曹桑博，王 敏，謝 鵬

1.唐山市協和醫(yī)院藥劑科，唐山 063000；2.唐山職業(yè)技術學院，唐山 063000

非洛地平（FLD）是一種二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，臨床用于治療高血壓，該藥具有血管選擇性高、可顯著提高腎臟血液灌注率、能有效減少對靶器官損傷的優(yōu)勢［1］。但FLD 屬于生物制藥分類系統(tǒng)（BCS）Ⅱ類藥物［2］，其水溶性極差（＜0.5μg·m L－1）以及嚴重的肝臟首過效應，口服生物利用度僅為15%左右［3］，臨床應用受到很大限制。納米脂質載體（NLCs）具有顯著增加難溶性藥物溶解度、提高口服生物利用度的優(yōu)勢，是一種很有前景的口服給藥系統(tǒng)［4］。本研究將FLD 制備成納米結構脂質載體（FLD-NLCs），并通過大鼠體內藥動學以及藥效學實驗評價其吸收效果。

1 儀器與材料

1.1 儀器

K2025高效液相色譜儀（山東海能科學儀器有限公司）；DF-101Q 系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；ETS-2高速勻漿機（常州億通分析儀器制造有限公司）；NanoDeBEE 實驗型微射流均質機（美國BEE公司）；Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀（英國Malvern公司）；JEM-F200場發(fā)射透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 試藥

非洛地平（合肥立方制藥股份有限公司）；山崳酸甘油酯（Compritol 888 ATO）和聚乙二醇-15羥基硬脂酸酯（Solutol HS 15）均由嘉法獅上海貿易有限公司惠贈；泊洛沙姆188（Poloxamer 188）由巴斯夫有限公司惠贈；磷鎢酸和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）均購自阿拉丁試劑有限公司；改良Eagle’s培養(yǎng)基（杭州銘特生物科技有限公司）；漢克平衡鹽溶液（HBSS，武漢普諾賽生命科技有限公司）；p H1.2 鹽 酸 溶液、p H4.5 醋酸鹽 緩 沖 液和p H 6.8磷酸鹽緩沖溶液（PBS）均為實驗室自制；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 FLD-NLCs的制備

FLD-NLCs使用高壓均質技術制備［5］。分別稱取Compritol 888 ATO（固體脂質）6.7 g和Solutol HS 15（液體脂質）3.3 g，置于燒杯中，水浴加熱至80℃～85℃形成油溶液；再稱取FLD 0.4 g溶解到二氯甲烷溶液5 m L中，待藥物完全溶解后加入到上述油溶液中，在80℃～85℃揮干二氯甲烷，形成藥物油溶液，備用；另稱取Poloxamer 188（表面活性劑）4 g加入到純化水（80℃～85℃）100 m L 中，攪拌溶解，形成水溶液，備用；保持水浴溫度在80℃～85℃范圍內，將表面活性劑溶液加入到藥物油溶液中，以15 000 r·min－1高速剪切5 min預處理，再將該溶液通過高壓均質機處理，均質壓力為600 MPa，均質6次，最終得到FLD-NLCs，于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 FLD-NLCs質量評價

2.2.1 粒徑分布、Zeta 電位測定 使用Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀測定FLDNLCs的粒徑分布和Zeta電位，用移液槍移取FLDNLCs 100μL至樣品池中，再加入去離子水2.5 m L稀釋，搖勻，在25℃測定粒徑分布和Zeta電位，每組樣品重復測定3次，取平均值。經測定，平均粒徑為（126.8±3.3）nm，多聚分散系數（PDI）為（0.184±0.005），Zeta電位為（－26.3±0.6）m V。

2.2.2 透射電子顯微鏡（TEM） 取經去離子水稀釋50倍的FLD-NLCs樣品滴加到formvar涂層的銅網格表面，均勻鋪展，再向其滴加質量濃度為10 mg·m L－1的磷鎢酸溶液，復染色10 min，室溫下風干，在透射電子顯微鏡（加速電壓為150 k V）下觀察FLD-NLCs的微觀形態(tài)，結果見圖1。由圖1 可知，FLD-NLCs為球形，形狀規(guī)則，表面光滑，其粒徑在50～150 nm 范圍內，在視野內未觀察到有粒子聚集以及藥物顆粒。

