岳珠珠，姜明瑞，張婧秋，王志成，王慧楠，陳夢雨，魏曉彤，石雙慧，王夢琳，王英姿

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

甘草來源于植物烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根莖，是中醫(yī)臨床常用的大宗中藥品種，炙甘草是其常用炮制品，被收載于《中華人民共和國藥典》2020 年版，具有清熱解毒、補(bǔ)中益氣等功效[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為，甘草蜜炙后補(bǔ)益作用顯著增強(qiáng)?，F(xiàn)代研究表明，甘草蜜炙后甘草苷、甘草酸、異甘草素等成分含量發(fā)生變化，免疫活性高于生甘草[2-7]。

機(jī)體免疫系統(tǒng)由非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫三方面組成，能夠識別和清除入侵人體的抗原成分、體內(nèi)的衰老細(xì)胞、凋亡細(xì)胞及異常突變細(xì)胞等，從而保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定[8]。目前，蜜炙甘草增強(qiáng)免疫功能的機(jī)制尚未清晰，且研究多偏向其中一項(xiàng)，不夠全面。因此，為了更系統(tǒng)地研究蜜炙甘草的免疫功能調(diào)節(jié)作用，本研究基于課題組前期優(yōu)化的蜜炙甘草炮制工藝[9]，采用環(huán)磷酰胺制備小鼠免疫功能低下模型，檢測甘草蜜炙前后對其各類免疫功能相關(guān)指標(biāo)的影響，為其臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體（SPF）級BALB/c系小鼠240只，雌雄各半，3～4 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購于北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2019-0010]，本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審批（編號：BUCM-4-2021112301-4068）。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，自由飲水、攝食，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 試藥

生甘草飲片由北京華邈藥業(yè)有限公司提供（批號為XF1161），經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖制成的飲片。清炒甘草飲片（不加煉蜜）和蜜炙甘草飲片均按照本課題組前期優(yōu)化的炮制工藝進(jìn)行炮制。

環(huán)磷酰胺、鹽酸左旋咪唑、綿羊紅細(xì)胞（SRBC）、豚鼠血清、都氏試劑、印度墨水、水楊酸緩沖液（SA）、吉姆薩（Giemsa）染色液、乳酸脫氫酶（LDH）基質(zhì)液、1%雞紅細(xì)胞（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為X13J11Y115691、Y23M9C56327、H14N11Q131025、H02D11Q133035、H13N11B130941、L17S11G124902、L12N11G130949、R20651、23151、R21234）；LDH 細(xì)胞毒性檢測試劑盒、CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為121719200902、E1CK-000208）；Hank's液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20200921）；胎牛血清（杭州四季青公司，批號：110128611）；RPMI 1640 完全培養(yǎng)液、臺盼藍(lán)染色液（美國Gibco公司，批號分別為1786045、13704）；伴刀豆球蛋白A（Con A，美國Sigma公司，批號：C8110）；YAC-1細(xì)胞（南京科佰生物科技有限公司，批號：CBP60886）；1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40，上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號：LM-0304）；2,4-二硝基氟苯[DNFB，薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司，批號：RXR4 HKE8]。

1.3 儀器

5810R 型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；MULTISKAN MK3 型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀、3111 型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、ECO 型超凈工作臺均購于Thermo Fisher Scientific 公司；756PC 型紫外-可見分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；M330-HD228S 型光學(xué)顯微鏡（深圳市奧斯微光學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品的制備

