(chǎn)沉香的特征圖譜

3.7 氣相色譜主要成分檢識(shí)

健康白木香乙醚提取物中含有豐富的脂肪酸和烷烴（表1），而沉香揮發(fā)油中則富含倍半萜和芳香類成分[25]。Agar-WIT 處理1～30 d 所產(chǎn)沉香的部分化合物變化見圖7。其中，芳香類成分2,4-二叔丁基苯酚和芐基丙酮分別在處理第1 天和第9 天被檢測到，倍半萜類成分別香橙烯和香橙烯分別在處理第16 天和第20 天被檢測到，α-檀香醇和δ-蛇床烯分別在處理第16天和第26天被檢測到。

圖7 Agar-WIT處理30 d所產(chǎn)沉香部分化學(xué)成分變化情況

表1 健康白木香中的成分

4 結(jié)果與討論

沉香是植物抵御外界傷害的反應(yīng)產(chǎn)物，在形成過程中，會(huì)使木質(zhì)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)明顯的分層，由內(nèi)而外根據(jù)形態(tài)和色澤可分為腐爛層、沉香層、過渡層和白木層[26]。Agar-WIT 處理后第4 天形成環(huán)形的沉香層，腐爛層于第9 天顯現(xiàn)于沉香層內(nèi)側(cè)，處理30 d 即可形成明顯的沉香層結(jié)構(gòu)，這說明Agar-WIT 能快速誘導(dǎo)產(chǎn)生沉香類物質(zhì)。除此以外，沉香在形成過程中木間韌皮部還可生成1 圈屏障層，即在沉香層和過渡層之間存在阻隔層[27]。在本研究中，Agar-WIT 處理30 d 沉香樣品并未見阻隔層，推測可能為傷害時(shí)間過短，木間韌皮部的薄壁細(xì)胞還未分化形成阻隔層。

健康的白木香主要含有脂肪酸類化合物，不含色酮類、倍半萜類及芐基丙酮類化合物[28]。倍半萜和色酮是沉香類物質(zhì)的主要成分[29-30]，主要在木間韌皮部、導(dǎo)管和射線細(xì)胞中形成和積累[23]。其中，沉香的品質(zhì)與揮發(fā)油類和2-(2-苯乙基)色酮的含量有關(guān)，色酮類、倍半萜、芳香族化合物的芐基丙酮?jiǎng)t與沉香的形成機(jī)制存在一定的相關(guān)性[27-28]。Chen等[25]發(fā)現(xiàn)，化學(xué)法刺激所得沉香和野生沉香的揮發(fā)油成分相似，2 種沉香中均含有芐基丙酮、cubenol、愈創(chuàng)醇、eudesm-7(11)-en-4α-ol、α-copaen-11-ol、白木香醛，健康白木香揮發(fā)油則含有高達(dá)59.65%的棕櫚酸和油酸。本研究發(fā)現(xiàn)，健康白木香的乙醚提取物中以棕櫚酸和烷烴類成分為主，未見倍半萜和色酮類成分，這與Chen 等[25]的研究結(jié)果基本一致。本研究未從健康白木香中檢測到油酸，可能與提取方法和白木香的生長年限有關(guān)。倍半萜類化合物通過甲羥戊酸途徑（MVA）和脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（DXP）2 種生物途徑在植物體內(nèi)合成[31-33]。α-檀香醇等倍半萜在沉香結(jié)香30 d 即能被檢測到，推測別香橙烯、香橙烯等倍半萜和芐基丙酮是白木香樹受傷害后的初始合成產(chǎn)物。2,4-二叔丁基苯酚在健康白木香和傷害后的白木香中均可被檢測到，說明2,4-二叔丁基苯酚是健康白木和沉香共有的成分，然而其在傷害過程中的積累和變化還有待研究。本研究中檢測的α-檀香醇、芐基丙酮、δ-蛇床烯、2,4-二叔丁基苯酚等成分均為沉香揮發(fā)油的成分[25,34-38]，其中，α-檀香醇具有安定作用[39]，芐基丙酮具有鎮(zhèn)靜、止咳作用[40-41]，這些成分均可在Agar-WIT 處理30 d 的沉香中被檢測到。Agar-WIT 處理1 年的沉香具有鎮(zhèn)靜、安神、止咳方面的作用[42]，說明沉香形成早期的化合物演變具有延續(xù)性，但這些化合物在沉香形成階段的變化規(guī)律還需進(jìn)一步研究。

目前，全世界野生沉香資源緊缺，已處于瀕危狀態(tài)，而全球?qū)Ω咂焚|(zhì)沉香的需求日益增加。因此，高效、穩(wěn)定的結(jié)香技術(shù)對(duì)沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。本研究對(duì)Agar-WIT處理30 d內(nèi)沉香形成過程進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測，揭示了Agar-WIT 運(yùn)用早期植物體內(nèi)發(fā)生的結(jié)構(gòu)、物質(zhì)變化規(guī)律，表明Agar-WIT 處理30 d能夠促進(jìn)沉香的快速形成和穩(wěn)定積累。研究結(jié)果不僅為該技術(shù)的推廣應(yīng)用和技術(shù)升級(jí)提供了數(shù)據(jù)支撐，也為開發(fā)更高效的結(jié)香技術(shù)提供了參考。對(duì)于沉香結(jié)香過程中的化學(xué)成分變化和積累的規(guī)律及相互作用，還需要進(jìn)一步研究。