圖1 FLD-NLCs的透射電鏡照片Fig.1 Transmission electron micrograph of FLD-NLCs

2.3 環(huán)境p H／稀釋穩(wěn)定性

FLD-NLCs經口服進入胃腸后，由于環(huán)境p H 值的改變可能會對其穩(wěn)定性產生一定的影響，進而影響藥物吸收［6］，因此，需要考察FLD-NLCs在不同p H環(huán)境中的穩(wěn)定性。取FLD-NLCs分別使用p H 1.2鹽酸溶液（0.1 mol·L－1）、p H 4.5 醋酸鹽緩沖液、p H 6.8 PBS稀釋50倍，定時取樣觀察外觀并測定粒徑，結果見表1。結果顯示，FLD-NLCs經不同p H介質溶液稀釋后放置9 h，其外觀均為透明狀、略帶乳光溶液，未發(fā)現有藥物沉淀析出，粒徑也未發(fā)生顯著變化，說明不同p H 溶液不會對FLD-NLCs的結構產生破壞作用，可推測FLD-NLCs在胃腸道內能夠穩(wěn)定存在。

表1 FLD-NLCs稀釋穩(wěn)定性結果（±s，n＝3）Tab.1 Dilution stability results of FLD-NLCs（±s，n＝3）

表1 FLD-NLCs稀釋穩(wěn)定性結果（±s，n＝3）Tab.1 Dilution stability results of FLD-NLCs（±s，n＝3）

介質 粒徑分布／nm初始3 h 6 h 9 h p H 1.2鹽酸溶液122.8±2.4 124.2±2.3 125.1±3.3 125.3±3.6 p H 4.5醋酸鹽緩沖液 122.8±2.4 122.2±2.7 124.6±2.1 128.1±3.3 p H 6.8 PBS 122.8±2.4 120.3±3.1 124.8±3.2 123.4±2.7

2.4 體外藥物釋放研究

使用透析法考察FLD-NLCs分別在p H 1.2鹽酸溶液（0.1 mol·L－1）、p H 4.5醋酸鹽緩沖液、p H 6.8 PBS介質中的藥物體外釋放情況。取3份FLDNLCs，各5 m L，分別置于透析袋（截留相對分子質量為12～14 k Da）中并系緊，放入對應的3種p H 值介質溶液（體積均為245 mL）中，水浴加熱至37℃±0.5℃并保持恒溫，磁力攪拌速度設置為100 r·min－1，分別在實驗開始后的0.5、1、2、4、6、12、24 h取出釋放介質5 m L（同時補加相應p H 值介質溶液），并經過濾和稀釋，檢測藥物含量，計算藥物釋放度，見表2。結果顯示，FLD-NLCs在p H 1.2鹽酸溶液、p H 4.5醋酸鹽緩沖液和p H 6.8 PBS介質溶液中的相同時間點藥物釋放度相似，均表現為雙相釋放模式［7］，即前2 h藥物表現為突釋模式，接下來藥物呈現持續(xù)的緩釋模式；釋藥數據經零級、一級、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型擬合［8］，采用相關系數R2值接近1的模型來推測藥物釋放機制，結果見表3。擬合結果顯示，釋藥曲線最適合Higuchi模型，說明藥物釋放機制為擴散和溶蝕雙重控制［9］。

表2 FLD-NLCs在不同p H 值介質溶液中的體外藥物釋放度（±s，n＝6）Tab.2 In vitro dissolution of FLD-NLCs in p H1.2，p H4.5 and p H6.8 media（±s，n＝6）

表2 FLD-NLCs在不同p H 值介質溶液中的體外藥物釋放度（±s，n＝6）Tab.2 In vitro dissolution of FLD-NLCs in p H1.2，p H4.5 and p H6.8 media（±s，n＝6）

t／h累積釋放度p H 1.2鹽酸溶液p H4.5醋酸鹽緩沖液p H6.8 PBS 0.5 11.9%±2.7% 10.1%±2.9% 9.3%±3.5%1 26.6%±3.1% 25.3%±1.7% 27.2%±2.7%2 34.8%±3.5% 34.8%±3.6% 37.5%±3.1%4 39.3%±2.9% 39.9%±2.4% 42.4%±2.2%6 44.1%±1.7% 43.3%±3.3% 45.7%±1.6%12 62.3%±2.8% 58.4%±4.1% 63.4%±3.6%24 88.9%±3.0% 85.8%±3.6% 88.9%±2.7%

