王鈞楠，周永峰，崔園園，鞏穎，柏兆方，朱廣偉，華國(guó)棟，張萍*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100039；3.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；4.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東方醫(yī)院，北京 100078；5.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；6.北京中醫(yī)藥大學(xué) 東直門醫(yī)院，北京 100700

甘草來(lái)源于豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根及根莖[1]，是中藥大品種之一，在中藥應(yīng)用中具有十分重要的地位，被譽(yù)為中藥中的“國(guó)老”。甘草質(zhì)量是其臨床療效的保證。感官評(píng)價(jià)是甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)的一種重要方法，主要是根據(jù)藥材的形、色、氣味、斷面等性狀信息來(lái)判斷質(zhì)量的優(yōu)劣，這種質(zhì)量評(píng)價(jià)方法來(lái)源于古代臨床應(yīng)用的總結(jié)，具有直觀簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[2]。但是由于這種傳統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法存在主觀性較強(qiáng)等問(wèn)題，其是否還適用于現(xiàn)代的甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)、能否準(zhǔn)確反映其臨床活性的差異性有待進(jìn)一步探討。

甘草調(diào)和諸藥，在臨床上應(yīng)用廣泛，具有抗炎、保肝、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[3]?，F(xiàn)代研究表明，多種疾病的發(fā)生和發(fā)展都伴隨著炎癥的產(chǎn)生[3-6]，抑制炎癥反應(yīng)是甘草發(fā)揮多種藥效作用的共性特征。因此，抗炎可能是甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。炎癥小體是炎癥反應(yīng)的重要組成部分，與眾多炎癥性疾病及免疫性疾病密切相關(guān)，包括黑素瘤缺乏因子2（AIM2）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（NLRP3）、NLR 家族CARD 結(jié)構(gòu)域包含蛋白4（NLRC4）等[7]。NLRP3 炎癥小體是其中最具有特點(diǎn)的一種，能夠被多種刺激劑（如尼日利亞菌素、三磷酸腺苷等）激活，也因此成為目前國(guó)內(nèi)外研究最廣泛、最深入的一類炎癥小體。激活后的炎癥小體可通過(guò)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1（caspase-1）對(duì)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）及IL-18 前體物質(zhì)進(jìn)行水解，最終產(chǎn)生并釋放活性IL-1β、IL-18 炎癥因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生[8]。

本研究借助現(xiàn)代測(cè)量工具及分析儀器，將甘草的性狀特征定量化，與根據(jù)抗炎生物效價(jià)分級(jí)后的甘草樣品進(jìn)行整合分析，考察各性狀特征與抗炎活性的關(guān)聯(lián)度，旨在考察甘草傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)能否準(zhǔn)確地反映其抗炎活性，以期為甘草感官評(píng)價(jià)的實(shí)際應(yīng)用提供參考，并為其科學(xué)性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器

CM-5型色彩色差儀（日本柯尼卡美能達(dá)公司）；FOX 3000 型電子鼻系統(tǒng)（法國(guó)Alpha MOS 公司）；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）系統(tǒng)、TC10 型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；JJT1300型潔凈工作臺(tái)（北京冠鵬凈化設(shè)備有限公司）；TGL-16M 型臺(tái)式高速離心機(jī)、HERAcell vios 160i 型恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；HW·SY11-K 型電熱恒溫水浴鍋（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；OV200 型臺(tái)式真空冷凍離心濃縮儀（北京吉艾姆科技有限公司）；SN510C 型立式壓力蒸汽滅菌器（重慶雅馬拓科技有限公司）；OZ17581、OZ13247、OZ05171 型微量移液器（德國(guó)Eppendorf 公司）；Promega GloMax 20/20型發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Promega公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)C57BL/6 雌性小鼠2 只（9～11 周齡），購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，本研究經(jīng)中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心審查，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查編號(hào)為IACUC-2020-0037。

1.3 試藥

DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：K0111200）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：K0911200）、乙二胺四乙酸（EDTA，0.5 mol·L-1，批號(hào)：K1905010）、胰蛋白酶（Trypsin）-EDTA消化液（0.25%，批號(hào)：K1207050）均購(gòu)自美國(guó)Macgene公司；opti-MEM培養(yǎng)基（批號(hào)：31985070，美國(guó)Gibco 公司）；巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-csf，批號(hào)：#87394）、MCC950（純度≥98%）均購(gòu)于美國(guó)MedChemExpresss 公司；胎牛血清（FBS，批號(hào)：2037144，以色列Biolnd 公司）；尼日利亞菌素（Nigericin，批號(hào)：HY-100381）、脂多糖（LPS）均購(gòu)自美國(guó)Invivogen 公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：1121E0327，德國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：2018-3，北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay（批號(hào)：0000418489）、Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay（批號(hào)：0000443211）均購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）及Caspase-1 抗體均購(gòu)自美國(guó)Adipogen公司；IL-1β抗體購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG 抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