取生甘草飲片、清炒甘草飲片及蜜炙甘草飲片[9]適量，分別加10 倍量的水回流提取3 次，每次1 h，濾過后合并提取液，濃縮至1 g·mL-1（以生藥量計(jì)），給藥前用蒸餾水稀釋至所需質(zhì)量濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動(dòng)物分組與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后按體質(zhì)量隨機(jī)分成4 個(gè)大組，分別為免疫一組[血清溶血素和抗體生成細(xì)胞、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）實(shí)驗(yàn)]、免疫二組[淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和自然殺傷（NK）細(xì)胞活性）]、免疫三組（腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞）和免疫四組（碳廓清實(shí)驗(yàn)、臟器/體質(zhì)量比值）[10]。每大組分為6 個(gè)小組，即對照組、模型組、陽性藥組和給藥組（生甘草組、清炒甘草組、蜜炙甘草組），每組隨機(jī)10 只小鼠。除對照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液外，其余各組連續(xù)5 d 腹腔注射環(huán)磷酰胺（80 mg·kg-1）構(gòu)建免疫低下模型；同時(shí)對照組、模型組灌胃0.9%氯化鈉溶液，陽性藥組灌胃鹽酸左旋咪唑（40 mg·kg-1），生、清炒、蜜炙甘草組各灌胃1.0 g·kg-1，連續(xù)給藥28 d；給藥體積為0.02 mL·g-1。

2.3 檢測指標(biāo)

根據(jù)免疫功能學(xué)評價(jià)檢驗(yàn)對小鼠免疫功能進(jìn)行測定[11]，包括淋巴器官/體質(zhì)量比值測定、血清溶血素測定及抗體生成細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)、NK 細(xì)胞活性測定、DTH 實(shí)驗(yàn)、碳廓清實(shí)驗(yàn)、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 血清溶血素測定和抗體生成細(xì)胞檢測實(shí)驗(yàn) 各組小鼠灌胃至23 d，腹腔注射2%SRBC 懸液0.2 mL進(jìn)行免疫。5 d后，小鼠稱質(zhì)量，摘眼球采血于離心管中，做血清溶血素測定；脫頸處死后取脾臟進(jìn)行抗體生成細(xì)胞檢測，計(jì)數(shù)每1.0×106個(gè)脾細(xì)胞中溶血空斑數(shù)來表示抗體生成水平[12-17]。

血清溶血素測定：離心管靜置約1h后，2000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取血清備用；小鼠血清用SA 緩沖液稀釋200 倍；吸取1 mL稀釋后血清置試管內(nèi)，依次加入10%SRBC（用SA緩沖液配制）0.5 mL，豚鼠血清（用SA緩沖液按1∶8稀釋）1 mL。另設(shè)不加血清的SA緩沖液為對照管。2000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清液1 mL，加都氏試劑3 mL；同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血組，取10% SRBC 0.25 mL，加都氏試劑至4 mL，充分混勻，放置10 min后，于540 nm 處以對照管調(diào)零，分別測定各管吸光度（A）。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按公式（1）計(jì)算。

抗體生成細(xì)胞檢測：將小鼠的脾臟在無菌環(huán)境下取出，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)過200 目的篩網(wǎng)濾過，1000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），采用Hank's 液洗2 遍。表層培養(yǎng)基（1%瓊脂糖）加熱溶解后與等量pH 7.2～7.4 的2 倍濃度Hank's 液混合，分裝于每管0.5 mL，加入脾細(xì)胞懸液25 μL、10%SRBC 50 μL，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在玻片架上，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫育1.5 h，然后將SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)溫育1.5 h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)來表示抗體生成水平。

2.3.2 DTH 實(shí)驗(yàn) 第23 天灌胃后，小鼠腹部被毛，面積約3 cm×3 cm，用1% DNFB 溶液50 μL 均勻涂抹致敏，次日再強(qiáng)化重復(fù)涂抹1 次，5 d 后用1%DNFB 溶液10 μL 均勻涂抹于小鼠右耳兩面[18-19]。最后一次給藥24 h 后，脫頸處死小鼠，用打孔器取下直徑8 mm 左右耳片稱質(zhì)量，并計(jì)算兩耳質(zhì)量差值（mg），按公式（2）計(jì)算耳腫脹度。

2.3.3 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞活性測定 末次給藥后，脫頸處死小鼠，無菌環(huán)境下取脾，將脾撕碎于盛有適量無菌Hank's 液的平皿中，濾過，制成脾細(xì)胞懸液[18,20-22]，分為兩部分做如下實(shí)驗(yàn)。

脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：Hank's液洗滌單細(xì)胞懸液2次，每次1000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），后將細(xì)胞懸浮于1 mL RPMI 1640 完全培養(yǎng)液中，臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下活細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)（細(xì)胞存活率達(dá)95%以上）并調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106個(gè)/mL。取96 孔板，對照孔加入上述細(xì)胞懸液100 μL，刺激孔加入細(xì)胞懸液100 μL 與Con A（終質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1），空白孔加RPMI 1640完全培養(yǎng)液100 μL，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用CCK-8 試劑盒說明書檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率，使用酶標(biāo)儀在450 nm下測A。脾淋巴細(xì)胞增值率用刺激指數(shù)（SI）來表示，按公式（3）計(jì)算。

NK細(xì)胞活性測定：實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞YAC-1傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前將Hank's 液洗3 次，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL（RPMI 1640完全培養(yǎng)液），Hank's液洗滌脾細(xì)胞懸液2 次，每次1000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL；取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL（效靶比50∶1），加入96 孔培養(yǎng)板中，靶細(xì)胞自然釋放孔內(nèi)加入培養(yǎng)液和靶細(xì)胞各100 μL、靶細(xì)胞最大釋放孔內(nèi)加入1%NP-40 和靶細(xì)胞各100 μL，以上各項(xiàng)均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，1500 r·min-1離心5 min（離心半徑為8 cm），每孔吸取上清液100 μL 置于96 孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH 基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，加入1 mol·L-1HCl 30 μL，用酶標(biāo)儀測定490 nm 處A，并計(jì)算NK 細(xì)胞活性，結(jié)果以殺傷率表示，按式（4）計(jì)算。

2.3.4 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 各組小鼠灌胃第23天后，給每只小鼠腹腔注射2%SRBC 0.2 mL進(jìn)行免疫，5 d后脫頸處死小鼠，剪開腹部皮膚暴露腹膜，每只小鼠腹腔注射含5%的胎牛血清的Hank's液4 mL，輕輕按揉腹部，吸取腹腔洗液2 mL 于試管內(nèi)。吸取腹腔洗液0.5 mL 至裝有0.5 mL 的1%雞紅細(xì)胞懸液的離心管，混勻，吸取混合液0.5 mL 至玻片上已晾干的3%瓊脂圈內(nèi)，37 ℃溫育20 min，甲醇固定，4% Giemsa-磷酸緩沖液染色，顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，每張涂片計(jì)數(shù)100 個(gè)巨噬細(xì)胞[18,23]，按公式（5）計(jì)算吞噬率，公式（6）計(jì)算吞噬指數(shù)。

2.3.5 碳廓清實(shí)驗(yàn) 末次給藥1 h 后，稱小鼠體質(zhì)量，以10 mL·kg-1劑量于尾靜脈注入25%印度墨汁，分別于注射后2、10 min從內(nèi)眥靜脈叢取血30 μL并立即加入到3 mL 0.1%Na2CO3溶液中。Na2CO3溶液作為對照，紫外-可見分光光度計(jì)在600 nm 下檢測A[24-25]。采血結(jié)束后，將小鼠脫頸處死，剝離肝臟、脾臟，稱質(zhì)量并分別按式（7）和（8）計(jì)算廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）。

式中，K為碳廓清指數(shù)（未經(jīng)矯正的吞噬指數(shù)）；A1為t1樣品的A；A2為t2樣品的A；t1為注入墨汁后第1次取血時(shí)間；t2為注入墨汁后第2次取血時(shí)間。