表3 不同釋藥模型擬合結果Tab.3 Fitting results of different release models

2.5 細胞轉運實驗

2.5.1 人克隆結腸腺癌細胞（Caco-2 細胞）毒性評價 通過四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）評估空白NLCs和FLD-NLCs與Caco-2細胞的相容性［10］。將處于對數生長期的Caco-2 細胞按照細胞密度為1.0×105個·m L－1接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加入Caco-2 細胞液100μL，再加入改良Eagle’s培養(yǎng)基（培養(yǎng)基含有100 mg·m L－1滅活胎牛血清和10 mg·m L－1青霉素／鏈霉素）100μL，并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中在37℃培養(yǎng)24 h，向96孔培養(yǎng)板中分別加入空白NLCs和FLD-NLCs，脂質質量濃度分別為5、10、20、50、100、200 mg·m L－1，并選擇純化水作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，每孔加入質量濃度為0.5 mg·m L－1MTT 各100μL，培養(yǎng)4 h，每孔再加入二甲基亞砜（DMSO）各150μL溶解甲臜沉淀，使用酶標儀在570 nm 處測定各孔的吸光度值A，并計算細胞存活率，每組實驗重復進行3次，結果見表4。

表4 空白NLCs和FLD-NLCs對Caco-2細胞的毒性（±s，n＝3）Tab.4 Cytotoxicity of blank NLCs and FLD-NLCs to Caco-2 cells（±s，n＝3）

表4 空白NLCs和FLD-NLCs對Caco-2細胞的毒性（±s，n＝3）Tab.4 Cytotoxicity of blank NLCs and FLD-NLCs to Caco-2 cells（±s，n＝3）

脂質質量濃度／（mg·m L－1）細胞存活率空白NLCs FLD-NLCs 5 98.6%±1.5% 98.1%±1.3%10 98.2%±1.7% 97.4%±0.7%20 97.4%±0.7% 96.6%±0.8%50 96.8%±1.2% 95.8%±0.7%100 94.1%±0.9% 93.7%±1.0%200 93.7%±1.1% 92.5%±1.1%

結果顯示，在考察的脂質質量濃度范圍內，空白NLCs組和FLD-NLCs組的Caco-2細胞活性均高于90%，表明在此質量濃度范圍內空白NLCs和FLDNLCs具有良好的生物相容性［11］。

2.5.2 轉運實驗研究 將生長狀態(tài)良好的密度為1.0×105個·m L－1的Caco-2細胞接種于Transwell 24孔微孔濾膜培養(yǎng)板上，加入培養(yǎng)基并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中在37℃條件下培養(yǎng)，每隔48 h更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)21 d后去除培養(yǎng)基，使用漢克平衡鹽溶液（HBSS）清洗2次，測量熒光黃的跨膜滲透率為3.57×10－7cm·s－1，小于通透性實驗規(guī)定值（0.5×10－6cm·s－1），說明Caco-2細胞已經形成了完整和緊密的單細胞層，可用于轉運實驗研究［12］?？疾焖幬飶腃aco-2細胞頂端（AP）至基底外側（BL）的轉運實驗如下：在AP 面加入含有FLD 原料藥或FLD-NLCs（藥物質量濃度均為100μg·m L－1）的HBSS溶液，各0.5 m L，作為供給池，在BL 面加入HBSS 溶液1.5 m L，作為接收池；頂端（AP）至基底外側（BL）的轉運實驗如下：在BL 面加入含有FLD 原料藥或FLD-NLCs（藥物質量濃度均為100μg·m L－1）的HBSS溶液，各0.5 m L，作為供給池，在AP 面加入HBSS溶液1.5 m L，作為接收池。孵育4 h后從接收池中吸取藥液0.2 m L，檢測藥物含量，按照公式計算表觀滲透系數（Papp），結果見表5。

表5 FLD原料藥和FLD-NLCs在Caco-2細胞單層中的滲透性（±s，n＝3）Tab.5 Apparent permeability coefficients of FLD and FLDNLCs in Caco-2 cells monolayer（±s，n＝3）