10 個(gè)批次甘草樣品編號(hào)S1～S10，批號(hào)分別為J180228001、H190077001-3、20032604、H190080001-3、H190074001-3、H190078001-3、C200015001、J170042001、H190075001-3、CA180140001，經(jīng)解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病研究所肖小河研究員鑒定均為烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensisFisch。

2 方法

2.1 供試品的制備

按照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版方法[1]制備甘草提取液，抽濾，精密吸取續(xù)濾液10 mL 分裝于專用離心管中，于臺(tái)式真空冷凍離心濃縮儀中揮干溶劑至恒重，-20 ℃保存，備用。給藥時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用，在離心管中加入opti-MEM 培養(yǎng)基1 mL 復(fù)溶，超聲30 min（250 W，40 kHz）使其溶解至無(wú)明顯固體顆粒，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)后即得。

2.2 甘草抗炎生物效價(jià)的測(cè)定

2.2.1 細(xì)胞的獲取及培養(yǎng) 75%乙醇消毒后，取C57BL/6雌性小鼠后腿骨，將5 mL DMEM培養(yǎng)基用注射器注入骨髓，在裝有20 mL DMEM 培養(yǎng)基的離心管中反復(fù)吹打3 次，吹打過(guò)程中保持后腿骨在培養(yǎng)基液面以下，加入M-csf 5 μL，吹勻，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。3 d 后，補(bǔ)充適量的DMEM 培養(yǎng)基和M-csf，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。然后，將貼壁的小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞（BMDM）用消化液[Trypsin-EDTA∶EDTA（2∶1）]消化1～2 min后，更換DMEM培養(yǎng)基，并制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL的培養(yǎng)基溶液，吸取含細(xì)胞的培養(yǎng)基500 μL于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，于20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。

對(duì)于建筑工程，采用以上介紹的裝配建筑方案無(wú)疑是一個(gè)非常好的選擇。根據(jù)該工程的特點(diǎn)，站內(nèi)全部取消了建筑物，站內(nèi)的35 kV、10 kV配電裝置均采用E-HOUSE集裝箱布置，二次設(shè)備采用預(yù)制式艙，均由廠家成套供應(yīng)。土建施工單位僅需進(jìn)行基礎(chǔ)施工即可。

2.2.2 NLRP3炎癥小體細(xì)胞模型的構(gòu)建 首先，棄去24孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的DMEM培養(yǎng)基，加入含有LPS（50 ng·mL-1）的opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置4 h；然后，設(shè)置空白組、模型組及給藥組，棄去孔板內(nèi)的opti-MEM 培養(yǎng)基，給藥組分別加入生藥質(zhì)量濃度為0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1的甘草提取液，空白組及模型組加入等量opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)與細(xì)胞共培養(yǎng)1 h；最后，模型組及給藥組內(nèi)加入Nigericin（50 μg·mL-1，DMSO）溶液，空白組加入含有等質(zhì)量濃度DMSO 的opti-MEM 培養(yǎng)基，20 ℃下共培養(yǎng)30 min，收集細(xì)胞上清液及裂解液。

2.2.3 關(guān)鍵指標(biāo)的檢測(cè) 通過(guò)蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法對(duì)細(xì)胞上清液中的IL-1β、caspase-1蛋白及裂解液NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、ASC 等蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并應(yīng)用Image J 1.8.0軟件對(duì)目標(biāo)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。取BMDM 上清液及裂解液前處理后，電泳，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜將蛋白條帶轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)過(guò)孵育相應(yīng)的一抗及二抗，顯影，在X光片上顯示蛋白條帶。

通過(guò)Caspase-Glo?1 Inflammasome Assay 檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞上清液中caspase-1 的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）對(duì)細(xì)胞上清液中IL-1β的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，具體操作按照IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.2.4 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

通過(guò)CellTiter-Glo（CTG）發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞存活率。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠BMDM，分別設(shè)置空白孔、對(duì)照孔及梯度濃度給藥孔（生藥質(zhì)量濃度分別為0.312 5、0.625 0、1.250 0、2.500 0 mg·mL-1），孵育6 h后，吸取細(xì)胞上清液50 μL轉(zhuǎn)移至96孔白板中，每孔加入CTG 溶液50 μL，振蕩1 min，測(cè)定各孔發(fā)光強(qiáng)度，并通過(guò)公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2.5 生物效價(jià)的標(biāo)化 IL-1β炎癥因子是NLRP3炎癥小體介導(dǎo)表達(dá)的下游關(guān)鍵蛋白，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，故采用ELISA 測(cè)定法檢測(cè)IL-1β的表達(dá)量，來(lái)表征甘草的生物效價(jià)。

