甘小娜，李廷釗，2，李波，2*

1.安利（中國）研發(fā)中心，上海 201203；2.安利（中國）植物研發(fā)中心，江蘇 無錫 214145

辣木為辣木科辣木屬落葉喬木辣木Moringa oleiferaLam.，起源于印度和非洲，主要分布于世界各地的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。辣木營養(yǎng)特點突出，高纖維、高蛋白（氨基酸）、低脂肪，且富含維生素和礦物質，被稱為“素食黃金”“生命之樹”[3-4]。辣木葉不僅具有較高的營養(yǎng)價值，其藥理作用也備受關注。近年來，化學成分研究發(fā)現(xiàn)辣木葉含有黃酮、酚酸、硫苷、多糖等類化合物[5-9]，具有良好的抗炎、抗菌、抗腫瘤、調血脂、降血糖、免疫調節(jié)等活性[10-14]。辣木于20 世紀60 年代被引進中國，目前在我國臺灣、云南、海南等地均有種植，并于2012 年11月12日被批準為新資源食品。

自由基在體內可氧化糖類和脂質，使蛋白變性、酶失活，從而引發(fā)動脈硬化、高血壓、腫瘤等多種疾病[15]，因此，清除機體多余的自由基對治療相關疾病具有重要作用。目前已有不少文獻從清除自由基、抵抗光氧化損傷、抑制脂質過氧化等方面對辣木的抗氧化活性進行報道[12,16-17]，但大多是從其提取物的角度進行評估，關于單體成分的研究相對較少。在線活性分析系統(tǒng)突破傳統(tǒng)天然成分活性分析的流程，集色譜分離與活性篩選于一體，具有方便快捷的優(yōu)點，已被應用于多種植物的活性成分快速篩選[18]。2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）是一種過氧化氫酶的底物，經(jīng)氧化后生成的自由基溶液對反應體系具有較高的靈敏度，近年來被廣泛應用于抗氧化活性的評估。本研究采用譜效結合的方法，使用超高效液相色譜-ABTS-二極管陣列檢測器-四級桿飛行時間質譜法（UPLC-ABTSPDA-Triple TOF/MS）實現(xiàn)辣木葉中清除自由基活性物質的快速篩選（圖1），為辣木葉活性成分研究及后期更好的開發(fā)利用提供物質基礎。

圖1 辣木葉中清除自由基活性物質在線篩選系統(tǒng)示意圖

1 材料

1.1 儀器

液質聯(lián)用系統(tǒng)：1290 型超高效液相色譜儀（包括自動進樣器、四元泵、柱溫箱和紫外檢測器，安捷倫科技有限公司）串聯(lián)AB Sciex Triple TOF?4600型高分辨質譜（Sciex 公司）；WF-600EHT 型超聲波清洗機（寧波海曙五方超聲設備有限公司）；XS2051/10 型萬分之一電子天平、MS3002S 型電子分析天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）；柱后反應系統(tǒng)（包括溶劑管理器Reagent Manager、溫度控制模塊Temperature Control Module Ⅱ和柱后反應模塊Post Column Reaction Module，Waters公司）。

1.2 試藥

辣木葉購自云南西雙版納，由安利（中國）研發(fā)中心李波博士鑒定為辣木科植物辣木Moringa oleiferaLam.的葉，編號為SHRD-LMY，存放于安利（中國）研發(fā)中心樣品庫；對照品綠原酸（批號：6361，純度≥99.4%）、新綠原酸（批號：3209，純度：99.3%）、隱綠原酸（批號：3208，純度≥98%）、維采寧-2（批號：3922，純度≥99.3%）、蘆丁（批號：5932，純度≥98.5%）、異牡荊素（批號：7449，純度≥99.3%）、牡荊素（批號：3593，純度≥99.9%）、異葒草苷（批號：4044，純度≥99.9%）、異槲皮苷（批號：8029，純度≥99.0%）、紫云英苷（批號：7346，純度≥98.7%）均購于上海詩丹德公司；色譜純甲醇和乙腈均購于德國Merck 公司；分析純乙醇購于General-Reagent 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；色譜純甲酸（美國Honeywell 公司）；對照品水溶性維生素E（Trolox）（批 號：P1656511，純 度≥98.0%）、ABTS、過硫酸鉀[K2(SO4)2]均購于Adamas Reagent公司；超純水采用美國密理博Milli-Q 型超純水機制備。