表5 FLD原料藥和FLD-NLCs在Caco-2細胞單層中的滲透性（±s，n＝3）Tab.5 Apparent permeability coefficients of FLD and FLDNLCs in Caco-2 cells monolayer（±s，n＝3）

項目 P app／（×10－6 cm·S－1）P app（AP→BL） P app（BL→AP）FLD 原料藥4.37±0.32 6.78±0.41 FLD-NLCs 13.64±0.52 5.83±0.38

Papp＝dQ／dt×1／A×1／C0。其中dQ／dt表示轉運速率（μg·s－1），A表示微孔濾膜的表面積（cm2），C0表 示 頂 端 初 始 藥 物 質 量 濃 度（μg·m L－1）。Papp（AP-BL）表示FLD 從AP面至BL面的表觀滲透率，Papp（BL-AP）表示FLD 從BL面至AP面的表觀滲透率。

結果顯示，將FLD 制備成FLD-NLCs 后，其Papp（AP→BL）值由原料藥組中的（4.37±0.32）×10－6cm·s－1升高為FLD-NLCs組的（13.64±0.52）×10－6cm·s－1，滲透性顯著提高，說明FLD-NLCs能促進Caco-2細胞對藥物的轉運吸收［13］。

2.6 藥動學研究

2.6.1 血樣處理及檢測 取大鼠血清100μL，加入飽和碳酸鈉溶液50 μL，渦旋2 min，加入乙醚500μL，渦旋5 min，樣品溶液以5 000 r·min－1離心10 min，收集上層乙酸乙酯溶液，并在氮氣環(huán)境中揮發(fā)，殘留物用流動相100μL復溶，以10 000 r·min－1離心10 min，取上清液20μL，按照以下色譜條件檢測FLD 含量［14］：色譜柱為Agilent ODS C18（250 mm×4.6 mm），流動相 為乙 腈-水（65∶35），流 速 為1.0 m L·min－1，檢測波長為254 nm，柱溫為30℃。HPLC方法學驗證了線性、方法精密度、日內／日間精密度、提取回收率、檢測限和定量限，均符合生物樣品檢測的質量要求。

2.6.2 動物實驗 選擇體質量為200～250 g 的Wistar大鼠，雌雄各半，每組6只，實驗前12 h禁食，可自由飲水。2 組大鼠分別口服給予FLD 混懸劑（分散介質為5 mg·m L－1羧甲基纖維素鈉溶液）和FLD-NLCs，給藥劑量均為20 mg·kg－1，在給藥后的第0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h通過眼眶后靜脈叢穿刺取血，采用EP管收集約2～3 m L 血樣，并以5 000 r·min－1離心10 min，上層血漿轉移至另一個EP管中，并儲存在－20℃冰箱中直至用于分析檢測。使用DAS2.0藥動學軟件以單室模型擬合FLD混懸劑和FLD-NLCs在大鼠體內的血藥達峰時間（tmax）、血藥達峰質量濃度（Cmax）和藥時曲線下面積（AUC（0～∞））等藥動學參數，結果見表6。

表6 大鼠口服給予FLD混懸劑和FLD-NLCs的藥動學參數（±s，n＝6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters in rats after oral administration of FLD suspensions and FLD-NLCs（±s，n＝6）

表6 大鼠口服給予FLD混懸劑和FLD-NLCs的藥動學參數（±s，n＝6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters in rats after oral administration of FLD suspensions and FLD-NLCs（±s，n＝6）

注：－表示無此項數據；FLD-NLCs與FLD 混懸劑比較差異具有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05）。

藥動學參數 FLD 混懸劑FLD-NLCs t max／h 1.76±0.52 3.52±0.79*C max／（ng·m L－1） 774.20±104.6 1 445.70±146.2*AUC（0～∞）／（ng·m L－1·h－1）3 674.50±493.5 8 256.20±1059.4*相對生物利用度（F）／%－225

結果表明，口服給予FLD-NLCs的大鼠，與FLD混懸劑組比較，其tmax有所延后，Cmax和AUC（0～∞）較FLD 混懸劑組顯著提高，半衰期（t1／2）也明顯延長，口服生物利用度提高了2.25倍。