以MCC950 為陽(yáng)性對(duì)照化合物，依據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版（四部）[9]【生物檢定統(tǒng)計(jì)法】項(xiàng)下的“量反應(yīng)平行線法”對(duì)甘草醇提物抑制小鼠BMDM 分泌IL-1β活性的效價(jià)值進(jìn)行標(biāo)化。定義MCC950的生物效價(jià)為1000 U·mg-1，將抑制率和相應(yīng)給藥濃度輸入效價(jià)計(jì)算軟件BioCalculate V2.0 得到各個(gè)批次甘草抑制小鼠BMDM分泌IL-1β的效價(jià)。

2.3 感官參數(shù)的數(shù)據(jù)采集

2.3.1 甘草斷面直徑（2R）的測(cè)量 10 個(gè)批次甘草樣品均為類圓形片，若為類橢圓形片，則以其短直徑作為斷面直徑測(cè)量結(jié)果。為了減小實(shí)驗(yàn)誤差，每批次樣品隨機(jī)取3組，每組100個(gè)飲片作為測(cè)量對(duì)象[10]，記錄2R。

2.3.2 甘草色度的測(cè)定 色度常用的評(píng)價(jià)系統(tǒng)是CIE 1976L*a*b*標(biāo)準(zhǔn)色度系統(tǒng)，其中L*表示明度，a*和b*表示不同的色調(diào)方向。L*值越大明度越大，感覺越白；反之越暗。a*表示紅綠方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向。b*表示黃藍(lán)方向，+b*表示黃方向，-b*表示藍(lán)方向[11]。

采用色彩色差儀對(duì)甘草粉末進(jìn)行色度測(cè)量。取適量甘草粉末加入專用容器中，在容器底部平鋪成3～5 mm 厚度，校準(zhǔn)儀器后，將其放置于測(cè)定凹槽內(nèi)進(jìn)行色度測(cè)量，記錄甘草樣品的L*、a*和b*值。每批次樣品重復(fù)測(cè)定3次，取其色度指標(biāo)的平均值。

2.3.3 甘草氣味的測(cè)定 為了使樣品在利用電子鼻檢測(cè)時(shí)響應(yīng)值達(dá)到最佳狀態(tài)，參考文獻(xiàn)[12-13]方法對(duì)樣品進(jìn)樣量、頂空溫度及頂空時(shí)間進(jìn)行單因素考察。精密稱取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度40 ℃、頂空時(shí)間120 s 條件下，分別考察進(jìn)樣量為500、1000、2000、2500 μL 時(shí)樣品的響應(yīng)值；精密稱取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 頂空瓶中，在頂空時(shí)間120 s，進(jìn)樣量2500 μL條件下，分別考察頂空溫度為40、45、50、55 ℃時(shí)樣品的響應(yīng)值；精密稱取甘草粉末0.2 g，置于10 mL 頂空瓶中，在頂空溫度55 ℃、進(jìn)樣量2500 μL 條件下，分別考察頂空時(shí)間為120、240、360 s 時(shí)樣品的響應(yīng)值。

經(jīng)過(guò)單因素考察，確定電子鼻的檢測(cè)條件為進(jìn)樣量2500 μL、頂空溫度55 ℃及頂空時(shí)間240 s，并采用自動(dòng)頂空進(jìn)樣方式，對(duì)甘草樣品進(jìn)行氣味檢測(cè)。取同一批次甘草樣品（S7）重復(fù)測(cè)定5 次，計(jì)算12個(gè)傳感器的RSD 以考察電子鼻儀器精密度。12 個(gè)傳感 器LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTI、LY2/gCT、T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2 的RSD 分 別 為1.449%、2.933%、2.211%、0.435%、3.278%、1.356%、1.756%、1.133%、1.343%、0.935%、1.641%、1.536%，RSD均小于4%，說(shuō)明儀器精密度良好。以采集時(shí)間為橫坐標(biāo)（X），各傳感器響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y）繪制傳感器響應(yīng)曲線，見圖1。

圖1 電子鼻系統(tǒng)12根傳感器對(duì)甘草氣味的響應(yīng)強(qiáng)度曲線

按單因素考察后實(shí)驗(yàn)條件采集多批次樣品的氣味數(shù)據(jù)，按公式（2）計(jì)算雷達(dá)圖面積（S），用于表征甘草的氣味信息，并以各傳感器最大值繪制雷達(dá)圖，見圖2。