2.3.6 淋巴器官/體質(zhì)量比值測定 末次給藥后，脫頸處死小鼠并解剖，取出脾臟、胸腺，準(zhǔn)確稱質(zhì)量[26]，并按公式（9）和（10）計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)（mg·g-1）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2019和SAS 8.2統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入與統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 甘草蜜炙前后對免疫低下小鼠血清溶血素和抗體生成細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與對照組小鼠比較，模型組小鼠HC50和溶血空斑數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，陽性藥組小鼠HC50和溶血空斑數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；生甘草組小鼠HC50顯著升高（P＜0.05），溶血空斑數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；清炒甘草組小鼠HC50顯著升高（P＜0.01），溶血空斑數(shù)顯著升高（P＜0.05）；蜜炙甘草組小鼠HC50顯著升高（P＜0.01），溶血空斑數(shù)顯著升高（P＜0.05），即清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠的HC50和溶血空斑數(shù)均有所升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，生甘草組、清炒甘草組小鼠HC50和溶血空斑數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），生甘草組、蜜炙甘草組小鼠HC50和溶血空斑數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠HC50和溶血空斑數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同炮制方法對免疫低下小鼠HC50及溶血空斑數(shù)的影響（, n=10）

表1 不同炮制方法對免疫低下小鼠HC50及溶血空斑數(shù)的影響（, n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與生甘草組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與清炒甘草組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；表2～6同。

3.2 甘草蜜炙前后對免疫低下小鼠DTH的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，與對照組小鼠比較，模型組小鼠耳腫脹度顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，陽性藥組小鼠耳腫脹度顯著升高（P＜0.01）；生甘草組小鼠耳腫脹度顯著升高（P＜0.05）；清炒甘草組小鼠耳腫脹度顯著升高（P＜0.01）；蜜炙甘草組小鼠耳腫脹度顯著升高（P＜0.01），即生甘草組、清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠的耳腫脹度均有升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，生甘草組、清炒甘草組小鼠耳腫脹度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生甘草組、蜜炙甘草組小鼠耳腫脹度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠耳腫脹度的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 不同炮制方法對免疫低下小鼠DTH的影響（, n=10）mg

表2 不同炮制方法對免疫低下小鼠DTH的影響（, n=10）mg

3.3 甘草蜜炙前后對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率和NK細(xì)胞活性的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，與對照組小鼠比較，模型組小鼠SI、殺傷率均顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，陽性藥組小鼠SI 顯著升高（P＜0.05）、殺傷率顯著升高（P＜0.01）；生甘草組小鼠SI、殺傷率均升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；清炒甘草組小鼠SI 升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，殺傷率顯著升高（P＜0.01）；蜜炙甘草組小鼠SI、殺傷率均顯著升高（P＜0.01）。同時(shí)，生甘草組、清炒甘草組小鼠SI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），殺傷率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；生甘草組、蜜炙甘草組小鼠SI、殺傷率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠SI、殺傷率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 不同炮制方法對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率和NK細(xì)胞活性的影響（, n=10）

表3 不同炮制方法對免疫低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率和NK細(xì)胞活性的影響（, n=10）

3.4 甘草蜜炙前后對免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，與對照組小鼠比較，模型組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，陽性藥組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）；各給藥組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)均顯著升高（P＜0.01），即生甘草組、清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能均有升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，生甘草組、清炒甘草組小鼠吞噬率、吞噬指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生甘草組、蜜炙甘草組小鼠吞噬率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），吞噬指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；清炒甘草組、蜜炙甘草組小鼠吞噬率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，吞噬指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 不同炮制方法對免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（, n=10）

表4 不同炮制方法對免疫低下小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響（, n=10）

3.5 甘草蜜炙前后對免疫低下小鼠碳廓清功能的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，與對照組小鼠比較，模型組小鼠K、α均顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，陽性藥組小鼠K、α均顯著升高（P＜0.05）；生甘草組小鼠K升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，α顯著升高（P＜0.05）；清炒甘草組和蜜炙甘草組小鼠K、α均顯著升高（P＜0.01）。同時(shí)，生甘草組、清炒甘草組小鼠K、α之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；生甘草組、蜜炙甘草組小鼠K、α之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），清炒甘草、蜜炙甘草組小鼠K的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），α之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表5 不同炮制方法對免疫低下小鼠碳廓清功能的影響（, n=10）