2.7 藥效學研究

選擇Wistar大鼠，雌雄各半，體質量為200～250 g，喂食果糖溶液（質量濃度為250 mg·m L－1）誘發(fā)高血壓，2 周后，選擇最小平均收縮壓為140～145 mm Hg的大鼠作為高血壓模型［15］。將Wistar大鼠分為A、B、C和D 4個組進行實驗，每組6只，A 組大鼠（正常血壓）為非治療組陰性對照，B 組大鼠（高血壓）為非治療組陽性對照，C 組大鼠（高血壓）為口服FLD 混懸劑組，D 組大鼠（高血壓）為口服FLDNLCs組，給藥劑量均為20 mg·kg－1，實驗期間恢復正常飲食和飲水，使用尾套法［16］在不同的時間間隔（0、1、2、4、6、12、24、36、48 h）測定大鼠血壓，結果見表7。

表7 大鼠口服FLD混懸劑和FLD-NLCs的抗高血壓效果比較（±s，n＝6）Tab.7 The antihypertensive effect of FLD suspensions and FLD-NLCs after oral administration（±s，n＝6）

表7 大鼠口服FLD混懸劑和FLD-NLCs的抗高血壓效果比較（±s，n＝6）Tab.7 The antihypertensive effect of FLD suspensions and FLD-NLCs after oral administration（±s，n＝6）

t／h 血壓／mm Hg A 組 B組 C組 D組初始94.6±3.4 148.4±2.9 148.9±2.5 148.7±2.1 1 93.1±1.1 149.1±3.1 124.1±2.6 134.3±3.2 2 92.6±3.8 148.6±2.8 98.3±3.1 116.2±1.9 4 93.4±2.6 147.9±3.3 119.6±2.0 98.1±2.4 6 94.1±3.1 146.3±3.7 132.8±1.8 94.3±1.6 12 93.8±3.9 146.7±2.4 141.7±2.9 93.6±3.3 24 92.7±2.5 145.3±3.2 141.3±1.6 96.7±2.6 36 94.6±2.2 144.6±2.5 140.4±2.5 113.5±1.4 48 93.5±3.0 143.6±2.3 139.6±1.9 126.1±2.8

大鼠藥效學研究結果顯示，非治療組（A 組）的大鼠在實驗期間血壓非常平穩(wěn)，說明正常飲食不會對大鼠血壓產生波動；而非治療組中的高血壓模型大鼠（B組）恢復正常飲食后在實驗期間收縮壓出現微弱降低趨勢，但依然很高；口服FLD 混懸劑的高血壓大鼠（C組）在給藥后2 h血壓迅速降低，但隨后血壓逐漸升高，在第6 h后血壓基本恢復至治療前水平，血壓波動較大，降血壓時間較短；相比之下，口服FLDNLCs的高血壓大鼠（D 組）在給藥后血壓逐漸降低，第6 h達到最大治療效果，并一直持續(xù)到第24 h，說明FLD-NLCs能夠明顯延長降血壓時間。

3 討論

非洛地平由于存在溶解度低、吸收性差、代謝快等諸多不利因素，導致口服生物利用度低，血藥濃度波動較大，療效不確切。而近年來新型納米給藥系統(tǒng)（如：膠束、脂質體、微乳、納米混懸劑以及聚合物納米粒）在增加難溶性藥物口服生物利用度方面得到了廣泛應用，然而這些給藥系統(tǒng)存在物理穩(wěn)定性較差、易聚集、儲存時藥物泄漏、難以擴大生產等缺點。以脂質作為載體的納米給藥系統(tǒng)，可以增加藥物溶解性，促進藥物吸收，對提高難溶性藥物的溶解度和生物利用度存在明顯優(yōu)勢。因此，本研究以Compritol 888 ATO 和Solutol HS 15作為脂質載體將非洛地平制備成納米脂質載體。實驗結果顯示，制備的FLDNLCs粒徑為（126.8±3.3）nm，PDI為（0.184±0.005），Zeta電位為（－26.3±0.6）m V，在p H1.2、p H4.5和p H6.8 3種釋放介質中均表現為雙相釋放模式，FLD-NLCs提高了藥物的滲透性，并顯著改善了藥物的口服生物利用度以及降血壓效果，這歸因于FLD-NLCs能夠有效透過腸上皮細胞膜，降低了藥物外排作用，提高了藥物的生物利用度。