圖2 12根傳感器對(duì)甘草氣味的雷達(dá)圖

式中a、b為兩傳感器響應(yīng)值的點(diǎn)與雷達(dá)圖圓點(diǎn)連線圍成的三角形的兩邊長(zhǎng)，c為兩邊的夾角，均為30°。

2.4 數(shù)據(jù)分析

將采集的甘草樣品感官數(shù)據(jù)及等級(jí)劃分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Simca 14.1軟件中，進(jìn)行主成分分析（PCA），并基于PCA 進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLSDA），以增大組間差異，更好地挖掘與甘草抗炎活性相關(guān)的關(guān)鍵感官參數(shù)。根據(jù)PCA 及OPLS-DA 的得分圖，判斷兩等級(jí)甘草樣品的差異。根據(jù)OPLSDA 的loading 圖及變量重要性投影（VIP）確定兩者間的差異成分，并通過(guò)獨(dú)立t檢驗(yàn)分析兩者差異成分，驗(yàn)證OPLS-DA結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 甘草提取物對(duì)LPS 聯(lián)合Nigericin 誘導(dǎo)的小鼠原代骨髓巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的影響

經(jīng)過(guò)Western blot 法檢測(cè)空白組、模型組及給藥組BMDM 上清液及裂解液中各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)（圖3A），再通過(guò)灰度值分析對(duì)關(guān)鍵蛋白IL-1β，caspase-1及其前體蛋白pro-IL-1β、pro-caspase-1 的條帶進(jìn)行量化（圖3B～E），以判斷甘草提取物是否產(chǎn)生抑制作用。Lamin B 為細(xì)胞裂解液的上樣量對(duì)照，考馬斯藍(lán)（coomassie）染色為上清液的上樣量對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥組細(xì)胞上清液中目的蛋白IL-1β、caspase-1 的灰度值明顯降低，即其表達(dá)量顯著減少，并且隨著給藥濃度的增大，2 種蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，而在裂解液中兩蛋白的前體蛋白pro-IL-1β及pro-caspase-1 的表達(dá)則恰恰相反，說(shuō)明甘草提取物能夠抑制pro-IL-1β及pro-caspase-1 的剪切，從而抑制LPS 聯(lián)合Nigericin誘導(dǎo)的小鼠BMDM 細(xì)胞上清液中IL-1β、caspase-1蛋白的表達(dá)。甘草提取物對(duì)細(xì)胞裂解液中NLRP3、ASC蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響。通過(guò)試劑盒進(jìn)一步檢測(cè)IL-1β的表達(dá)及caspase-1的活性，結(jié)果見圖4A、B，發(fā)現(xiàn)甘草提取物對(duì)IL-1β的表達(dá)有抑制作用，并能夠抑制caspase-1的活性，且在質(zhì)量濃度0.312 5～2.500 0 mg·mL-1呈一定的劑量依賴性；對(duì)甘草提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見圖4 C，甘草提取物在質(zhì)量濃度2.500 0 mg·mL-1時(shí)對(duì)BMDM 無(wú)毒性作用，故選取質(zhì)量濃度0.312 5～2.500 0 mg·mL-1進(jìn)行藥效檢測(cè)。

圖3 甘草提取物對(duì)LPS聯(lián)合Nigericin誘導(dǎo)的小鼠BMDM的NLRP3炎癥小體激活的抑制作用（n=2）

圖4 甘草提取物的細(xì)胞毒性及對(duì)LPS聯(lián)合Nigericin誘導(dǎo)的小鼠BMDM的NLRP3炎癥小體通路關(guān)鍵蛋白caspase-1及IL-1β表達(dá)的影響（, n=3）

3.2 甘草樣品生物效價(jià)的標(biāo)化及分級(jí)

根據(jù)2.2.4 項(xiàng)下方法進(jìn)行生物效價(jià)的標(biāo)化，結(jié)果見表1。根據(jù)生物效價(jià)，將10 個(gè)批次甘草樣品分成2個(gè)等級(jí)，結(jié)果見表2。

表1 S1甘草提取物與MCC950的劑量及對(duì)應(yīng)的IL-1β表達(dá)抑制率

表2 10個(gè)批次甘草樣品的抗炎生物效價(jià)及分級(jí)結(jié)果

3.3 甘草樣品的感官參數(shù)測(cè)定結(jié)果

根據(jù)2.2 項(xiàng)下各感官參數(shù)的測(cè)定方法對(duì)相應(yīng)參數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，結(jié)果見表3。