表5 不同炮制方法對免疫低下小鼠碳廓清功能的影響（, n=10）

3.6 甘草蜜炙前后對免疫低下小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6，與對照組小鼠比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，陽性藥組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；生甘草組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05），脾臟指數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；清炒甘草組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.01），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；蜜炙甘草組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）。同時(shí)，生、清炒甘草組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生、蜜炙甘草組小鼠胸腺指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，脾臟指數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），清炒、蜜炙甘草組小鼠胸腺指數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），脾臟指數(shù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 不同炮制方法對免疫低下小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響（, n=10）mg·g-1

表6 不同炮制方法對免疫低下小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響（, n=10）mg·g-1

4 討論

脾臟及胸腺是動(dòng)物體中重要的免疫器官，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)可以從整體上評價(jià)小鼠體內(nèi)的免疫功能，反映臟器組織的狀態(tài)和功能[27-28]；單核巨噬細(xì)胞為一種機(jī)體非特異性免疫的重要細(xì)胞，其吞噬能力是可用于判斷機(jī)體非特異性免疫功能，而巨噬細(xì)胞的K反映其吞噬功能[29]；采用SRBC對小鼠進(jìn)行免疫，能夠刺激小鼠B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，測定免疫后的小鼠血清對SRBC 的溶解能力，反映了抗體分泌細(xì)胞分泌抗體的能力，屬于體液免疫應(yīng)答功能[23]；ConA 誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可以評價(jià)T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能[30]；DTH 是抗原誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生的細(xì)胞性免疫應(yīng)答，特異性抗原在抗原提呈細(xì)胞（APC）作用下與致敏T 細(xì)胞再次接觸后，使T 細(xì)胞活化增殖并分化成為效應(yīng)T 細(xì)胞，效應(yīng)T 細(xì)胞進(jìn)一步清除抗原，引起局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[21]。

楊青等[31]通過比較甘草蜜炙前后對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用發(fā)現(xiàn)甘草蜜炙后相比甘草生品能顯著增加小鼠的免疫功能，并分析得出蜜炙后甘草免疫功能增強(qiáng)與甘草經(jīng)蜜炙后成分發(fā)生的改變、新產(chǎn)生的成分及原有成分含量的變化密切相關(guān)。張恒斌等[32]通過甘草生制品與小鼠脾細(xì)胞免疫活性增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘草蜜炙后免疫活性增強(qiáng)且其水提物的免疫活性強(qiáng)于醇提物，并推測甘草免疫活性成分主要為多糖類成分。

本研究通過非特異性免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫進(jìn)一步全面探究甘草蜜炙前后對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響，結(jié)果表明，同等劑量下，生甘草、清炒甘草、蜜炙甘草均能一定程度上提高免疫低下小鼠的免疫功能，且蜜炙甘草組各指標(biāo)均有顯著提升，說明蜜炙甘草免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于生甘草和清炒甘草。根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[33-35]，甘草蜜炙后以甘草苷為代表的二氫黃酮類成分含量總體呈下降趨勢，以甘草酸為代表的三萜類成分含量呈下降趨勢，以異甘草素為代表的查耳酮類成分含量呈上升趨勢，與本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果一致，故推測清炒加熱能使苷類成分的乙?；a(chǎn)物含量增多，苷元含量降低，苷的含量升高；而蜜炙中蜂蜜對苷的乙?；哂幸种谱饔?，蜜炙甘草中甘草苷的含量低于生甘草、清炒甘草；而甘草中以甘草酸為代表的三萜類成分發(fā)生苷鍵斷裂，不斷生成次級苷及苷元，因此蜜炙后甘草中甘草酸含量有所下降，甘草次酸、異甘草素的含量相對升高；另外，甘草中含有多糖類組分，輔料蜂蜜中含有果糖、葡萄糖等成分，甘草蜜炙后糖類含量升高。綜上，甘草蜜炙免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)，與甘草蜜炙后成分含量、結(jié)構(gòu)的改變及新成分的生成等有密切關(guān)聯(lián)，后期將對甘草蜜炙后有效成分的變化進(jìn)行深入探究，為進(jìn)一步闡明甘草蜜炙后免疫調(diào)節(jié)作用增強(qiáng)的炮制機(jī)制提供參考。