2 方法

2.1 辣木葉提取物抗氧化活性成分的鑒定

2.1.1 供試品溶液的制備 取辣木葉樣品50 g，加10 倍量超純水浸泡1 h 后水浴回流提取1.5 h，趁熱濾過，殘渣再加8 倍量超純水提取1 h，趁熱濾過，合并2 次濾液，低溫真空濃縮至一定體積，然后進行冷凍干燥，得辣木葉的水提取物（得率為19.4%）。精密稱取辣木葉提取物25 mg，加50%甲醇10 mL，超聲提取10 min，濾過，即得。

2.1.2 ABTS 自由基溶液的制備 ABTS 自由基溶液的制備參考本課題組前期建立的方法[19]，取適量ABTS 和K2(SO4)2進行反應，最終得到在729 nm 波長下吸光度值為0.70±0.02的自由基溶液。

2.1.3 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.1%乙酸水溶液，流動相B為0.1%乙酸乙腈溶液，梯度洗脫（0～18 min，11%～13%B；18～36 min，13%～30%B；36～43 min，30%～70%B；43～52 min，70%～90%B；52～60 min，90%～11%B）；柱溫為30 ℃；檢測波長分別為327、729 nm；流速為0.6 mL·min-1；進樣體積為3 μL。

2.1.4 質譜條件 離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為ESI-模式，一級質譜參數(shù)掃描范圍為m/z50～1800；離子源氣體1 壓力為344.7 kPa；離子源氣體2壓力為344.7 kPa；氣簾氣壓力為241.3 kPa；噴霧電壓為-4500 kV；離子源溫度為500 ℃；去簇電壓為100 V；碰撞能量為10 eV；二級質譜參數(shù)掃描范圍為m/z50～1250；去簇電壓為100 V；碰撞能量為±40 eV。

2.1.5 柱后反應系統(tǒng)條件 反應圈溫度為37.5 ℃；流速為0.3 mL·min-1。

2.1.6 辣木葉中抗氧化活性成分的鑒定 按照圖1進行進樣分析，通過路徑A 得到辣木葉的指紋圖譜及質譜信息，結合文獻和對照品信息對其中的化合物進行結構鑒定；通過路徑B 得到辣木葉中的在線抗氧化圖譜，與指紋圖譜保留時間進行對比，推斷辣木葉中的抗氧化活性成分。

2.2 活性化合物驗證

2.2.1 對照品溶液的配制 精密稱取Trolox對照品粉末適量，加甲醇稀釋成質量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg·mL-1的系列溶液，待用。

2.2.2 化合物單體及提取物的配制 精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁和異槲皮苷對照品適量，分別加甲醇配成0.3 mg·mL-1的溶液；取辣木葉水提物適量，加超純水配成3 mg·mL-1的溶液，超聲提取15 min，濾過，待用。

2.2.3 吸光度的測定 取待測樣品30 μL，加ABTS自由基溶液5 mL，暗處反應15 min，取200 μL轉移至96孔板，于729 nm波長處讀取吸光度。

2.2.4 Trolox 當量抗氧化能力（TEAC）值的計算 ABTS自由基清除活性用TEAC值來評價。以對照品Trolox 的質量濃度為橫坐標（X），以相對吸光度值（即空白溶液的吸光度值與對照品的吸光度值的差值）為縱坐標（Y），得到標準曲線方程；按照公式（1）～（2）計算TEAC值。