表3 10批次甘草樣品的斷面直徑、色度值及雷達(dá)圖面積

3.4 PCA及OPLS-DA結(jié)果及驗(yàn)證

PCA 結(jié)果見圖5，將不同等級(jí)的甘草樣品分為兩類，說(shuō)明兩等級(jí)甘草樣品在性狀特征方面存在一定的差異。進(jìn)一步應(yīng)用OPLS-DA 挖掘兩組甘草樣品的內(nèi)在差異（圖6），R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X 和Y 矩陣的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力，理論上R2和Q2越接近1 說(shuō)明模型的擬合準(zhǔn)確性越好。該模型R2X=0.534，R2Y=0.863，Q2=0.75，說(shuō)明模型的擬合能力較好，預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)；loading 圖（圖7）和VIP 分析，loading 圖上距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，VIP 值＞1的參數(shù)對(duì)模型的貢獻(xiàn)度較大，即成為差異性因素的可能性較大，因而b*和2R可能是導(dǎo)致兩組樣品差異的關(guān)鍵參數(shù)。

圖5 甘草樣品PCA得分

圖6 甘草樣品OPLS-DA得分

圖7 甘草樣品OPLS-DA的loading圖

將兩組甘草樣品的b*和2R實(shí)測(cè)值進(jìn)行比較，結(jié)果見圖8，兩者b*的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而2R的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖8 兩等級(jí)甘草樣品的b*及2R的實(shí)測(cè)值比較

4 討論

近年來(lái)，已經(jīng)有研究報(bào)道了甘草中的活性成分對(duì)NLRP3 炎癥小體的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究。Li 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，異甘草素通過(guò)抑制磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-?B（p-NF-?B）、NLRP3 的蛋白質(zhì)的分泌，促進(jìn)caspase-1、IL-1β和消皮素蛋白N 端（GSDMD-N）的裂解，上調(diào)微小核苷酸（miRNA）-27a mRNA 表達(dá)，并降低脾酪氨酸激酶（SYK）的mRNA 和蛋白質(zhì)水平等方式抑制NLRP3 介導(dǎo)的焦亡。付書彬等[15]報(bào)道，甘草查耳酮A 可通過(guò)抑制caspase-1 前體的剪切，阻斷caspase-1 p20 介導(dǎo)的pro-IL-1β的成熟，抑制NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)。Xu 等[16]也發(fā)現(xiàn)了甘草中的活性成分對(duì)NLRP3炎癥小體的抑制作用。目前，甘草提取物對(duì)炎癥小體的作用尚無(wú)人進(jìn)行驗(yàn)證，本研究在前人研究[14-16]的基礎(chǔ)上構(gòu)建了炎癥小體細(xì)胞模型，確定了在體外甘草提取物對(duì)LPS 聯(lián)合Nigericin 誘導(dǎo)的小鼠BMDM的NLRP3炎癥小體激活的抑制作用，并通過(guò)檢測(cè)其下游關(guān)鍵蛋白IL-1β的表達(dá)量建立了不同批次甘草樣品的生物效價(jià)，為甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新的方法。

自古以來(lái)，顏色就在甘草質(zhì)量評(píng)價(jià)中占據(jù)了重要地位?！侗静萁?jīng)集注》記載：“赤皮斷理，……最佳……”[17]，《新編中藥志》記載：“甘草以皮細(xì)緊、色紅棕、斷面黃白色……為佳”[18]?？梢姡诠糯?，甘草以外皮色赤、色紅棕、斷面色黃白者為佳。隨著科技的進(jìn)步，研究者們利用現(xiàn)代儀器對(duì)甘草的顏色進(jìn)行了更深入的研究。曹光昭等[19]將甘草的止咳藥效與其色度值進(jìn)行相關(guān)性分析，初步確定了b*與其止咳藥效的相關(guān)性。本研究通過(guò)現(xiàn)代機(jī)器視覺客觀量化了甘草的性狀參數(shù)，彌補(bǔ)了性狀評(píng)價(jià)方法過(guò)于依賴經(jīng)驗(yàn)的不足之處，大大提高了其客觀性，降低了因評(píng)價(jià)人員不同而導(dǎo)致的質(zhì)量評(píng)價(jià)差異，并且經(jīng)過(guò)進(jìn)一步與其抗炎活性進(jìn)行整合分析，確定了甘草的b*與甘草抗炎活性的相關(guān)性較強(qiáng)。但由于市場(chǎng)上多為烏拉爾甘草，本研究未收集到脹果甘草和光果甘草樣品，并且應(yīng)用樣品量較小，可加大樣品量及其他基原甘草樣品進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。