式中，b為對照品Trolox 的質量濃度-吸光度標準曲線方程中的截距，k為該方程的斜率，A0為空白溶液的吸光度值，As為待測樣品的吸光度值，C為待測樣品的質量濃度。

2.2.5 清除率的計算 辣木葉中化合物的抗氧化能力以其對自由基的清除率來衡量，按公式（3）計算。

式中，HO為辣木葉中化合物在波長327 nm 下的峰高，HS為其清除ABTS 自由基后于波長729 nm 下形成的負吸收峰峰高。

3 結果

3.1 辣木葉提取物化學成分的鑒定

采用UPLC-Q-TOF/MS，根據(jù)樣品多級質譜信息，結合天然產物高分辨質譜數(shù)據(jù)庫及相關文獻，部分化合物采用對照品進行比對，對辣木葉樣品進行分析，鑒定出21 個化合物（表1、圖2），主要為硫苷、苯丙素和黃酮類等化合物，其中黃酮又包括碳苷黃酮和氧苷黃酮。

圖2 辣木葉提取物的質譜基峰離子色譜圖

表1 辣木葉樣品主要成分鑒定結果

3.2 抗氧化活性成分的確定

供試品溶液經(jīng)路徑B，在柱后衍生系統(tǒng)中與自由基溶液反應后，由PDA 記錄色譜信號，有自由基清除活性的化合物在729 nm 波長下有負吸收峰，見圖3。由圖3可知，化合物新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)具有自由基清除活性。

圖3 辣木葉水提物UPLC圖和在線抗氧化圖譜

3.3 清除率的計算

計算得到辣木葉中各主要活性化合物對自由基的清除能力，見圖4。3 個苯丙素類化合物新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸的清除率分別2.00、2.03、1.90，3個黃酮類化合物蘆丁、異槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷) 的清除率分別為2.97、2.89、2.98。

圖4 辣木葉中各主要活性化合物的自由基清除率（,n=3）

3.4 活性化合物的驗證

以對照品Trolox 的質量濃度為橫坐標，以相對吸光度值為縱坐標，得到標準曲線方程為Y=0.365 4X-0.004 9(r=0.999 8）。以公式（2）計算各待測樣品的TEAC值，結果見圖5。

圖5 辣木葉提取物及各化合物樣品的TEAC值（,n=3）

4 討論

本研究通過UPLC-Q-TOF/MS 從辣木葉中共鑒定出化合物21個，其中包括黃酮類化合物13個（黃酮氧苷9 個、黃酮碳苷4 個）、苯丙素類化合物4 個、硫苷類化合物4 個。運用在線抗氧化活性成分快速分析方法鑒定了6 個主要的抗氧化活性成分，其中包括3 個苯丙素類化合物（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸）和3 個黃酮類化合物[蘆丁、異槲皮苷和槲皮素3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)]。在以ABTS 自由基作為抗氧化篩選試劑時，硫苷類化合物和碳苷黃酮抗氧化活性較低，可能是這類化合物的酚羥基數(shù)目、立體結構和電性因素不利其發(fā)揮清除ABTS 自由基的作用[27]；而苯丙素類化合物和以槲皮素為苷元的黃酮類化合物均表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，這可能與化合物的結構及酚羥基數(shù)目有關。

本研究參考文獻[28]對活性化合物的自由基清除率進行了計算，結果發(fā)現(xiàn)同類型化合物之間自由基清除率差異不大；在不同類型化合物之間，由于最大吸收波長差異較大，使其在相同質量濃度同一波長下的正峰高呈現(xiàn)較大差異，因此用該方法對不同結構類型化合物的自由基清除活性進行比較可能不太準確；繼而本研究采用線下活性評價方法對各化合物的ABTS 自由基清除活性進行驗證比較，研究結果顯示其抗氧化活性為異槲皮苷＞蘆?。綯rolox＞新綠原酸＞綠原酸＞隱綠原酸。本研究為辣木葉天然產物中抗氧化活性成分的研究提供了物質基礎。